SILENCIAMENTO GÊNICO PDF

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1.INTRODUÇÃO 
 “Silenciamento Gênico” refere-se a uma série de mecanismos por meio dos quais a 
expressão de um gene é regulada de forma negativa. Esse processo gera modificações celulares 
epigenéticas que são modificações das funções genéticas que são herdadas, mas que não alteram 
a sequência do DNA (ALBERTS, 2008). 
Henrique Marques Souza, professor do Instituto de Biologia (IB), inicia uma 
explicação de que o estudo deste mecanismo de defesa trouxe para o dia a dia da pesquisa e da 
área da saúde uma ferramenta, chamada de RNAi (RNA interference) que permite ao 
pesquisador “desligar” genes específicos em qualquer organismo vivo. Além de sua aplicação 
na pesquisa básica para o estudo da função gênica, ou aplicada à área da saúde em terapias 
gênicas, a ferramenta de RNAi passou a ser usada a partir de 2006 para o controle de pragas em 
culturas agrícolas. Moléculas capazes de silenciar especificamente genes de pragas são 
introduzidas nas plantas e ao se alimentarem destas plantas as pragas têm seus genes 
silenciados. (SUGIMOTO,2017) 
 As funções do RNAi nas células consistem na defesa contra sequências 
nucleotídicas parasitas, regulação da expressão genética durante o desenvolvimento de um 
organismo, regulação da expressão genética em estados de saúde e de doenças. E as funções do 
RNAi nos laboratórios são investigações farmacêuticas (novas terapias para patologias de 
etiologia genética); investigação básica, principalmente nas áreas de biologia do 
desenvolvimento; epigenética; regulação genética, estudos de evolução entre muitas outras 
áreas. (UALgess, biologia molecular, 2015). 
 Posto isso, falaremos com mais detalhes sobre o tema no decorrer do trabalho. 
 
 
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2.MECANISMO DE SILENCIAMENTO POR dsRNA 
O mecanismo de silenciamento por RNA foi primeiramente observado em plantas. 
Pesquisadores trabalhando com plantas transgênicas tentavam produzir petúnias com uma cor 
violeta mais intensa, inserindo como um transgene uma cópia extra do gene que produz a 
enzima responsável pela cor da flor. Ao contrário do esperado, em vez de roxas, as flores 
nasciam brancas. Ou seja, a cópia extra do gene para pigmentação não apenas não resultava em 
intensificação da cor como anulava, inclusive, a ação do gene endógeno (que tem origem 
interna), fenômeno conhecido como "co-supressão". Mais tarde, os pesquisadores entenderam 
o mecanismo implícito: o transgene provavelmente gerou, na planta, intermediários de RNA 
dupla-fita que reconheceram o mRNA homólogo (endógeno), gerando sua degradação. 
(BAULCOMBE, 2000) 
O RNA dupla-fita é importante no processo de silenciamento porque ele é fragmentado 
dentro da célula em pedaços de 21-25 nucleotídeos por uma nucleasse, conhecida como Dicer. 
Essa enzima é homóloga à RNAse e apresenta um domínio de ligação a dsRNAs e domínios 
helicase (enzima que promove a abertura da hélice do DNA). Os pequenos fragmentos de 
dsRNA, conhecidos como pequena interferência de RNA (siRNAs), correspondem às 
fitas códon e anticódon do RNA alvo e se associam a proteínas celulares formando um 
complexo multimérico chamado RISC (Complexo de especificidade de interferência de 
RNA). Uma helicase presente no complexo abre a dupla-fita dos siRNAs, de forma que a 
fita anticódon guia o complexo até o mRNA alvo. Uma endorribonuclease, também presente 
no complexo, fragmenta o referido mRNA, degradando-o. (ELBASHIR, LENDECKEL W, 
TUSCHL T, 2001, BERNSTEIN E, CAUDY AA, HAMMOND SM, HANNON GJ, 2001, 
NYKANEN A, HALEY B, ZAMOREPD,2001) 
O silenciamento, nesse processo é causado por um mecanismo pós-transcricional: o 
gene é normalmente transcrito dentro da célula, mas não consegue ser traduzido, pois é antes 
degradado. As evidências vêm de experimentos em C. elegans onde se introduziram dsRNA de 
sequências promotoras e de sequências intrônicas, e não se observou silenciamento gênico. Mas 
tudo indica que, ao menos em plantas, a introdução de dsRNAs equivalentes a regiões 
promotoras podem, eventualmente, gerar silenciamento no nível da transcrição por ocorrer 
metilação (ligação ou substituição de um grupo metila sobre vários substratos) da região alvo. 
Em células de mamíferos, não se pode utilizar esse sistema de silenciamento com 
dsRNA longos, pois moléculas de RNA dupla-fita com mais de 30 pares de base ativam vias 
relacionadas com a produção de interferons e a proteína quinase dependente de dsRNA (PKR), 
levando à apoptose (morte celular). A PKR, um potente detector de proteínas virais, é ativada 
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ao se ligar a longas moléculas de dsRNA (similares àquelas produzidas por vírus). Uma vez 
ativada, ela inibe a tradução de proteínas, fosforilando a sub-unidade a do fator de início da 
tradução. Com isso, há uma supressão geral da síntese protéica na célula, levando à apoptose. 
A PKR também ativa as enzimas oligo A sintetase e RNAse L, componentes centrais das vias 
anti-virais, que acabam gerando a degradação inespecífica de RNAs. RNAs dupla-fita com 
menos de 30 pares de base não são capazes de ativar as vias PKR e a via relacionada com a 
produção de interferons e, portanto, podem ser utilizados nas células de mamíferos para 
silenciar genes de forma específica. (MC MANUS MT, SHARP PA, 2002) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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3.FUNÇÕES BIOLÓGICAS DO RNAi 
A interferência mediada por RNA é um fenômeno que naturalmente ocorre nos 
organismos eucariotos e parece exercer, essencialmente, um papel na eliminação de RNAs 
mensageiros anômalos (desigual) e na defesa do organismo contra parasitas moleculares como 
transposons (seqüências de DNA móveis que podem se autorreplicar em um determinado 
genoma) e vírus. Durante a replicação, vírus de RNA de plantas geram RNAs dupla-fita como 
intermediários. Essas moléculas são fragmentadas pela Dicer de forma que, quando a infecção 
se estabelece de fato, o complexo RISC ataca os RNA mensageiros virais e a replicação cai. Em 
contrapartida, os vírus às vezes produzem proteínas que neutralizam o silenciamento do RNA, 
o que explica a existência de algumas cepas altamente virulentas. (BAULCOME D,2002) 
 O papel do RNAi na proteção do genoma é ilustrado por mutantes de C. elegans que não 
apresentam esse mecanismo de silenciamento e que, em consequência, têm uma alta frequência 
de mutações espontâneas em decorrência da maior mobilidade de transposons endógenos. 
(BAULCOMBE D.,1999, TABARA H, SARKISSIAN M, KELLY WG, FLEENOR J, 
GRISHO A, TIMMONS L,1999, ZAMORE PD,2002) 
 As vias de silenciamento em plantas, fungos e animais compartilham um conjunto de 
proteínas relacionadas, sugerindo que os aspectos comuns das vias sejam antigos. Os 
procariotos não apresentam esse mecanismo, considerado, portanto, uma aquisição ou inovação 
eucariótica. (ZAMORE PD,2002) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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 4.O RNAi E A GENÔMICA FUNCIONAL 
O RNAi vem sendo usado como uma ferramenta poderosa para a análise sistemática 
de função gênica. O princípio é: introduzir em uma célula um fragmento correspondente a um 
determinado gene na forma de RNA dupla-fita, ou na forma de DNA, que irá gerar dentro da 
célula um dsRNA. O dsRNA deverá ativar o processo Dicer RISC e, consequentemente, a 
célula irá manifestar a perda de função do gene referido. O genoma funcional completo do C. 
elegans tem sido descoberto com o uso de RNAi. Os pesquisadores criaram uma coleção de E. 
coli que produz dsRNAs correspondentes a cada um dos genes. Os vermes são, então, 
alimentados com essas bactérias (um só tipo a cada vez) e a função de cada gene é deduzido 
pelo comportamento ou pelas propriedades que o organismo deverámostrar. (HANNON GJ, 
2002, SHRAFI K, CHANG FY, WATTS JL, FRASER AG, KAMATH RS, AHRINGER J, 
2003) 
Um programa parecido está sendo desenvolvido em plantas. As plantas são infectadas 
por vírus que carregam insertos correspondentes a cada um dos genes do genoma da planta e a 
função do gene é descoberta pelos sintomas que a planta passa a apresentar. (BAULCOMBE 
D, 1999, WATERHOUSE PM, HELLIWELL CA, 2003) 
Há grupos trabalhando com a inativação por RNAi de genes específicos, com relação 
ao genoma humano, envolvidos no processo de tumorigênese (origem do tumor) e outras vias. 
(BAULCOMBE D, 1999) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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5.CONSIDERAÇÕES SOBRE A UTILIZAÇÃO DE RNAi EM CÉLULAS DE 
MAMÍFEROS 
Usar o RNAi tem como objetivo silenciar de forma específica um determinado gene. 
Portanto, deve-se selecionar cuidadosamente uma região do mRNA alvo e evitar que a região 
escolhida tenha similaridade com regiões pertencentes a outros RNAs não relacionados. 
Aconselha-se verificar se a sequência escolhida é específica, fazendo uma busca nos bancos de 
dados nos quais estão depositadas as sequências do genoma. Ao escolher um fragmento de 
RNA, é recomendado evitar as primeiras 75 bases após o códon de início da transcrição, 
sequências com mais de 50% de G + C, e as regiões 5' e 3' não traduzidas, pois assume-se que 
proteínas regulatórias se liguem a essas regiões. Estudos mostram que critérios bioquímicos, 
termodinâmicos e estruturais devem ser considerados quando se "desenham" siRNAs. Sugere-
se que a extremidade 5' da fita anticódon seja rica em AU, o que confere uma baixa estabilidade 
a essa extremidade, aumentando a probabilidade de que essa fita seja incorporada ao 
complexo RISC. Por outro lado, aconselha-se que a extremidade 5' da fita códon tenha um G 
ou C, de forma que apresente maior estabilidade interna. A utilização de diferentes dsRNA 
pequenos para um mesmo mRNA pode gerar resultados mais ou menos eficazes, dependendo 
da estrutura secundária da molécula alvo. Um siRNA é considerado eficiente quando provoca 
uma redução de pelo menos 90% no nível protéico. (MITTAL V.,2004) 
Há várias formas de se gerar siRNAs para os estudos de silenciamento gênico. As 
moléculas podem ser obtidas in vitro por síntese química, transcrição in vitro ou ainda por 
digestão de dsRNA longos com a enzima Dicer. Nesse caso, uma série de pequenos fragmentos 
é gerada, aumentando consistentemente a probabilidade de silenciamento. Entretanto, não se 
sabe qual molécula provocou o silenciamento. siRNAs podem também ser expressas in 
vivo com a utilização de vetores de expressão. Oligonucleotídeos que deverão codificar a 
sequência de RNA desejada (estrutura de hairpin) são anelados in vitro e em seguida clonados 
em vetores especializados. Dentro da célula, ocorrerá a transcrição e a consequente produção 
do siRNA na forma de hairpin. Muitas são as vantagens desse método: grandes quantidades de 
vetor podem ser geradas por propagação em bactérias; as células podem ser submetidas a uma 
pressão de seleção com a utilização de antibióticos caso o vetor utilizado confira resistência a 
tais antibióticos, observando-se, consequentemente, o efeito do silenciamento sem a 
interferência das células não transfectadas; não se manipula o RNA diretamente. (SUI G, 
SOOCHOO C, AFFAR EL B, GAY F, SHI Y, FORRESTER WC,2004) 
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Com relação às classes de genes silenciados com a utilização de RNAi, se tem relatado 
desde aqueles que codificam proteínas estruturais, como também genes que codificam enzimas 
catalíticas. Um passo limitante do processo de silenciamento por RNAi é a transfectabilidade 
das células. As células HeLa fornecem os melhores resultados: 100% das células são passíveis 
de transfecção com agentes lipofílicos (substâncias que transportam ácidos nucléicos através 
das membranas). Outros tipos de células também já deram bons resultados, mas as culturas 
primárias são notórias por apresentarem baixa eficiência de transfecção. É importante 
mencionar que a eficiência de transfecção depende não apenas do tipo de célula, mas também 
do número de passagens e da confluência. Tanto transcritos abundantes quanto transcritos 
produzidos em pequena quantidade podem ser silenciados. É possível silenciar dois genes 
simultaneamente (laminina e proteína nuclear do aparato mitótico), mas deve-se, nesse caso, 
controlar bem as concentrações de siRNAs usadas. (MC MANUSc MT, SHARP PA, 2002) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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6.APLICAÇÕES DE SILENCIAMENTO GÊNICO MEDIADO POR RNAi NO 
TRATAMENTO DE DOENÇAS HUMANAS 
Os métodos de silenciamento gênico baseados em RNA podem ser utilizados em 
terapia gênica por serem aplicáveis em organismos intactos. As condições que potencialmente 
se beneficiam desta modalidade de terapia gênica são aquelas nas quais a expressão de genes 
danosos desempenha papel importante no desenvolvimento da doença (por exemplo, neoplasias 
malignas, doenças neurodegenerativas e infecções virais crônicas). O RNAi foi utilizado com 
sucesso em modelos experimentais, no silenciamento de genes críticos para a viabilidade, 
proliferação ou disseminação de células tumorais. Obteve-se, com esta tecnologia, down-
regulation de genes que conferem resistência das células cancerosas a estímulos pró-
apoptóticos e a tratamentos antitumorais, aumentando, assim, a eficiência da quimioterapia e 
radioterapia. Os vírus da imunodeficiência humana (HIV), da hepatite C (HCV), e da hepatite 
B (HBV) são alguns patógenos contra os quais estão se desenvolvendo tratamentos baseados 
em RNAi. A replicação do HIV em linfócitos T humanos foi inibida com o silenciamento de 
genes do próprio HIV ou do hospedeiro. O silenciamento da expressão de receptores de 
quimiocinas CC e CXC confere aos linfócitos T resistência à infecção por HIV. Utilizando 
RNAi, diversos grupos relataram sucesso na inibição da replicação e obtiveram clareamento do 
HCV propagado em linhagem de hepatócitos. O RNAi também permitiu a inibição da 
replicação do HBV tanto em cultura de hepatócitos como em camundongos. Finalmente, 
utilizando RNAi é possível atenuar o acúmulo de produtos de genes defeituosos que causam 
doenças neurodegenerativas como a ataxia espinocerebelar tipo 1, a esclerose amiotrófica 
lateral e a doença de Alzheimer. É perceptível que a disponibilidade intracelular dos RNAs 
interferentes é o fator mais importante para determinar a eficácia de um tratamento com esta 
tecnologia, com isso, os esforços atuais estão concentrados no desenvolvimento de sistemas e 
vetores capazes de transferir grandes quantidades de dsRNA ao tecido ou órgão em que se 
deseja obter o silenciamento gênico. (LIU S, ASPARUHOVA M, BRONDANI V, ZIEKAU I, 
KLIMKAIT T, SCHUMPERLI D.,2004) 
 
 
 
 
 
 
 
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7.APLICAÇÕES DE RNAi NA INVESTIGAÇÃO DA FISIOLOGIA E 
FISIOPATIA DO CÓRTEX ADRENAL 
A inativação de genes por knock-out ou por bloqueio da tradução de seus transcritos 
(silenciamento) constitui uma estratégia muito poderosa, tanto para conferir função aos genes 
como para mapear a inter-relação dos diferentes componentes das vias regulatórias dentro das 
células. Um dos meios para se obter o silenciamento pós-transcricional consiste na ativação de 
um mecanismo mediado por RNAs fita-dupla (dsRNA) conhecido como RNA interferência 
(RNAi). O RNAi se mostrou um instrumento extremamente versátil em pesquisa biomédica, 
podendo ser utilizado em experimentos de silenciamento pontual de genes ou ser adaptado para 
estudos em larga escala de genômica funcional, podendo, inclusive, ser utilizado como meio de 
terapia gênica. (BARBOSA, ANGÊLASILVA, 2004) 
 O silenciamento de genes obtido com a tecnologia de RNAi abre novas possibilidades 
para investigação da fisiologia e da fisiopatologia do córtex adrenal. Praticamente todos os 
aspectos da biologia e da fisiopatologia do córtex da supra-renal parecem se beneficiar desta 
nova técnica. A regulação do eixo hipotálamohipófise-supra-renal foi estudada com o auxílio 
do RNAi. Esta técnica permitiu silenciar a expressão do CRF no núcleo paraventricular e avaliar 
a contribuição de outros fatores neuroendócrinos na regulação da resposta secretória do ACTH 
ao estresse. O RNAi tem sido utilizado para inativar seletivamente genes envolvidos em morte 
celular programada, permitindo identificar os componentes promotores e inibidores de um 
processo intimamente relacionado à organogênese (é parte do processo de desenvolvimento 
embrionário no qual os três folhetos germinativos -ectoderme, mesoderme e endoderme- se 
diferenciam e dão origem aos órgãos internos do organismo.) desenvolvimento e 
envelhecimento do córtex adrenal, bem como avaliar a resposta das células adrenocorticais a 
variações do estímulo hormonal. Atualmente, um dos aspectos da fisiologia da esteroidogênese 
que mais atraem atenção dos pesquisadores é a regulação transcricional das enzimas e fatores 
de transcrição através da sua remoção seletiva. Com o RNAi, foi demonstrado o papel do NGFI-
B na mediação da transcrição, induzida por cAMP, do CYP17 no córtex adrenal bovino. Esta 
mesma abordagem de “dissecção molecular” foi também instrumental para se estudar o papel 
do receptor periférico de benzodiazepina na importação do StAR pela mitocôndria e a função 
de uma nova proteína – SBP (StAR-bind - ing protein). Finalmente, a combinação de RNAi 
com técnicas de genômica funcional levou à identificação de proteínas novas análogas à 
proteína StAR, que compõem o sistema de transporte intracelular de colesterol. Visto que DAX-
1 reprime, por interação proteína-proteína, transcrições ativadas pelo Steroidogenic Factor 1 
(SF-1) e é abundantemente expresso em células adrenais da linhagem NCIH295A, nosso grupo 
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está atualmente utilizando RNAi para silenciar a expressão de DAX-1 e estudar as 
conseqüências da remoção deste repressor na transcrição do CYP17 na adrenal humana. 
(BARBOSA, ANGÊLA SILVA, 2004) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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8.SILENCIAMENTO GÊNICO POR VÍRUS 
O silenciamento gênico induzido por vírus (VIGS) tem se destacado como uma 
importante ferramenta da genética reversa, permitindo a descoberta e validação de funções 
gênicas. Esses estudos são realizados por meio da inoculação de plantas jovens com vetores 
virais que carregam um fragmento do gene alvo, visando o desencadeamento do PTGS e análise 
do fenótipo resultante (UNVER & BUDAK, 2009, EAMENS, 2008). 
Diversos vírus de planta têm sido modificados para a construção de vetores virais para 
indução de VIGS. Dentre eles, o TMV, PVX e TRV são os mais utilizados. A utilização de 
vetores virais em estudos de genética reversa possui várias vantagens quando comparada a 
outras técnicas de análise funcional em plantas, como o knocking-out ou interrupção gênica. 
Apesar de apresentar algumas limitações, o método de VIGS geralmente é escolhido pela 
rapidez de geração de fenótipos, por ter custo relativamente baixo e não requerer sistemas de 
transformação e regeneração in vitro. Atualmente, a aplicabilidade de estudos baseados no 
PTGS está sendo demonstrada em diversos ramos, que abrangem desde a produção de flores 
com diferentes colorações, a melhoria da qualidade nutricional de alimentos, a resistência 
antiviral e a defesa contra outros tipos de patógenos, como Agrobacterium e Heterodera. 
Estudos realizados com viroses humanas mostraram ainda que o uso de RNAs como indutores 
de silenciamento também pode ser promissor para fins terapêuticos (PAN, 2009, BURCH-
SMITH, 2004; UNVER & BUDAK, 2009, EAMENS, 2008). 
 
 
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9.MANIPULANDO GENES EM BUSCA DE CURA O FUTURO DA TERAPIA 
GÊNICA 
Em 1990, foi realizado, nos Estados Unidos o primeiro Protocolo Clínico de Terapia 
Gênica em humanos, em duas crianças portadoras da imunodeficiência combinada severa. O 
sucesso fracionário desse protocolo levou a uma explosão no desenvolvimento de vários 
estudos com perspectivas de uso terapêutico dos genes. O entusiasmo causado pelos resultados 
iniciais levou, durante a década de 1990, a se comparar a terapia gênica com outras tecnologias 
que revolucionaram a medicina moderna, como o desenvolvimento de vacinas, anestesias e a 
descoberta de antibióticos. A relativa facilidade de manipulação dos vetores genéticos 
derivados de vírus e o aumento na capacidade de se isolar genes humanos geraram expectativas 
de avanço rápido nesse tipo de terapia e muita excitação na mídia e mesmo nas pesquisas na 
área. Esse entusiasmo inicial, no entanto, não foi confirmado, e vários problemas foram 
encontrados em protocolos clínicos de terapia gênica realizados em seres humanos, o que 
deixou claro que ainda temos uma longa estrada a percorrer antes que o emprego dessa 
tecnologia possa ser incorporado de forma mais genérica ao dia-a-dia dos hospitais. (LUIZ 
SUGIMOTO,2017) 
O desenvolvimento de novos vetores genéticos tem buscado superar os problemas 
encontrados nos trabalhos iniciais de terapia gênica. O vetor ideal deve ser de fácil produção, 
não deve gerar resposta imunológica ao vírus ou ao transgene pelo paciente, deve promover a 
expressão do transgene de modo eficiente e por longo tempo, além de, se possível, ter 
especificidade no tecido alvo. Os principais vetores testados até o momento têm sido os 
derivados de adenovírus e retrovírus, sendo que ambos apresentam várias limitações. Embora 
vetores adenovirais apresentem alta eficiência, estes induzem uma elevada resposta 
imunológica que reduz o tempo de expressão do transgene e praticamente impede a reaplicação 
em um mesmo paciente. (LUIZ SUGIMOTO,2017) 
Os avanços recentes estão fazendo renascer as perspectivas que eram esperadas 
anteriormente, mas os sucessos devem ser observados com otimismo cauteloso, e ainda 
requerem intenso trabalho de pesquisa. (LUIZ SUGIMOTO,2017) 
 
 
 
 
 
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10.CONCLUSÃO 
Cada vez mais técnicas e estudos estão avançando em grande escala para 
compreender fenômenos da genética, são vários os genes e moléculas que estão em testes para 
melhorar enfermidades e é nítida importância do estudo do silenciamento gênico, aplicadas 
como terapia para melhorar a qualidade de vida da sociedade em geral, dentre as doenças que 
são de grandes variedades, podendo assim, aumentar a expectativa de vida. 
A RNAi juntamente com a Terapia gênica vem refletindo uma esperança. Estes 
mecanismos estão se mostrando muito promissores no combate de várias doenças humanas 
genéticas e adquiridas. Mesmo com estes avanços deve–se observar os estudos de maneira 
cautelosa, e muitas aplicações ainda necessitam de intenso trabalho de pesquisa. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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11.BIBLIOGRAFIA 
 http://arquivo.ufv.br/dbg/Resumos%202009b/Silenciamento%20genico%20induzido
%20por%20virus.htm 
 http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0004-27302004000500005 
 http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0004-
27302004000500005&script=sci_abstract&tlng=pt 
 Arq Bras Endocrinol Metal vol 48 n 5 outubro 2004.