relatório de aula pratica biologia molecular

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RELATORIO DE BIO MOLECULAR
EXTRAÇÃO DNA DA CEBOLA
1 – Procedimentos:
Previamente preparou-se a solução de extração que foi utilizada no processo de extração do DNA, em um recipiente despejou-se 40 mL de água, 10 mL de detergente neutro e meia colher de sal de cozinha (Na Cl), com auxilio de uma bagueta a solução foi agitada até sua total homogeneização
Iniciou-se a etapa de extração ralando meia cebola média com o auxilio de um ralador de aço, em seguida o material foi posto em béquer de 250 Ml, o qual continha 50 mL da solução de extração previamente preparada, mexeu-se com vigor a solução com a cebola ralada. O béquer contendo a solução foi posto em banho maria a 70 ºC por aproximadamente 20 minutos.
Passados 20 minutos retirou-se a solução do banho-maria, estando está ainda aquecida, realizou-se a filtração da mesma com o auxílio de um funil e um béquer de 250 mL. Após o termino do processo obteve-se no béquer apenas o liquido filtrado.
Na sequência colocou-se o béquer com o filtrado em um banho de gelo, ou seja, sobre um recipiente contendo gelo, o qual permaneceu por 5 minutos, até que esfriasse.
Com a solução da cebola ralada já fria retirou-se o béquer e transferiu-se para uma proveta graduada de 100 mL, onde obteve-se o volume aproximado de 27 ml de filtrado, em seguida com a proveta inclinada a um ângulo de 30º graus iniciou-se o despejo lentamente de 30 ml de etanol gelado, essa adição ocorreu lentamente para que promovesse o aumento da eficiência da precipitação do DNA. 
Obtendo-se duas fases onde na interface entre as fases, observou-se um precipitado branco, molécula de DNA, semelhante a fios de algodão.
Logo após realizou-se a coleta desse material com auxílio da bagueta de vidro, para realização em outros procedimentos, transferindo-os para microtubos. 
Repetiu-se o procedimento anterior para obtenção de uma duplicata, depois os tubos foram fechados e dispostos de forma balanceada na centrifuga, o processo de centrifugação ocorreu por 2 minutos para que o DNA decantasse.
Após a centrifugação descartou-se o sobrenadante, liberando todo o etanol utilizado no processo de precipitação, e realizou-se a ressuspensão do DNA em água, para isso coletou-se 200 microlitros de água com a pipeta que foram então despejados no microtubo. 
Por fim obteve-se o DNA extraído da cebola que poderá ser utilizado em outros procedimentos.
2 - Conhecimentos Adquiridos:
Durante o processo de extração do DNA pode-se verificar que os procedimentos realizados em cada etapa tinham propósitos e funções específicos, este processo já se iniciou quando a cebola foi ralada, neste caso ocorreu um tipo de maceração onde houve o rompimento da parede celular, estrutura espessa e rígida que envolve e protege as células vegetais, além disso ocorre a dissociação dos tecidos que facilitara a ação da solução de extração.
Na etapa do uso da solução de extração viu-se que cada um dos reagentes utilizados tem uma finalidade, no caso do detergente é desestabilizar as membranas biológicas para que o DNA seja liberado, ou seja, dissolve a bicamada lipídica que compõem a membrana plasmática e nuclear, ocorre a ruptura das mesmas e todo o material celular fica disperso na solução, o sal de cozinha (NaCl) gera um ambiente propício para que ocorra a extração do DNA, ao se dissociar na água o sal libera íons positivos que vão neutralizar a carga negativa dos grupos fosfato da molécula de DNA, dessa forma as moléculas não irão sofrer repulsão de cargas entre si e isso ira promover a sua aglomeração.
A utilização da técnica do banho-maria proporciona o aumento da temperatura da solução ocasionando uma agitação maior das moléculas, visa assim o desarranjo dos fosfolipídios das membranas, o que facilita a ação do detergente na desestruturação das membranas plasmáticas. A alta temperatura também ajuda na inativação das enzimas que podem via a degradar o DNA
Quando a solução do filtrado tem sua temperatura diminuída pela ação do banho de gelo o DNA se torna mais insolúvel e facilita o processo de precipitação, o mesmo ocorre quando se faz a adição lenta de álcool gelado, como o DNA não é solúvel em álcool etílico, este promove o agrupamento dos filamentos, tornando-os mais visíveis e aumentando a eficiência da precipitação do filtrado. Na adição do álcool quanto mais gelado ele estiver menos solúvel estará o DNA. Sabe-se também que o DNA tem densidade menor que os demais componentes celulares sendo assim ele fica concentrado na porção superior do extrato
Na etapa final verificou-se há obtenção de duas fases, onde na interface entre as fases observou-se um precipitado branco, molécula de DNA, semelhante a fios de algodão. Após a centrifugação houve a formação final de um precipitado corresponde a molécula de DNA que foi extraída.
AULA 2 – MICROPIPETADORES
1 – Procedimentos
Para a realização desta aula pratica o laboratório disponibilizou 4 modelos diferentes de micropipetas, conforme identificação descrita abaixo, o professor orientador demonstrou o uso correta das mesmas e o funcionamento dos mecanismos de ajuste do volume, sucção e descarte.
TABELA 1
	Identificação da Pipeta
	Intervalo de volume
	P10
	0,5 - 10
	P20
	2 – 20
	P100
	10 - 100
	P1000
	100 - 1000
Observou-se que a faixa de volume (máx. – min.) fica descrita no corpo da mesma próxima ao display, através desta informação completou-se a tabela solicitada na atividade 1.
Na atividade 2, escolheu-se a micropipeta correta, entre as disponibilizadas, volumes solicitados a serem coletados, então realizou-se o preenchimento dos dados conforme abaixo.
	Volume
	Pipeta utilizada 
	1, 5 µL
	P10
	12 µL
	P20
	576 µL
	P1000
	0,0001 mL
	P10
	0,02 Ml
	P20
	1000 µL
	P1000
	200 µL
	P1000
	1Ml
	P1000
	0,5 mL
	P1000
	1,2 µL
	P10
Na sequência, para a atividade 3, realizou-se as etapas da micropipetagem dos volumes listados no exercício 2, inicialmente foram escolhidas as ponteiras corretas de acordo com a faixa de volume comportada por cada equipamento, então girando a parte superior da pipeta selecionou-se os volumes exatos que seriam coletados e segurando-a na posição vertical com auxilio alça, apertou-se o botão até o primeiro estágio mergulhando a ponteira no líquido e aspire-o, soltando o botão em seguida. 
Removeu-se a pipeta do líquido e levou-a para o béquer de descarte, então apertou-se o botão até o segundo estágio, garantindo a dispensação de todo o conteúdo.
Estes procedimentos foram reproduzidos em todas as coletas, em alguns casos fez-se necessário o calculo de conversão de ml para µL.
Para a atividade 4 utilizou-se as micropipetas de volume entre 0,5-10 µL (P10) e 2 – 20 µL (P20) para a coleta e transferência das 4 soluções aquosas nos tubos de eppendorf, identificados previamente pelas letras A, B e C.
	Tubo
	Solução 01
	Solução 02
	Solução 3
	Solução 4
	A
	10 µL
	5 µL
	4 µL
	1 µL
	B
	10 µL
	3 µL
	-
	7 µL
	C
	10 µL
	-
	2 µL
	8 µL
Adicionou-se um total de 20 µL em cada tubo conforme estipulado acima, após verificou-se a precisão das pipetagens feitas em cada tubo usando a micropipeta P20 ajustada para coleta de 20 µL, assim o conteúdo dos três tubos foram succionados para conferencia do volume.
Na atividade 5 utilizou-se a micropipeta P1000 que possui a faixa de coleta entre 100-1000 µL, primeiramente identificou-se os três tubos de eppendorf pelas letras D, E e F, em cada tubo foram pipetados os volumes conforme abaixo.
	Tubo
	Solução 01
	Solução 02
	Solução 3
	D
	10O µL
	400 µL
	500 µL
	E
	150 µL
	250 µL
	600 µL
	F
	200 µL
	350 µL
	450 µL
Em cada tubo adicionou-se um total de 1000 µL, realizou-se a verificação dos volumes utilizando a micropipeta P1000 ajustada para o volume máximo 1000 µL, os volumes dos três tubos foram succionados e dispensados posteriormente.
Como os dados obtidos em todos os exercícios foram precisos não houve necessidade de repetição das atividades acima.
2 – ConhecimentosAdquiridos
As micropipetas são instrumentos de alta precisão utilizados para a medida extada e transferência de volumes líquidos, muitos são os fatores que podem interferir na exatidão das medidas na pipetagem, pode-se citar a qualidade do equipamento, o conhecimento técnico sobre o mesmo e o manuseio do operador. Em certos procedimentos é extremamente importante a manipulação cuidadosa de líquidos e amostras a fim de zelar pela qualidade, por vezes uma pequena e única gota de um reagente pode comprometer o resultado final, ou até mesmo a presença de bolhas durante a sucção do volume.
Esse tipo de equipamento exige manutenção preventiva incluindo a limpeza adequada e calibração periódica, caso contrario podem apresentar inexatidão ou imprecisão nos resultados. 
Durante a manipulação da micropipeta é fundamental manter a posição vertical de modo que o material a ser coleta não alcance e adentre os componentes internos do equipamento e não se cristalize, o que confere mau uso e descalibra a mesma.
Verificou-se também que ao fazer a transferência do volume coletado para um tubo, o liquido deve ser disposto na parede do tubo afim de evitar a formação de bolhas de ar e para uma melhor homogeneização do mesmo. Do mesmo modo deve-se atentar para a formação de bolhas na ponteira, está deve estar toda preenchida com o liquido até a marca de seu volume, para que não haja interferência na precisão da coleta.
Líquidos muito viscosos também podem ocasionar em uma pipetagem não precisa.
Aula 3 – Eletroforese em gel de agarose 
1 – Procedimentos:
Preparo do Gel
Pesou-se 0,4 grs. do pó de agarose e dissolveu-o em 50 ml de tampão TBE, sendo a agarose um pó para que fosse dissolvida no tampão a mistura foi levada ao aparelho de micro-ondas para aquecimento até que ocorresse a formação de uma solução incolor semelhante a uma gelatina.
Em seguida a solução ainda morna foi vertida na forma da cuba de eletroforese, com o auxílio de um suporte posicionou-se o pente (uma tira de teflon denteada que serve como molde para formação dos poços no gel), está foi posta acima do fundo da forma, esperou até que esfriasse e se solidificasse. 
Eletroforese em gel de Agarose:
Após a construção do gel, a forma contendo o gel foi transferida para o interior da cuba de eletroforese e adicionado o tampão de corrida até que este cubra a lateral do gel, o próximo procedimento foi a retirada do pente, observou-se que o gel ficou com os poços no formato de pente onde posteriormente foram inseridas as amostras preparadas de DNA, para preparação desta amostra adicionou-se o tampão de corrida e a água ao DNA previamente extraído e homogeneizou-o.
Coletou-se com auxílio de um micropipetador, 10 microlitros da amostra e transferiu-se cuidadosamente para o primeiro poço do gel, pressionando delicadamente o embolo para que não houvesse extravasamento da amostra no gel, adicionou-se na sequência a segunda amostra no segundo poço, agora passou-se a corrente elétrica nesta solução tampão, para isto ligou-se o fio vermelho (polo positivo) e o fio preto (polo negativo) nas posições conforme indicado na cuba de eletroforese. Ligou-se a fonte, ocorreu a aplicação de uma corrente elétrica, o aparelho permaneceu ligado por proximamente 40 minutos para migração das moléculas de DNA, ressaltando que o tempo pode variar conforme o gel utilizado e a concentração. Neste caso para retenção das moléculas e fragmentos de DNA usou-se uma concentração maior a fim de construir uma malha mais fechada no gel.
Após esse período o gel foi retirado e transferido para um recipiente contendo uma solução com o corante brometo de etídio, para que este intercale no DNA.
Terminada a coloração retirou-se o gel e o mesmo foi posto no equipamento transiluminador, que possui luz ultravioleta para a visualização dos fragmentos de DNA.
2 – Conhecimentos Adquiridos
Em laboratórios de pesquisa e de diagnósticos a técnica utilizada para análise do DNA é a eletroforese em gel. No caso da aula prática o intuito da realização do experimento foi verificar se o DNA estava presente na amostra extraída, visualiza-lo e observar se as amostras possuíam moléculas de diferentes tamanhos.
O termo eletroforese refere-se à migração de uma partícula carregada sob a influência de um campo elétrico, a molécula de DNA é composta por grupo funcional ionizável, no caso grupos fosfatos, e apresenta carga negativa em Ph neutro ou alcalino quando imersa em uma matriz de gel submetida a um campo elétrico, ela tende a migrar para o polo positivo. Já que todos os fragmentos de DNA têm a mesma quantidade de carga por massa as moléculas de diferentes tamanhos terão velocidades de migração diferentes, no caso em questão os fragmentos menores de ácidos nucleicos deslocam-se mais que os maiores.
.A matriz utilizada na eletroforese pode ser de agarose ou poliacrilamida, no caso da aula em questão utilizou-se o gel de Agarose, este é um polissacarídeo linear componente do Agar extraído de algas marinhas, sua propriedade gelificante se deve a formação de pontes de hidrogênio inter e intramoleculares entre as cadeias de agarose, forma um tipo de rede que segura as moléculas durante a migração, pode-se verificar que sua polimerização é rápida, este gel é normalmente utilizado para separação de fragmentos de proteínas e ácidos nucleicos.
É fundamental a utilização de uma solução tampão apropriada isso porque ela mantem constante o estado de ionização das moléculas que estão sendo separadas, qualquer variação no Ph pode afetar a carga liquida e assim a mobilidade da partícula.
Como já tido anteriormente o DNA tem uma estrutura que possui um grupo fosfato, uma pentose e uma base nitrogenada, os grupos fosfatos possuem carga negativa então quando se inicia a passagem da carga elétrica os fragmentos de DNA migram para o sentido do polo positivo, isso acontece porque na cuba o gel encontra-se entre os fios de platina que agem como cátodo e ânodo provocando assim a passagem da corrente elétrica que foi gerada através da fonte de eletricidade.
A diferenciação entre os tamanhos das moléculas de DNA é possível porque o gel possui poros então durante a passagem da corrente elétrica as moléculas que forem grandes terão mais dificuldade de passar pelos poros e ficarão mais retiradas, a migração será mais lenta no gel, enquanto que as moléculas que forem menor terão maior facilidade para atravessar poros e percorrerão o gel com mais facilidade e mais rápido, dessa forma pode-se observar uma separação das moléculas por tamanho.
Os filamentos de DNA são incolores e para a sua visualização é necessária a utilização de corantes, no caso o brometo de etídeo é o mais utilizado para o gel de sacarose, este se intercala entre as bases dos ácidos nucleicos e quando exposto a luz Ultravioleta, emite e assim apresenta uma coloração vermelha alaranjada, a intensidade da cor será proporcional a concentração presente na amostra de DNA.