processamento histológico

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Introdução
O procedimento mais utilizado no estudo dos tecidos é a preparação de cortes histológicos que podem ser examinados com o auxílio de um microscópio. Este processo consiste numa série de etapas que busca a obtenção de um corte que preserve ao máximo as características da estrutura viva, além de uma longa vida útil. O processamento do material para análise é imprescindível. Do contrário as células sofreriam autólise e também sofreriam a ação de microrganismos de proliferação rápida. Além disso, o material deve ser fatiado em cortes delgados uma vez que as estruturas teciduais e orgânicas são naturalmente espessas demais para permitir a passagem da luz do microscópio. Outro aspecto importante é o fato de que quase todos os componentes das células e da matriz extracelular são transparentes, isso não se deve apenas ao seu alto conteúdo de agua, pois, mesmo dessecados, continuam tendo um contraste muito baixo. Para vencer esta limitação, são empregadas substancias que coram os componentes celulares com certa especificidade. 
Metodologia
Obtenção de amostras (Eutanásia)
Fixação
Desidratação
Diafanização
Impregnação
Inclusão
Microtomia
Coloração
Montagem
Colheita de amostras
Eutanásia e retirada de órgãos 
Intervalo entre óbito e processamento: entre 2h e 6h, em que quanto maior o tempo mais as células se degradam e mudam sua estrutura;
Dimensão do fragmento: na amostra em 3 dimensões, uma das superfícies precisa ter no máximo 5mm, para que a peça consiga receber a substancia a qual foi mergulhada para conseguir ser conservada;
Representatividade de amostra: números de fragmentos em diferentes partes define a representatividade da amostra;
Formato: reto;
Instrumento de corte: micrótomo, lamina de bisturi;
Limpeza do fragmento;
Cuidados durante a manipulação;
Acondicionamento e identificação: cacete, plástico, vidro;
Fixação
Definição: Preservação de uma amostra de material biológico o mais próximo do seu estado natural por meio de um fixador adequado.
Finalidades: evitar a destruição das células, preservar a morfologia e composição dos tecido, permitir a penetração de outras substâncias.
Propriedades de um bom fixador
Facilidade de penetração;
Atuação sobre enzimas intracelulares;
Ação sobre microrganismos;
Capacidade de insolubilizar constituintes celulares;
Efeitos sobre a peça: encolhimento/dilatação, enrijecimento, distorção da arquitetura, ligação a corantes.
Fixadores comumente utilizados
Formalina a 10% tamponada 
Ácido pícrico
Bicromato de potássio
Ácido acético
Álcool etílico absoluto
Clorofórmico
Glutaraldeido
Tetróxido de ósmio
Combinações de agentes fixadores (mistura fixadora)
Bouin
Helly
Zenker
Carnoy
Cuidados especiais durante a fixação
Relação volume de fixador/ volume de amostra: usar um volume 20 vezes maior de formol do que o tamanho da peça;
Tempo de exposição de fixador: mínima de 24h;
Imersão completa do fragmento: ao ser imerso na substancia vários fragmentos, devido à baixa densidade ou a presença de ar, pode ter parte de sua amostra absorvido o fixador ou não;
Temperatura; 
Espessura do tecido;
Descalcificação
Definição: remoção dos sais de cálcio que se encontram depositados nos tecidos orgânicos sem alteração da sua estrutura celular.
Justificativa: A descalcificação, por remover os sais de cálcio, se faz necessária para tecidos mineralizados, pois os cristais de cálcio destroem o fio da navalha, criando dentes que impedem a confecção de bons cortes e levam ‡ formação de artefatos técnicos, impedindo a análise histológica adequada.
Agentes descalcificadores: 
Nítrico, 
Fórmico, 
Tricloacético, 
Clorídrico,
Pícrico, 
EDTA, 
Sulfossalicílico.
Escolha do descalcificador: A escolha do método de descalcificação depende da urgência, do grau de mineralização, do interesse da investigação, das técnicas de coloração que se pretende empregar e do tipo de fixador utilizado. Quanto mais rápida for a ação de um descalcificador, pior será a preservação morfológica do tecido.
 
Desidratação
Definição: A desidratação consiste na remoção da água dos tecidos, pois as substâncias previamente utilizadas para inclusão em parafina não se combinam homogeneamente com a água.
Soluções empregadas: 
Álcool butílico
Álcool isopropílico
Acetona
Éter
Clorofórmio
Óxido propileno
Cuidados especiais:
Uso de reagentes de qualidade confiável: se a amostra continuar com presença de água, todo o procedimento será prejudicado;
Respeito aos períodos adequados: 6h à 24h dependendo do tamanho da peça.
Procedimento: submersão sucessiva de concentrações crescentes de álcool.
Relação volumétrica: O volume de álcool utilizado deverá ser de 10 a 20 vezes maior que o volume da peça.
Clivagem
Definição: reduzir as dimensões dos comprimentos dos tecidos coletados. Dependendo do tipo de fixador utilizado, ela pode ser feita em até algumas horas depois.
Relação volumétrica: até 3mm de espessura, podendo chegar a 5mm dependendo do tipo de órgão. 
Diafanização
Definição: Imersão de uma solução apolar que seja miscível tanto no álcool quanto na parafina. Tornar o tecido translucido.
Reagentes: 
Toluol
Benzol
Éter de petróleo
Óleo de Cedro
Salicilato de metila
Relação volumétrica: A quantidade de xilol (substância mais empregada) utilizada deve ser 10 a 20 vezes o volume da peça.
Cuidados especiais 
Turvação do solvente 
Prolongamento do tempo de exposição: de 1h à 6h dependendo do volume
Riscos de manipulação e destinação dos reagentes
Impregnação
Definição: preenchimento interno da amostra com parafina liquida. Parafina penetra nos vasos, nos espaços intercelulares e no interior das células, impregnando o tecido e tornando mais fácil a obtenção dos cortes. 
Cuidados especiais
Com a estufa: ajuste e verificação da temperatura (60º C), frequência de abertura;
Com a parafina: filtração e fusão completa;
Com o fragmento: identificação e temperatura da estufa e das prateleiras.
Processamento automático ou manual;
	
Processador de tecidos automático 
 
 
 Processador a vácuo 
Inclusão
Definição: A inclusão se baseia em colocar, os tecidos que foram previamente infiltrados em parafina no interior de um molde que já contém parafina líquida com a superfície a ser seccionada (a ser cortada ao micrótomo) para baixo
Cuidados especiais: 
Posicionamento da amostra no bloco
Identificação da amostra
Resfriamento progressivo do bloco
Conservação em baixa temperatura
Reciclagem da parafina
Microtomia
Definição: Para permitir a análise dos tecidos ao microscópio de luz, eles devem ser seccionados em fatias bem finas e uniformes. A espessura ideal varia de acordo com o objetivo de estudo; recomenda-se a espessura de 4 a 6 mm na rotina dos laboratórios. O instrumento capaz de confeccionar cortes com tal precisão é o micrótomo, sendo constituído por três partes: corpo, porta-bloco e porta-objeto. Considera-se, ainda, que em alguns modelos possua duas manivelas, uma manivela de ajuste e outra de corte.
Tipos de micrótomo: rotativo, corrediça, ultramicrotomo, vibratório e congelamento.
Cuidados especiais: 
Manutenção do equipamento;
Regulagem da espessura do corte;
Afiação da navalha/eliminação de dentes;
Uso de blocos de gelo.
Coloração
Definição: A utilização de corantes é fundamental para visualizar os tecidos ao microscópio de luz. Após a microtomia, as células e o material extracelular são habitualmente transparentes e os corantes melhoram a visualização das estruturas teciduais.
Corantes: Corantes são compostos orgânicos aromáticos formados pelo cromógeno e autódromo e coram seletivamente os componentes teciduais, como as células e a matriz extracelular. De acordo com a carga ùnica, os corantes podem ser ácidos, básicos ou neutros.
Cuidados especiais: 
Métodoutilizado
Tempo de fixação
Desidratação incompleta
Qualidade do corante
As colorações podem se caracterizar segundo a ação:
Diretas: quando o corante penetra no interior dos tecidos sem tratamento intermediário com mordente.
 Indiretas: quando é necessário um tratamento intermediário com uma solução mordente para o corante se ligar ao tecido durante a coloração. 
Podem ser classificadas segundo o Tempo:
Progressiva: a coloração é feita gradualmente sem a necessidade de se proceder sua diferenciação, isto é, que seja retirado o excesso do corante. 
Regressiva: hipercora-se o tecido e posteriormente remove-se seu excesso pela diferenciação para melhor visualização dos elementos teciduais.
Podem ser classificadas segundo a Cromatização: depende da quantidade de corantes utilizados durante a execução de uma determinada técnica de coloração. 
MonocrÙmica = 1 cor. 
BicrÙmica = 2 cores. 
TricrÙmica = 3 cores. 
PolicrÙmica = mais de 3 cores
Variedade de corantes: 
GOMORI: cora fibras colágenas (verde) e fibras elásticas (marrom);
AZAN-MALLORY: cora estruturas em azul, tecido conjuntivo e cartilagem;
PRATA ÁCIDO PERIÓDICO: cora fibras reticulares em preto, núcleo em azul e citoplasma amarelo; 
GALOCIANINA: cora em azul núcleos e corpos de nissil dos neurônios; 
MASSON: queratina, colágeno, fibras musculares e tecido ósseo verdes e citoplasma vermelho vivo. 
CORANTES VITAIS: lítio-carmim, azul tripan e nanquim. 
Montagem dos cortes
Preparo das laminas e lamínulas: lavagem, conservação e secagem;
Preparo e aplicação da substancia adesiva;
Captação do corte distendido e distensão complementar;
Desparafinização e hidratação;
Coloração;
Desidratação e diafanização finais;
Acabamento e montagem da lamínula.
Conclusão
Observa-se, assim, que o processo histológico, muitas vezes menosprezado por alunos e profissionais, tem grande e importante significado na histologia. Sem esse processamento o estudo aprofundado dos tecidos e células do corpo seria praticamente impossível. É notória a grande especificidade do processo, em que se uma ou mais etapas ocorrerem de maneira irregular, todo o estudo daquele tecido foi abalado. Além disso, percebe-se a evolução do estudo da histologia, e que ao longo dos anos foi ocorrendo o melhoramento para o estudo mais especifico da histologia e do corpo dos seres vivos.
Bibliografias 
http://www.epsjv.fiocruz.br/upload/img/capitulo_3_vol2.pdf
JUNQUEIRA,L.C. Histologia básica.Rio de Janeiro:Guanabara,2004.
Slides e aulas professora Janaína e professor Claudio Cabral (ano passado)