Relatório 6 - Cromatografia Líquida de Gel Filtração

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CST em Gestão Ambiental
Controle Químico Analítico
Professores: Ana Luiza Baddini
Ademário Íris da Silva Júnior
Cromatografia Líquida de Gel Filtração
Turma: GAM341
Alunos: Fabiana Rodrigues
Philippe Araújo
Roberto Ricardo Rangel
Tamires Rodrigues
1. INTRODUÇÃO
A cromatografia liquida de gel filtração ou de exclusão molecular é um
importante método para realizarmos purificação e análise de macromoléculas,
podendo determinar a massa molecular e a forma das mesmas.
Esta técnica possui propriedades desejáveis como: simplicidade técnica,
insensibilidade a solventes e temperatura, condições amenas e versatilidade, pois
possibilita a separação de substâncias com massas moleculares variáveis, mudando -
se a matriz.
A propriedade que difere a cromatografia de gel filtração, introduzida mais ou
menos em 1960, das demais cromatografias é que o recheio ou gel é formado de
macromoléculas que têm ligações cruzadas, com afinidade pelos solventes, mas que
neles não são solúveis. As partículas estacionárias compõem um gel, não carregado,
inchado com o mesmo liquido que carrega as substâncias a serem separadas.
O espaçamento das partículas é preenchido pelo liquido que flui pelo material
levando, ou não, as substancias a serem separadas. O caráter da fase estacionaria
controla o movimento das substâncias, variando suas velocidades e assim promove a
separação.
Nesta cromatografia as moléculas maiores tendem a migrar mais rapidamente
que as menores, pois elas não conseguem penetrar no interior dos poros da resina,
sendo assim elui diretamente pela coluna. Já as menores moléculas levam mais
tempo para serem eluídas, pois percorrem o interior dos poros.
Outra característica, que deve ser considerada neste método é que nela ocorre
a diluição da amostra, pois requer um fluxo constante de solvente. Contudo, esta
técnica possui características importantes na purificação e determinação de massa
molecular, além de ser um método rápido de dessalinização de soluções.
2. PROCEDIMENTO
Preparou-se para carregar a amostra na coluna (usando Sephadex como fase
estacionária). Esperou-se até que a extremidade do menisco do tampão toque a
superfície da resina, fechou-se a torneira e carregou-se a coluna, bem próximo à
cama, com uma mistura de 30 µL de Vermelho de Fenol e 30 µL de Azul de Dextran.
Após, abriu-se a torneira da coluna e esperou-se até que a amostra penetrasse na
resina completamente.
Figura 1 ― Vermelho de Fenol (PM = 300)
Figura 2 ― Azul de Dextran (PM = 2.000.000)
Aplicou-se aos poucos a fase móvel PBS (tampão fosfato salino) até a
penetração total da amostra. Após, manteve-se um fluxo contínuo da fase móvel até o
final da eluição. Imediatamente após a aplicação da amostra na coluna, iniciou-se a
coleta das frações em provetas de 10 mL. Colheu-se 13 alíquotas de 2 mL e
transferiu-se para 13 tubos de ensaio devidamente rotulados.
Figura 3 ― Representação Esquemática da Vidraria Utilizada
Repetiu-se a operação ate que não se observasse mais vestígio dos corantes e
a cada rodada as provetas eram rinsadas com água destilada. As frações recolhidas
foram lidas no espectrofotômetro com varredura e posteriormente foram selecionados
três comprimentos de onda que melhor representassem o experimento,
aproximadamente: 440, 560 e 625 nm.
3. RESULTADOS
Realizamos a separação física dos dois corantes através da técnica da
cromatografia líquida de gel filtração (ou exclusão molecular) ler as absorbâncias. Na
tabela 1 e na figura 3 temos representados os resultados obtidos nos experimentos.
Tabela 1 ― Absorbâncias X Cubetas
Nº da
Cubeta
Absorbância por λ
440 nm 560 nm 625 nm
1 -0,174 -0,125 -0,002
2 -0,062 -0,036 0,000
3 -0,048 -0,020 0,124
4 -0,081 -0,035 0,115
5 -0,004 0,053 0,053
6 0,135 0,224 0,013
7 0,268 0,398 -0,019
8 0,206 0,307 -0,013
9 0,011 0,073 -0,027
10 -0,002 0,062 -0,049
11 -0,017 0,057 -0,021
12 -0,036 -0,015 -0,031
13 -0,011 -0,004 -0,105
Figura 4 ― Absorbâncias X Cubetas
O primeiro a eluir é o azul de dextran, pois sendo uma molécula grande não
consegue penetrar nos poros da resina. Posteriormente abandonamos a leitura em
440 nm, pois tivemos maiores absorbâncias em 560 nm para o vermelho de fenol.
1ª 2 ª 3ª 4ª 5ª 6ª 7ª 8ª 9ª 10ª 11ª 12ª 13ª
4. TAREFAS
4.a. Construa o cromatograma com as absorbâncias lidas para cada corante e seus
volumes de eluição, determinado o volume inicial e final das colunas.
Como o volume recolhido em cada cubeta foi 2 mL e temos um total de 13
cubetas, temos que o volume total para a eluição na coluna é de 26 mL. Seguindo este
raciocínio temos para cada corante:
− Azul de dextran: volume inicial = 2 mL e volume final = 10 mL;
− Vermelho de fenol: volume inicial = 12 mL e volume final = 20 mL.
4.b. O que aconteceu com o volume de amostra recolhido em relação ao que foi
aplicado e por quê?
O volume final da amostra aumentou em muitas vezes em relação ao volume
inicial. Isso ocorreu pela diluição ocorrida durante o processo de separação na fase
estacionária e a constante adição de fase móvel.
4.c. Como você procederia caso desejasse trabalhar com maior volume de amostra?
Para se trabalhar com volume maior de amostra, seria necessária uma coluna
cromatográfica maior, para que possa suportar maior volume de fase estacionária.
Isto provocaria uma maior eficiência de separação
4.d. Duas moléculas de mesmo peso molecular obtiveram diferentes tempos de
retenção. Explique.
Apesar de terem o mesmo PM, a geometria ou tamanho diferente dessas
moléculas influenciará se elas passarão ou não pelos poros da resina, ou seja, qual
será o seu tempo de eluição pela coluna.
4.e. Você está utilizando uma Sephacryl 5-500 HR. Entretanto, a eluição está
demorando excessivamente o que fazer?
Como a resina Sephacryl é um gel mais rígido, mais viscoso que a Sephadex,
ou seja, é mais resistente a passagem da fase móvel, apresentando assim maior
tempo de corrida. Para resolver essa situação pode aumentar a pressão da fase
móvel, para assim aumentar a velocidade de eluição.
4.f. O que fazer quando a única chance de separação de duas substâncias é através
do aumento do “mesh” da resina e da implantação do números de pratos teóricos?
O grau de reticulações, ligações cruzadas entre as cadeias, determinam o
mesh de uma resina. Quanto menor o número de ligações cruzadas entre as cadeias,
maior será o tamanho dos poros (maior o mesh). Então para aumentar o mesh de uma
resina basta utilizar uma com menor grau de reticulação. Porém este aumento do
diâmetro da partícula, piora a separação, tal fato pode ser compreendido pela
Equação de Van Deemter, uma vez que aumenta a altura dos pratos teóricos,
diminuindo o número total dos mesmos. Uma forma de diminuir esse problema gerado
pelo aumento dos poros da resina é aumentar a velocidade da fase móvel através do
aumento de pressão. Esse aumento tem que ser controlado, pois se não pode
danificar a integridade física da resina.
4.g. Como você calibraria a sua coluna?
Para calibrar a coluna, utilizaríamos padrões conhecidos de um determinado
analito, anotando seu tempo de retenção, as condições do meio, altura e tipo da fase
estacionária, além da fase móvel utilizada. Uma vez que, o mesmo analito apresenta o
mesmo tempo de retenção caso todas as condições da eluição.
5. CONCLUSÃO
A cromatografia líquida clássica se mostrou uma boa técnica para separação
de corantes, com um alto tempo de análise.
6. BIBLIOGRAFIA
− COLLINS C. H.; BRAGA G. L; BONATO P. S. org. Fundamentos de
Cromatografia. Campinas − SP. Unicamp, 2009.
− de Química Analítica, Editora Thomson, tradução da 8ª edição, 2006.
− POP 009e1r3 – Cromatografia Líquida de Gel Filtração. IFRJ, 2008.
− The Merck Index Thirteenth Edition on CD-ROM,2011. Merck & Co., Inc.,
Whitehouse Station, New Jersey, USA.