Técnicas Laboratoriais: Coloração de Gram, Urocultura, Bioquimismo

Prévia do material em texto

Aulas Práticas:
Coloração e Leitura de Gram
Cultural de urina – Urocultura
Bioquimismo
Leitura do Bioquimismo e Antibiograma
Leitura do Antibiograma e Liberação do Laudo.
 
COLORAÇÃO E LEITURA DE GRAM.
Introdução. 
A técnica Coloração de Gram é aplicada para diferenciar um microrganismo através das cores, para serem observados no microscópio óptico. As Gram-positivas apresentam camadas espessa e numerosas de Peptídieoglicano, composição química de Ácido Teicóico e coloração roxa. Já as Gram-negativas apresentam uma e/ou poucas camadas de peptídieoglicano, membrana externa, composição química por LPS (lipolissacarideos) e coloração rosa. 
Objetivo.
Realizar a técnica de coloração de Gram. Saber a diferença entre bactérias Gram-positivas e Gram-negativas assim como suas estruturas. 
Procedimento 
Com o esfregaço em lâmina já confeccionado, corou-se com violeta Genciana por 60 segundos; lavou-se com esguicho de água e retirou-se todo o excesso de corante; em seguida cobriu-se a lâmina com Iodo de Gram ou Lugol por 60 segundos e após lavou-se com água; com álcool-acetona (descorante) descorou-se e após lavou-se com água. Por último, cobriu-se com o terceiro corante com Fuccina ou Safranina por 60 segundos e após lavou-se. Após a secar foi observado no microscópio 100x.
Desenvolvimento 
O primeiro corante (Violeta Genciana) penetra na bactéria assim como o (Soluto de Lugol) formando um complexo intracelular corante-iodo, insolúvel em água, que vai corar o protoplasma e a parede celular. A camada de peptidioglicano é maior em bactérias gram positivas, as gram negativas, por sua vez possuem pouco peptidioglicano e são coradas pela cor rosa da Fuccina ou Safranina. A lavagem com álcool-acetona dissolve o complexo corante-iodo, se a parede celular for permeável a este, atrai-se para fora da célula. As bactérias capazes de preservar a coloração roxa do 1º corante, o violeta de Genciana, classificam-se por Gram positivas. As bactérias que, após a lavagem com álcool-acetona, são incapazes de reter o violeta de Genciana, classificam-se por Gram negativas, corando pela fuccina diluída que se fixa apenas nas bactérias Gram-negativas. 
Conclusão
A coloração de Gram é um método simples, onde as bactérias são tratadas e coradas de diferentes cores. Sendo as bactérias de Gram-positivas roxo e as bactérias de Gram-negativo Rosa. 
Observou-se na leitura da lâmina Bacilos Gram-negativos. 
CULTURA DE URINA (UROCULTURA)
Introdução 
Urocultura/cultural de urina é uma técnica realizada em laboratórios de análises clinicas, onde é diagnosticado a infecção urinária detectando qual bactéria e o número (UFC – unidade formadora de colônias) de colônias existentes ocasionando a infecção.
Objetivo
Urocultura com amostra de urina em meio Agar Mack Conkey pelo método de semeadura espalhamento.
Procedimento 
Os materiais utilizados nessa técnica foram os seguintes: Urina previamente coletada, alça calibrada descartável 10ul (específica para urina), placa Ágar Mack Conkey e Bico de Bunsen. 
Primeiramente ligamos o bico de Bunsen e realizamos a técnica ao redor dele, para que não houvesse contaminação por outros microrganismos. Homogeneizou-se o frasco contendo a amostra de urina. Mergulhou-se a alça calibrada na amostra de urina onde foi coletada a quantia suficiente para a semeadura, atenciosamente para que não houvesse contaminação (encostar a mão na placa ou na alça antes e durante a cultura) semeou-se pelo método de espalhamento. A semeadura foi realizada cuidadosamente para que não houvesse “cortes” no gel e quanto mais próximas melhor será o resultado. Posteriormente identificou-se a placa no lado oposto ao meio com gel para que não houvesse uma futura troca de placa da referida amostra. Após a semeadura a placa foi incubada em estufa 36ºC +-1ºC por 18horas a 24horas, para que seja feito a avaliação do crescimento bacteriano. 
Desenvolvimento
O resultado do exame de urocultura pode ser avaliado das seguintes maneiras: Negativo ou normal quando não se observa crescimento de colônias de bactérias na urina em valores preocupantes; positivo quando é possível identificar +/=100.000 UFC colônias de bactérias. Neste caso é realizado testes para identificação da bactéria e antibiograma para testar a sensibilidade microbiana e quais antibióticos eficazes ou não no tratamento.
Conclusão
Após o período de incubação em estufa 36ºC +-1ºC por 18horas a 24horas, para haja crescimento bacteriano. Observou-se o crescimento de colônias do patógeno e poucas colônias contaminantes. 
 BIOQUISMO 
Introdução 
A técnica de bioquimismo é destinada para identificação de bacilos Gram negativos oxidase negativa e fermentadoras de glicose – ENTEROBACTÉRIAS. O Bioquímismo é um sistema onde utiliza-se 5 meios de cultura que fornecem provas bioquímicas associadas à leitura de fermentação de lactose (proveniente do meio de isolamento) permitindo uma identificação segura da bactéria analisada.
Objetivo
Identificar a bactéria causadora da infecção, colônias recém obtidas de bacilos Gram-negativos previamente de um meio de cultura isolada, como a Ágar Mack Conkey e sequentemente realizar a cultura nos meios de cultura fornecido para a prova de bioquimismo. 
Procedimento
Com os meios de cultura sob a bancada previamente preparados, iniciamos a técnica organizando os tubos na grade ordem de semeadura CITRATO, SIM, MIO, LIA, FENIL, TSI e URÉIA. Com o bico de Bunsen previamente ligado flambou-se o primeiro meio de cultura (citrato) para que fosse removido microrganismos com possíveis contaminação na semeadura por sequencia essa técnica foi repetida em todos os tubos de meio de cultura utilizados. Com alça agulha bacteriológica flambada, encostou-se na superfície de uma colônia e iniciamos as semeaduras da seguinte maneira:
No meio Citrato, com a alça agulha flambada encostou-se em uma das colônias da bactéria e semeou-se com estrias em sua superfície;
No meio SIM, encostou-se em na mesma colônia de bactéria e semeou-se uma picada central em linha reta sem encostar no fundo do tubo (2/3);
No meio MIO, encostou-se na bactéria e semeou-se com uma picada central até o fundo cuidadosamente para que ao voltar o trajeto da agulha seja o mesmo (para não criar dificuldade na prova de motilidade) inoculou-se por três vezes e utilizou-se inóculo denso;
No meio LIA, Flambou-se a agulha, e encostou-se novamente na mesma colônia e inoculou-se uma porção da bactéria, furou-se até o fundo do tubo e estriou-se a superfície;
No meio Fenilalanina, inoculou-se uma porção da bactéria e estriou-se a superfície;
No meio Ureia, inoculou-se a bactéria, furou-se até o fundo e estriou-se a superfície; 
No meio TSI, inoculou-se uma porção da bactéria e furou-se o meio até o fundo do tubo e estriou-se a superfície.
Inoculou-se todos os tubos e após as semeaduras mantiveram com as tampas frouxas para uma melhor aeração. Em seguida incubou-se os tubos na estufa bacteriológica entre 35-37Cº por 18-24hrs para serem realizados a leitura dos resultados.
Leitura do Bioquimismo 
O meio TSI desenvolveu uma coloração na base (amarelo): Lactose positiva, desenvolveu uma cor amarela no fundo do tubo: Glicose positiva, desenvolvimento de bolhas com intensidade variável no interior do meio: Gás de glicose positivo; 
No meio Citrato, observou-se a presença de coloração azul: Citrato negativo;
No meio SIM, observou-se que não houve crescimento além da linha de semeadura: motilidade negativa, adicionou-se de 3 gotas do reativo de Kovac's e formou-se um halo vermelho: Indol positivo; 
No meio MIO e LIA, verificou-se a presença de coloração roxa, sendo assim positivo; 
O meio Fenilalanina adicionou-se 3 gotas de Cloreto Férrico e homogeneizou-se o tubo com movimentos baskara, o meio manteve-se integro e não apresentou mudança cor no fundo do tubo continuou na cor nude, sendo então negativo.
O meio Ureia não apresentou coloração rosa, sendo resultado negativo. 
Conclusão
Após observado as características de cada meio de cultura a leitura foi finalizada combase de dados contido na tabela de identificação de Enterobacterias, concluiu-se que as a bactérias causadora da infecção e Escherichia coli. 
Antibiograma 
Introdução 
Antibiograma é um método utilizado para provas de sensibilidades aos antibióticos utilizado um um isolado bacteriano cultural recente. É um exame laboratorial para testar a sensibilidade da bactéria causadora da infecção isolada para diferentes antibióticos. 
Objetivo
Verificar a sensibilidade da bactéria Escherichia coli aos antibacterianos escolhidos para o antibiograma.
Procedimento
Com o Bico de Bunsen previamente ligado, a técnica foi realizada ao redor dele para que não houvesse contaminação. A cultura da Escherichia coli. Com uma alça agulha, inoculou-se uma porção de bactéria e dissolveu-se dentro de um tubo com salina estéril, homogeneizou-se e comparou-se a turbidez com o tubo de salina na escala de Macfarland. Sendo a turbidez de ambos os tubos iguais, foi umedecido um swab com a salina composta pela bactéria, tirou-se o excesso e semeou-se em uma placa de Agar Mueller Hinton de 15 cm três vezes em três sentidos diferentes. 
Após a semeadura os discos de antibióticos escolhidos forma colocados em contato com a placa e bem fixa ao gel, os discos de antibióticos foram colocados (deixando 2 dedos de distância a borda para o disco de antibiótico) de forma que não interferiram na formação dos halos. Colocou-se em incubação na estufa 37Cº durante 24 horas.
Os antibióticos escolhidos para o Antibiograma forma: Imipenem, Ertapenem, Norfloxacina, Eritromicina e Ampicilina+Sulbactam. 
Referências:
Disponível em: http://www.provida.ind.br/site/index.php/bacterias/bacterias/122-tecnica-de-gram.html (acesso em: 19/04/2019).
Disponível em: https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php (acesso em: 19/04/2019).
http://www.hu.ufsc.br/setores/laboratorio/wpcontent/uploads/sites/6/2018/07/Urocultura.pdf
http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/clsi/clsi_OPASM2-A8.pdf