resumo cultivo

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CULTIVO DE CÉLULAS ANIMAIS E VEGETAIS – 1º BIMESTRE
INTRODUÇÂO A CULTURA CELULAR
DEFINIÇÃO DE CULTURA CELULAR: 
Conjunto de técnicas que permite cultivar e manter células isoladas fora do organismo de origem, mantendo as características próprias. 
A célula imita no cultivo um comportamento que tem no organismo.
Podem ser feitas culturas de células de tecidos animais e vegetais, tendo um previa desagregação do tecido original.
Basicamente são usados dois tipos de cultivo
Suspensão: Cultivadas a partir do sangue do baço ou da medula 
Aderidas: Cressem em monocamada ligadas a superfície do recipiente de cultura.
TIPOS DE CULTURA CELULAR:
Culturas primarias: É estabelecida a partir do crescimento de células oriundas de um fragmento de tecido obtido por desagregação mecânica ou enzimática. Essas células possuem as características do tecido de origem, podem crescer em cultura por um determinado período de tempo - não vivem mais do que duas ou três semanas.
Culturas secundarias: à medida que a cultura é repicada, as células com uma maior capacidade de proliferação irão predominar na garrafa de cultivo em detrimento das cálulas que não se adaptaram bem ao cultivo ou que, devido a traumas do processo de desagregação, não possuem uma taxa normal de proliferação. 
Linhagem celular finita.
Linhagem celular continua: A célula sofre uma transformação espontânea ou devem ser transformadas através de agentes químicos ou vírus (podem ser transformadas por impedimento de adesão onde não conseguem se aderi e tronam-se células tumorais) ou também, podem ser linhagem tumorais, onde encontra-se várias vantagens e desvantagens (possuem alta capacidade de divisão celular e facilidade de manter a cultura).
No momento em que as características genéticas das células são modificadas, elas deixam de ser semelhantes morfologica e geneticamente ao tecido original e são então chamadas células transformadas.
As células nesse tipo de cultura podem apresentar mutações por estarem vivendo num ambiente distinto do que costume.
MANUNTENÇÃO: 
É necessário fornecer nutrientes necessários para a sobrevivência das células (meios de cultura), além de constante repique e podendo também criopreservar.
O congelamento é importante pois, à medida que as células crescem, o fenótipo pode mudar ou variar, então deve-se congelar cada linhagem assim que possível.
Para conseguir manter as células num frasco o meio deve ser muito rico, o que facilita contaminação.
Meios de cultura: Tem que ser isotônico e nutritivo. Para as células devem possuir aminoácidos, carbo-hidratos, sais minerais, vitaminas e fatores de crescimento.
Harry Eagle, descreu o primeiro método sintético para cultivo, chamado Meio Basal de Eagle (BME), outros cientistas aprimoraram este meio, sendo que o mais utilizado ultimamente é o Meio MEM modificado por Dulbecco (DMEM).
Possuem indicadores de pH. 
O meio deve ser trocado regularmente mesmo em células com crescimento lento. 
Pode ser adicionado soro fetal bovino, antibiótico e antimicótico. 
 
Observação das células: As células em culturas devem ser observadas macro e microscopicamente antes de repicar ou usar para experimento. A cor do meio e sua turbidez podem indicar fatores como contaminação.
A contaminação é prevenida com assepsia. 
Em pequeno aumento no microscópio é possível a visualização de micélios de fungos, leveduras e brotamentos. Em maior aumento, esporos e bactérias.
Os Micoplasmas são menores organismo e geralmente impossíveis de serem observados no microscópio invertido.
Caso encontrada contaminação as células devem ser descartadas. 
Tomar o cuidado de não contaminar um frasco de célula com outra célula. Repicar separado.
Repique de células em suspensão: Após serem observadas no microscópio e constatado que não a contaminação, o liquido da garrafa pode ser transferido para um tubo e este centrifugado, após esse procedimento a células são lavadas com PBS (solução salina que não tem diferença osmótica com as células, isotônica) e centrifugadas novamente, uma alíquota é retirado para contagem e cálculos de volumes que serão adicionados na nova garrafa, tanto de célula, quanto de soro, meio e antibiótico.
Repique de células aderidas: O meio que está na garrafa é descartado e uma nova quantidade de meio novo é adicionada junto com a tripsina (esta quebra as ligações que as células fazem com a garrafa, se liga 1º em proteínas que estão disponíveis), então é deixado um tempo na estufa para que a tripsina possa agir e após, é colocado um novo volume de meio (afim de parar a ação da tripsina nas células e deste, é retirado uma alíquota para contagem e cálculos).
A viabilidade celular é realizada através do AZUL DE TRIPAN (entra em células que não estão com a membrana íntegra, por isso, não viáveis). 
MATERIAL PARA CULTURA CELULAR: 
Capela de fluxo laminar (Sistema de segurança I e II);
Incubadora de CO2;
Estufa;
Microscópio invertido;
Microscópio ótico;
Câmara de Neubauer;
Centrifuga;
Unidade filtrante e membrana de esterilização; 
Bomba de vácuo;
Autoclave;
Pipetas;
Vidrarias;
Garrafas de cultura;
Placas de cultura;
Ponteiras;
Eppendorfs; 
Tubos falcon.
Plásticos não tratados, servem apenas para culturas em suspensão, as placas podem ser tratadas por uma proteína.
PRINCIPAIS PROBLEMAS:
Contaminação;
Reaproveitamento do material;
Falta de materiais;
Falta de luz.
RESULTADOS CONFIÁVEIS:
Condições de culturas corretas;
Treinamento;
Respeito as condições das celulas;
Consciência da amostragem;
Não extrapolar resultados.
 	 
Células Tronco, Câncer e Métodos de Transfecção
As células-tronco podem se classificar quanto à sua origem e quanto ao seu potencial de diferenciação. 
Células Tronco Embrionárias (CTEs):
Totipotentes: capazes de se diferenciar em qualquer um dos 216 tecidos do corpo humano (inclusive a placenta e os anexos embrionários); assim que o embrião se forma, começam as primeiras divisões celulares e surgem as células totipotentes que darão origem a todos os tecidos do corpo. Não permanecem no corpo adulto.
Então se nós quisermos trabalhar com células totipotentes em laboratório seria possível? Seria, porém, precisaria gerar uma fecundação e colher as células até a divisão em 64 células. Até 14 dias depois da fecundação, as células embrionárias seriam capazes de diferenciar-se em quase todos os tecidos humanos. Depois disso, começam a dar origem a determinados tecidos.
Pluripotentes: são as células encontradas no interior do blastocisto e originam os folhetos embrionários. Podem originar qualquer célula que componha qualquer tecido do organismo;
Passando a fase de 64 células, surgem as pluripotentes, são capazes de se diferenciar na maioria dos tecidos. Não são capazes de dar origem a um novo indivíduo.
Células que são usadas em transplantes e geralmente não são rejeitadas pelo receptor.
Células Tronco Adultas, Pluri ou Multipotentes (CTAs):
A capacidade de se diferenciar em outras células também pode acontecer em CT adultas, ou seja, em CT encontradas em órgãos ou tecidos do organismo adulto. 
Multipotentes: capacidade mais restrita de diferenciação, dão origem a uma ou mais linhagens celulares;
Unipotentes: diferenciam em apenas um tipo celular.
POR QUE ESTUDAR?
Divisão e renovação por longos períodos de tempo;
Se proliferam repetidamente, enquanto algumas células não se replicam (músculos e nervos);
Produzem milhões de células em apenas alguns meses em um laboratório;
Pode ajudar a compreender o que acontece durante a divisão celular disfuncional, que conduz às células cancerosas;
Pode ajudar a responder como é regulada a proliferação e a diferenciação das células.
Não existe CT embrionárias no corpo adulto!
PRINCIPAIS USOS
Embriões recém-fecundados (blastocistos), criados por fertilização in vitro e que não serão empregados no tratamento de infertilidade; 
Embriões recém-fecundados criados a partir da inserção do núcleo de uma célula adulta em um óvulo que teve seu núcleo removido:clonagem; 
Por que não posso usar CT adultas? Por que precisa ser um óvulo?
O que sabemos é que uma vez diferenciadas, as células somáticas perdem a capacidade de originar qualquer tecido. As células descendentes de uma célula diferenciada vão manter as mesmas características daquela que as originou, isto é, células de fígado vão originar células de fígado, células musculares vão originar células musculares e assim por diante.
Terapia com CT adultas: A terapia celular é a troca de células doentes por células novas e saudáveis, e este é um dos possíveis usos para as células tronco no combate a doenças. Em teoria, qualquer doença em que houver degeneração de tecidos do nosso corpo poderia ser tratada através da terapia celular.
CT como fonte de tecidos para transplante:
Captação de pequeno tecido com células de interesse
Multiplicação dessas células em laboratório
Produção do tecido em bioreatores e materiais para os transportes celulares
Transplante do tecido -> tecido restaurado
Decelularização e Recelularização: Uma outra forma em utilizar as CT são em transplantes. O que acontece em transplantes de órgãos é a rejeição do organismo que recebe o órgão
Ex. Na UFRGS existe uma pesquisa bem interessante com órgãos retirados de ratos e porcos, em que é retirado o órgão do animal e levado ao lab onde será lavado com um detergente específico para decelularização (retirada das células) e então inseridas as CT do paciente que está precisando do órgão, fazendo o processo de recelularização. Dessa forma, quando o órgão for inserido no paciente não haverá o processo de rejeição e as CT serão programadas para atuar no órgão com as suas devidas funções. Ainda há dúvidas sobre a inserção do órgão de um animal em um ser humano.
CT de pluripotência induzida: Primeiras células troncos induzidas foram células humanas da pele foi feita uma inserção de vírus contendo 4 genes. Os genes se inserem no DNA da célula adulta (ex. pele) e reprogramam o código genético. Células voltam ao estágio de uma CT embrionária com capacidade de auto renovação e diferenciação em qualquer tecido.
Transdiferenciação das CT multipotentes: Pelo método de transdiferenciação as células da pele podem ser transdiferenciadas em células do coração, por exemplo, do sangue em do fígado, demonstrando que é possível realizar a transdiferenciação de células adultas originárias de distintos folhetos embrionários.
A diferenciação é o processo natural em que uma célula indiferenciada, ou célula-tronco, após estímulos adequados, são induzidas a se diferenciarem em células tecido-específicas, tornando-se células adultas diferenciadas. Estas células podem ser induzidas, artificialmente a se desdiferenciarem, tornando-se células indiferenciadas, ou células-tronco novamente. Já na transdiferenciação, uma célula adulta de um tecido torna-se outra célula adulta de outro tecido sem, contudo, se desdiferenciar tornando-se células-tronco. A conquista da reprogramação em células de camundongos define o cenário para uma tentativa om células humanas.
CT CORDÃO UMBILICAL X CT MEDULA ÓSSEA
Dentre as funções, características e fontes das CT que vimos até o momento, vocês acreditam que as CT do cordão umbilical são mais eficientes que as CT da medula? Ou vice-versa? 
CÉLULAS DO CORDÃO UMBILICAL: São CT multipontentes com capacidade restrita de multiplicação, no entanto, a dificuldade do uso dessas células seria a compatibilidade de sangue quanto ao receptor e ao doador. Atualmente são utilizadas em tratamentos de desordens hematológicas e em experimentos clínicos para tratamento de doenças autoimunes e degenerativas. Desde 1992 são armazenadas em bancos de células-tronco do sangue do cordão umbilical, onde os pais têm a possibilidade de resguardá-las para um possível tratamento de uma doença que venha acometer seus filhos.
CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA: Células-tronco hematopoiéticas, são encontradas em todos os tipos de células do sangue no corpo. As células da medula óssea podem sofrer dois processos de diferenciação mononucleares (indiferenciadas) e as multinucleares.
Experiências recentes já demonstraram que o sangue do cordão umbilical é o melhor material para substituir a medula em casos de leucemia. 
Os adultos conservam células – por exemplo, na medula óssea – que têm a capacidade de diferenciar-se em vários tecidos, mas não em todos. Elas também existem no cordão umbilical, mas já são células-tronco adultas que não conservam a capacidade das células embrionárias.
PATENTES
Na maioria dos países do mundo, inclusive no Brasil, o patenteamento de células-tronco é proibido.
TRANSFORMAÇÃO CELULAR
No momento em que as características genéticas das células são modificadas, elas deixam de ser semelhantes morfológica e geneticamente ao tecido original e são então chamadas células transformadas. Tais células podem ser transformadas em cultura utilizando-se substâncias químicas, vírus ou agentes físicos como a luz ultravioleta.
As células tronco cancerígenas surgiam de células tronco normais.
Hipótese genética do câncer
Teria monoclonal
O câncer resulta da proliferação descontrolada de uma única célula instável.
Por que uma única célula seria capaz de dar origem ao câncer e outro número grande de células não dá origem a um tumor cancerígeno? 
Pois a transformação maligna requer mais do que uma alteração genética. A transformação maligna passa por múltiplas etapas caracterizado pela progressão das alterações genéticas. Mesmo depois de se tornar maligna, a célula continua a acumular mutações que torna mais agressiva, fornecendo a esta célula instabilidade genética.
PRINCÍPIOS BÁSICOS DA CARCINOGÊNESE
A carcinogênese é um processo multi etapas: as alterações genéticas resultam em acúmulo de novas mutações. Embora os tumores tenham origem monoclonal com o tempo os constituintes celulares se tornam extremamente heterogêneos (subclones).
Um dos pontos chaves para o avanço das pesquisas sobre o câncer foi a descoberta de que na célula há genes específicos que podem sofrer mutação ou alterações, e esses genes são os responsáveis pelo desenvolvimento do câncer no organismo.
Quais são os genes que podem sofrer mutação? 
Genes envolvidos na: progressão de uma célula ao longo do ciclo celular/ adesão de uma célula a suas células vizinhas/ apoptose/ reparo de danos do DNA.
Proto-oncogenes (promotores de crescimento): são genes normais que pela mutação passam a se tornar oncogenes devido mutações na estrutura do gene ou mutações na regulação da expressão gênica. Considerados dominantes, transformam as células mesmo na presença de seu alelo normal. Mutação induziu aumento na expressão do gene e leva a um câncer (oncogenes é a forma hiperativa e mutada dos proto-oncogenes).
Genes supressores tumorais (inibidores de crescimento).
Genes reguladores da apoptose: podem se comportar tanto como proto-oncogenes como supressores tumorais.
Genes envolvidos no reparo do DNA (principal alvo das mutações): não agem diretamente na transformação das células. Referem se a capacidade do organismo em reparar mutações nos genes vistos anteriormente. A incapacidade de reparar o DNA predispõe a mutações nesses genes.
TRANSFORMAÇÃO CELULAR EM LABORATÓRIO
Clonagem molecular: Clonagem gênica consiste em introduzir o gene dentro de células bacterianas e isolá-las em colônias. As células de cada colônia são idênticas entre si.
O processo de transformação consiste na introdução de um DNA exógeno em células hospedeiras, que podem ser: bactérias, leveduras, fungos filamentosos, células vegetais e células de mamíferos. A célula mais comumente utilizada é a célula bacteriana de Escherichia coli.
TRANSFECÇÃO: TRANSFERÊNCIA DE GENES
A atração do DNA pelas células bacterianas, em condições naturais, é um evento muito raro, devido à ocorrência da repulsão eletrostática entre as cargas negativas dos fosfolipídeos da membrana e as cargas negativas dos grupamentos fosfatos da molécula de DNA.
Então começaram a pensar em substâncias que poderiamse ligar no DNA e neutralizá-lo eletricamente, facilitando sua incorporação pelas células.
Métodos químicos
Métodos físicos
CARACTERÍSTICAS:
Células com características tumorais/ cancerígenas. 
Quando alterações na linhagem celular afetam o controle do ciclo celular 
Morfologia alterada 
Alta taxa de crescimento 
Menor dependência de soro e de ancoragem 
Aumento da variação cromossômica entre células 
Vantagem: Quantidade de células é praticamente ilimitado 
Desvantagem: Células mantêm poucas características originais do tecido proveniente.