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Biotecnologia vegetal descreve um processo preciso em que técnicas científicas são usadas para 
desenvolver plantas úteis e benéficas. 
 No começo do século XX, East e Shull (Estados Unidos) começaram experimentos de 
autofecundação em milho que levariam à obtenção do milho híbrido. 
 Em 1918, Jones propôs o híbrido duplo para cultivares comerciais, o que popularizou o 
milho híbrido. 
 Cultura de tecidos de plantas (clonagem de plantas); 
 • Tecnologia do DNA recombinante (clonagem de genes) 
Aspecto geral de um laboratório de biotecnologia vegetal 
• Sala de preparação com bancadas exclusivas para preparação de material biológico, soluções 
e meios de cultura. 
 Sala de estoque - Almoxarifado Armário para produtos perigosos 
• Sala de lavagem e esterilização: Pias com água quente, autoclave, destiladores e 
deionizadores, estufas de secagem, estantes para vidrarias. 
•Câmeras de fluxo laminar, em ambiente apropriado para cultivo in vitro, equipadas com 
microscópios estereoscópico para auxílio do resgate do explante. 
•Área de genômica: 
–Bancadas dispostas paralelamente para preparo de material a ser analisado via marcadores de 
DNA e seqüenciamento genético. 
–Seqüenciador automático, conectado a computador exclusivo para análise genômica. 
–Termocicladores, geladeira e freezer para uso exclusivo da respectiva área. 
•Sala de armazenagem de material sob refrigeração, evidenciando-se freezer – 20ºC, geladeira 
e freezer – 80ºC (à esquerda). 
•Área de transformação genética: Acelerador de partículas dentro de capela de exaustão de 
gases. 
•Área de genética molecular: 
–Bancadas acessíveis para as atividades de extração de DNA, proteínas e isoenzimas, capela de 
exaustão de gases e pia exclusiva para a respectiva área. 
–Bancada exclusiva para eletroforese. 
•Área de citogenética molecular: 
–Microscópios ótico e estereoscópico. 
–Bancada de trabalho com microscópios ótico. 
Infra-estrutura necessária em um laboratório de cultura de tecidos 
1) Sala de crescimento 
• Lâmpadas fluorescentes branco-frias (+/- 42 μmol.m-2.s-1); 
• Painel com interruptores de energia (controle das lâmpadas por bloco) e timer para controle 
do fotoperíodo (16 h de luz); 
• Agitador orbital para culturas celulares; 
• Estufa de fotoperíodo tipo BOD; 
• Ar condicionado para controle da temperatura (+/- 25ºC) 
• Sala aclimatizada para indução e regeneração de plantas in vitro. 
2) Sala de transferência/inoculações 
•Câmaras de fluxo laminar horizontal (assepsia) 
3) Sala de preparações 
•Forno de microondas; 
•Balança eletrônica analítica; 
•pHmetro; 
•Agitador/aquecedor; 
•Estereomicroscópio; 
•Geladeira duplex. 
4 e 5) Sala de lavagem e esterilização 
•Destilador; 
•Deionizador; 
•Estufa de secagem e Autoclave. 
Áreas externas 
•Casa de vegetação; 
•Estufa/Telado. 
 Plantas transgênicas 
RESISTÊNCIA: Parlevliet (1997): É a habilidade da planta em suprimir, retardar ou prevenir a 
entrada ou a subsequente atividade do patógeno (crescimento e desenvolvimento) em seus 
tecidos - forma mais abrangente e clara. 
TOLERÂNCIA: Caldwell et al. (1958): É a capacidade das plantas suportarem a doença sem 
perdas severas em produtividade ou qualidade. Camargo (1995): É a capacidade inerente ou 
adquirida de uma planta em suportar a infecção por patógeno (fungo, vírus, nematóides, 
bactérias, etc) sem que ocorram danos significativos em sua produção. 
Contribuição dos cultivos biotecnológicos para a segurança alimentar, sustentabilidade e 
mudanças climáticas: •Aumento da produtividade das culturas em 574 milhões de toneladas 
(~US$ 167,8 bilhões em1996-2015; 
•75 milhões de toneladas avaliadas em US$ 15,4 bilhões apenas em 2015; 
•Além disso, se a biotecnologia não estivesse disponível para as culturas de soja, milho, algodão 
e canola plantadas em todo o mundo em 2016, seriam necessários 19,4 milhões de hectares a 
mais para obter a mesma produção (atualmente 1,5 bilhões de hectares); 
•Reduziu a emissão de CO2 em 26,7 bilhões de kg em 2015, equivalente a retirar 11,9 milhões 
de carros nas ruas por um ano. Proporcionou um ambiente melhor, economizando 620 milhões 
de kg de ingrediente ativo de pesticidas de 1996 – 2015, e em 37,4 milhões de hectares apenas 
em 2015; 
•Reduziu a aplicação de pesticidas, economizando 8,1% entre 1996 – 2015, e 6,1% apenas em 
2015; 
Lei Nacional de Biossegurança Lei nº 11.105, de 24 de março de 2005: 
 Regulamenta os incisos II, IV e V do § 1º do art. 225 da Constituição Federal; 
 Estabelece normas de segurança e mecanismos de fiscalização de atividades que 
envolvam organismos geneticamente modificados – OGM e seus derivados; 
 Cria o Conselho Nacional de Biossegurança – CNBS; 
 Reestrutura a Comissão Técnica Nacional de Biossegurança – CTNBio; 
 Dispõe sobre a Política Nacional de Biossegurança – PNB; 
 
 
OGM: organismo cujo material genético – ADN/ARN tenha sido modificado por qualquer técnica de engenharia genética; 
Derivado de OGM: produto obtido de OGM e que não possua capacidade autônoma de replicação ou que não contenha 
forma viável de OGM; 
Clonagem: processo de reprodução assexuada, produzida artificialmente, baseada em um único patrimônio genético, 
com ou sem utilização de técnicas de engenharia genética; 
Não se inclui na categoria de OGM o resultante de técnicas que impliquem a introdução direta, num organismo, de 
material hereditário, desde que não envolvam a utilização de moléculas de ADN/ARN recombinante ou OGM, inclusive 
fecundação in vitro, conjugação, transdução, transformação, indução poliplóide e qualquer outro processo natural. Não 
se inclui na categoria de derivado de OGM a substância pura, quimicamente definida, obtida por meio de processos 
biológicos e que não contenha OGM, proteína heteróloga ou ADN recombinante. 
Organismo geneticamente modificado - OGM: organismo cujo material genético – ADN/ARN tenha sido modificado por 
qualquer técnica de engenharia genética. 
Transgênico: indivíduo no qual um transgene foi integrado ao seu genoma. 
Organismo geneticamente modificado (OGM): organismo que foi transformado pela introdução e integração de um ou 
mais genes exógenos ou transgenes. 
Lembrando que ambos definem transgene como sendo: um gene exógeno integrado em um genoma hospedeiro por 
evento de transformação. 
De acordo com a comunidade científica, OGMs e transgênicos não são sinônimos: “Todo transgênico é um organismo 
geneticamente modificado, mas nem todo OGM é um transgênico”. 
 Um transgênico é um organismo que possui uma sequência de DNA ou RNA, ou parte do material genético de outro 
organismo, pode até ser de uma espécie diferente. 
Enquanto que, um OGM é um organismo que foi modificado geneticamente, mas que não recebeu nenhuma região de 
outro organismo. 
 
 O processo de transformação genética: É a introdução 
“controlada” de genes oriundos de diferentes espécies 
vegetais, animais ou microrganismos, em um genoma 
vegetal receptor, de modo independente da 
fecundação. 
•É baseada na tecnologia do DNA recombinante. 
•O gene adicional é denominado transgene. 
–O transgene passa a integrar o genoma hospedeiro; 
–O novo caráter dado por ele é transmitido à 
descendência. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Assim como para o gene de interesse, os passos anteriores (conhecer a função do gene (rota 
metabólica); conhecimento da sequência; enzimas e sítios de restrição e compatibilidade da 
enzima) devem ser feitos para: o promotor, terminador, e, para os demais genes de seleção ou 
screening (marcadores e de resistência), juntamente com seus promotores e terminadores. 
•Os genes podem ser obtidos de diferentes formas: isolados do próprio organismodoador, 
sintetizados, ou, obtidos por permuta ou comprado de “alguém” que já o isolou. 
•Uma vez selecionados e obtidos os genes, eles devem ser colocados dentro de um vetor de 
clonagem para a obtenção de inúmeras cópias e dar seguimento a transformação. 
Três sistemas de vetores são utilizados em plantas superiores: 
1.Vetores baseados em plasmídeos de Agrobacterium de ocorrência natural. 
O plasmídeo Ti (Tumour inducing) da Agrobacterium tumefaciens é um plasmídeo bacteriano de 
grande importância. É um plasmídeo grande, superior a 200 Kb, que transporta numerosos 
genes envolvidos no processo de infecção. 
•Uma das principais características do plasmídeo Ti é que, após a infecção, uma parte da 
molécula é integrada no DNA cromossomal da planta. 
Pré-requisitos para a obtenção de uma planta 
transgênica ou geneticamente modificada 
#Ter domínio das técnicas de cultura de tecidos 
(propagação e regeneração); 
#Ter um método eficiente de introdução do 
transgene (método de transformação); 
#Ter agentes seletivos para identificar os 
tecidos “transgênicos”. 
 
Passos necessários para a obtenção de uma planta transgênica ou 
geneticamente modificada 
1) Isolamento e clonagem de um gene útil (gene de interesse = 
transgene); 
2) Transferência desse gene (transgene) para dentro da célula vegetal; 
3) Integração desse gene (transgene) ao genoma da planta; 
4) Regeneração de plantas a partir da célula transformada; 
5) Expressão do gene (transgene) introduzido nas plantas regeneradas; 
6) Transmissão do gene (transgene) introduzido para as próximas 
gerações. 
 
•Este segmento, chamado de T-DNA, tem entre 15 e 30 Kb de comprimento. Mantém-se numa 
forma estável no interior da célula vegetal e é transmitido às células filhas como uma parte 
integrante dos cromossomos. 
•A característica mais importante do plasmídeo Ti é que o T-DNA contém 8 ou mais genes que 
se exprimem na célula vegetal e que são responsáveis pelas propriedades cancerígenas das 
células transformadas. Estes genes são também responsáveis pela síntese de compostos pouco 
usuais denominados opinas, que as bactérias utilizam como nutrientes. 
•Em resumo, a A. tumefaciens manipula geneticamente a célula vegetal para o seu próprio 
interesse. 
a) A utilização do plasmídeo Ti para introduzir novos genes numa célula vegetal 
•O plasmídeo Ti é utilizado para transportar novos genes para células vegetais. 
•É necessário inserir os novos genes no T-DNA e depois cabe à bactéria o trabalho de os integrar 
no DNA cromossomal da planta. 
2.Transferência direta de genes utilizando fragmentos de DNA não ligados a um vetor de 
clonagem (uso de vários tipos de plasmídeos). 
A transferência direta de genes é baseada no fato de que um plasmídeo bacteriano, embora 
incapaz de se autorreplicar no interior da célula vegetal, pode ser integrado por recombinação 
em um dos cromossomas da planta. 
•A recombinação não é bem compreendida, mas é quase certo que é diferente dos processos 
responsáveis pela integração do T-DNA. 
•É também diferente da integração cromossomal de um vetor de levedura, Pois não é necessária 
uma região de homologia entre o plasmídeo bacteriano e o DNA da planta. A recombinação 
parece ocorrer ao acaso em qualquer posição e em qualquer um dos cromossomas da planta. 
3.Vetores baseados em vírus de plantas. 
•A maioria das plantas estão sujeitas a infecções virais, o que era de supor que os vírus poderiam 
ser também utilizados para clonar genes em plantas, no entanto, a maioria dos vírus de plantas 
possuem genomas de RNA e não de DNA. 
•Os vírus com RNA não são tão úteis como vetores de clonagem porque a manipulação do RNA 
é muito mais difícil de executar. 
•Duas classes de vírus com DNA são capazes de infectar plantas superiores, os caulimovírus e 
os geminivírus, porém, nenhum deles é apropriado para a clonagem de genes. 
Problemas com a clonagem de genes em plantas 
monocotiledôneas (trigo, cevada, arroz e milho): 
•1ª dificuldade: na natureza, A. tumefaciens e a A. 
rhizogenes infectarem apenas dicotiledôneas. 
•2ª dificuldade: a transformação com um vetor de 
Agrobacterium envolve a regeneração de uma 
planta intacta a partir de um protoplasto 
transformado ou de culturas de células ou calos. A 
facilidade com que uma planta pode ser 
regenerada depende muito da espécie envolvida e, 
O processo de recombinação que 
integra DNA plasmídico num 
cromossomo vegetal parece ser 
igualmente eficiente tanto para as 
monocotiledôneas como para as 
dicotiledôneas. Assim sendo, a 
transferência direta de genes é uma 
forma eficaz de obter células 
transformadas de monocotiledôneas. 
 
novamente, as plantas que apresentam as maiores dificuldades são as monocotiledôneas. 
3ª dificuldade: pelos métodos padrões para a transferência direta de genes, o transformante 
inicial é um protoplasto o que faz com que a dificuldade em regenerar uma planta intacta 
continua a manter-se. 
•Solução: bombardeamento por microprojéteis para introduzir DNA plasmídico diretamente 
nos embriões das plantas. Embora seja um procedimento de transformação bastante violento, 
não parece ser muito prejudicial para ao embriões, que continuam o seu desenvolvimento 
normal para produzir plantas adultas. Este procedimento tem sido bem sucedido com o milho e 
outras monocotiledôneas importantes. 
Quanto às características modificadas através da transformação genética 
•Características do tipo input ou 1ª geração: 
–conferem vantagens simples, 
–dependentes de um ou poucos genes (maioria das plantas transgênicas): 
•relacionadas com o processo produtivo; 
•visam a redução do custo de produção; 
Ex.: tolerância a herbicidas; resistência a doenças; resistência a insetos. 
•Características do tipo output ou 2ª geração: 
–conferem melhoria na qualidade do produto: 
•relacionadas com o consumidor; 
•visam agregar valor ao produto final; 
Ex.: maior qualidade nutricional; maior conservação pós-colheita. 
 
Transformação genética de plantas 
 
Etapas da transformação 
1) Identificar um gene de interesse; 
2) Isolamento do gene de interesse; 
3) Construção do cassete gênico (construto) com o transgene de interesse; 
4) Preparação do vetor de transferência; 
5) Transferência para o genoma alvo; “escolha do método de transformação” 
6) Seleção do material transformado: 
a) Integração do transgene ao genoma da planta; 
b) Regeneração de plantas a partir da célula transformada; 
c) Expressão do transgene introduzido nas plantas regeneradas; 
d) Transmissão do transgene introduzido de geração em geração. 
 
Produção de linhagens desarmadas de Agrobacterium e remoção de oncogenes 
A) Um plasmídeo contendo regiões de homologia com o T-DNA, no caso, o pBR322 (pBR) é 
introduzido em Agrobacterium. 
B) Por meio de uma dupla recombinação, o plasmídeo pBR se integra ao plasmídeo Ti causando 
uma deleção. 
C) O plasmídeo pBR não se replica em Agrobacterium e apenas os recombinantes são 
selecionados pela resistência à ampicilina. 
A região deletada contém os oncogenes e não se mantém porque não apresenta origem de 
replicação. 
Sistema de vetores de Agrobacterium para transformação 
 Por causa do seu tamanho (~200pb), o plasmídeo Ti não pode ser manipulado 
diretamente. Desta forma são utilizados plasmídeos menores (vetores), mais fáceis de 
manipular, com as extremidades do T-DNA e entre elas é feita a clonagem. Estes 
vetores podem ser do tipo co-integrado (intermediário) ou binário. 
A) Vetores co-integrados: são originados de vetores intermediários e geralmente possuem 
origem de replicação do tipo ColE 1, e, não se replicam em Agrobacterium. 
B) B) Vetores binários: podem se replicar tanto em Escherichia coliquanto em 
Agrobacterium, e, se mantém de forma independente do plasmídeo Ti. 
•Os vetores intermediários podem integrar-se ao plasmídeo Ti graças a um processo de 
recombinação simples, por uma região de homologia com o T-DNA da linhagem 
desarmada, formando o vetor co-integrado. 
•A eficiência de transferência do T-DNA para as células vegetais é a mesma nos dois 
sistemas. 
•No entanto, o sistema de vetores binários tem sido mais utilizado, pois a eficiência na 
obtenção de linhagens recombinantes de Agrobacterium é cerca de 100 vezes maior do 
que em sitemas co-integrados. 
•Obs.: Mas lembrem-se: Agrobacterium só é eficiente para transformar plantas 
dicotiledôneas. 
 
Métodos de transformação para a obtenção de um vetor binário ou co-integrado 
(intermediário): 
 
1.Conjugação triparental: Agrobacterium e Escherichia coli com auxílio do pRK2013 
helper 
•A conjugação triparental é um método indireto. 
•Método simples e eficiente. 
•Não requer equipamentos específicos. 
•É feito através de co-cultivo. 
•Após a transferência, apenas as linhagens recombinantes de Agrobacterium são 
selecionadas, com os antibióticos apropriados. 
•A desvantagem é que pode ocorrer alterações no plasmídeo introduzido em função da 
recombinação com o plasmídeo helper e o procedimento leva até 4 dias. O plasmídeo 
helper não se replica em Agrobacterium e é eliminado. 
 
2.Eletroporação: A eletroporação é um método direto, simples e eficiente e bastante 
utilizado. A única desvantagem é que requer um eletroporador e uma fonte de alta 
voltagem. 
 
3.Choque térmico: É um método direto e o princípio é a alteração da permeabilidade 
da membrana em condições extremas de temperatura (de - 80 ou em nitrogênio líquido 
a 37°C), permitindo a passagem do vetor, binário ou intermediário (co-integrado) para 
a Agrobacterium receptora. A vantagem é a redução do tempo, normalmente 3 dias e 
quando comparado à conjugação, as chances de alterações do DNA são mínimas. 
 
Plasmídeos prontos para a co-transformação Após todo o processo de montagem do plasmídeo 
(construto) em um único ou dois plasmídeos separados e clonagem dos mesmos em células 
competentes para obtenção de inúmeras cópias, seguimos então para a transformação 
propriamente dita (método). 
Importante: cada passo de clonagem, o gene ou o cassete gênico deve ser controlado por 
enzima de restrição, cortando com diferentes enzimas e controlando os fragmentos gerados 
com DNA marker. 
1º Quantificação da amostra: comparação por intensidade da banda com o DNA marker; 
2º Quantificação da amostra através de espectrofotômetro. 
Obs.: A obtenção dos fragmentos de DNA envolve sempre a sua purificação a após a clonagem 
e multiplicação em células competentes. 
Transferência de Genes para Espécies Vegetais: Métodos Diretos ou Indiretos de 
Transformação. 
1. MÉTODOS DIRETOS 
 Modificações nas paredes e membranas celulares 
 Extensivamente adotados 
Não requerem a utilização de vetores biológicos 
Uso de protoplastos: dificultam a regeneração 
 Variam em eficiência e praticidade Eficiência: Depende da espécie em estudo, do tecido usado 
e parâmetros otimizados para cada técnica 
Técnicas de alta eficiência: Eletroporação de protoplastos; Transformação por polietilenoglicol; 
Aceleração de partículas – biolística. 
Técnicas de baixa eficiência: Micro e macroinjeção; Raios laser; Microfibras de carboneto de 
silício; Ultra-som. 
2. MÉTODOS INDIRETOS 
 Vetor: media a transferência de genes: Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium 
rhizogenes; 
Método bastante usado; 
 Baixa eficiência na maioria das monocotiledôneas e gimnospermas. 
Aumento da eficiência: 
Cepas supervirulentas de 
bactéria e adição de 
compostos fenólicos ao 
meio de cultivo. 
 
 
 
 
Infecção por A. tumefaciens 
 Parte do plasmídeo Ti, T-DNA ou DNA de transferência, é transferido para a célula vegetal e 
integrado no genoma; 
Genes do T-DNA: 
- Expressos somente nas células vegetais 
- Produção excessiva de hormônios (AIA e CK) 
- Aumento da sensibilidade das células vegetais 
- Formação de tumores 
- Produção de opinas “genes do T-DNA em células ou tecidos transformados pode impedir a 
regeneração de plantas normais” 
 Solução do problema: desarmamento da Agrobacterium por remoção ou inativação dos genes. 
Células transformadas podem ser identificadas pela inclusão de: 
- genes marcadores no T-DNA (uidA- β-glucuronidase) 
- genes de resistência a antibióticos: hpt II (higromicina) ou npt II (canamicina) 
Infecção por Agrobacterium: 
- Requer um ferimento no tecido vegetal 
- Excreção de compostos fenólicos reconhecidos pela bactéria. 
Moléculas responsáveis pela início da transferência do T-DNA: 
 acetosiringona (AS) 
 hidroxi-acetosiringona (OH-AS) 
 chalconas 
 derivados do ácido cinâmico 
Transferência do T-DNA para as células vegetais: 
 Semelhante à conjugação bacteriana 
 Genes responsáveis pela transferência - localizados na região de virulência (vir) do 
plasmídeo Ti 
 
 
Agrobacterium 
Importância: 
 Capacidade natural de introduzir DNA em plantas hospedeiras 
 DNA integrado passa a ser expresso como parte do genoma da planta 
Conseqüência dessa expressão: Padrão normal de desenvolvimento é 
alterado 
 A. tumefaciens - formação de tumores 
 A. Rhizogenes - proliferação de raízes 
 
Interação bactéria/parede celular vegetal 
- Período de cultivo, ocorre divisão e diferenciação 
- Síntese de novas paredes celulares 
- A bactéria produz grandes quantidades de material celulósico 
- Interação entre os polissacarídeos da parede celular vegetal e as fibrilas de celulose produzidas 
pela bactéria 
- Ativação dos genes (região vir) seguida de mudanças no T-DNA 
- Completa transferência para o núcleo da célula vegetal. 
 Incorporação do T-DNA no genoma da planta 
- Sugere-se que ocorra de maneira aleatória 
- Pode ser um evento de recombinação ilegítima ou não homóloga. 
 Gene Gun: 
1) DNA + ouro ou tungstênio – distribuído numa membrana 
2) Preparação das células vegetais 
3) Screening com GUS 
4) Screening com antibiótico 
5) Regeneração das células transformadas. 
 
ORGANOGÊNESE: Com o desenvolvimento de novas técnicas biotecnológicas, é possível a 
introdução no genoma vegetal de genes de outras plantas ou outros organismos pela 
transformação genética. Entretanto, um dos principais requisitos para o sucesso desta 
técnica é a existência de uma metodologia eficiente de regeneração de plantas in vitro.