Baixe o app para aproveitar ainda mais
Prévia do material em texto
Universidade de Sa˜o Paulo Instituto de F´ısica de Sa˜o Carlos Laborato´rio de bioqu´ımica para CFBio Pra´tica 4: Obtenc¸a˜o e quantificac¸a˜o da case´ına e determinac¸a˜o de sua massa molecular Pedro Vin´ıcius Alves Rafael Stutz Vinicius El Khalili Borsato Abril 2019 Suma´rio 1 Obtenc¸a˜o da case´ına 2 1.1 Fundamentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1.2 Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1.3 Resultados e discussa˜o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 Quantificac¸a˜o da concentrac¸a˜o de case´ına 3 2.1 Fundamentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2.2 Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2.3 Resultados e discussa˜o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2.4 Determinac¸a˜o da Concentrac¸a˜o de Case´ına . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 Eletroforese 5 3.0.1 Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 4 Questo˜es 12 5 Bibliografia 12 1 Obtenc¸a˜o da case´ına blabla [1] 1.1 Fundamentos A case´ına e´ uma famı´lia de prote´ınas encontradas no leite, compondo 80% das prote´ınas encontradas no leite bovino e 20-45% das prote´ınas encontradas no leite humano. Alimentos derivados do leite - manteiga, queijo, sorvete etc. - sa˜o ricos em case´ına, tornando-a uma prote´ına fortemente presente em nossa alimentac¸a˜o dia´ria. A famı´lia de case´ınas presentes no leite bovino e´ composta por quatro tipos de case´ına: αS1, αS2, β e κ. As case´ınas αS1, αS2 e β sa˜o ricas em grupos fosfato, facilitando sua solubilidade em a´gua, enquanto a case´ına κ e´ uma glicoprote´ına hidrof´ılica. O ponto isoele´trico da case´ına bovina e´ aproximadamente 4.60. O pH do leite bovino usalmente encontra-se entre 6.4 e 6.8, o que significa que a case´ına presente no leite tem uma carga total negativa. Quando sujeita a um pH em 4.60, a case´ına torna-se neutra e insolu´vel, precipitando. 1.2 Objetivos Extrac¸a˜o da case´ına a partir de uma amostra de leite bovino em po´. 1.3 Resultados e discussa˜o Apo´s o teste do fosfato resultar em negativo, esperamos a sedimentac¸a˜o da u´ltima lavagem da case´ına, pore´m sem resultados. A tentativa de filtrar nossa soluc¸a˜o, por consequente, falhou e, portanto, na˜o fomos capazes de realizar a extrac¸a˜o. Os experimentos a seguir foram realizados com uma soluc¸a˜o padra˜o oferecida pelo te´cnico do laborato´rio. 2 2 Quantificac¸a˜o da concentrac¸a˜o de case´ına 2.1 Fundamentos Por meio da diluic¸a˜o da case´ına e a utilizac¸a˜o do espectrofotoˆmetro, aplicamos a Lei de Beer- Lambert para determinarmos a concentrac¸a˜o da soluc¸a˜o. A = C�L (2.1) 2.2 Objetivos Determinar a concentrac¸a˜o da case´ına dilu´ıda por meio da relac¸a˜o de Beer-Lambert 2.3 Resultados e discussa˜o Para adquirirmos uma soluc¸a˜o com absorbaˆncia entre 0.1 e 0.7, dilu´ımos nossa amostra inicial de case´ına um total de 20 vezes, utlizando um tampa˜o borato. Utilzando do banco de dados ExPASy e o programa ProtParam Tool, encontramos que os seguintes paraˆmetros para a prote´ına analisada: coeficiente de extinc¸a˜o molar(25900) e massa molar(aproximadamente 23 KDa). Ccasein = 2.478.10−5mol/L (2.2) Multiplicando pelo fator de diluic¸a˜o e pela massa molar da case´ına(aproximadamente 23 kDa), obtemos: Ccasein = 11.5g/L (2.3) Infelizmente, pela extrac¸a˜o da case´ına ter falhado, na˜o podemos dizer nada acerca do rendimento desse procedimento. 2.4 Determinac¸a˜o da Concentrac¸a˜o de Case´ına A segunda parte consiste em obter a concentrac¸a˜o da amostra obtida de caseina a partir de uma curva de padronizac¸a˜o de uma amostra conhecida de case´ına, disponibilizada em laborato´rio. A amostra dispon´ıvel possui concentrac¸a˜o de 2%(m/v), ou seja, 0.02g/ml = 20mg/ml. A fim de obter a curva de padronizac¸a˜o, preparou-se seis amostras a partir da case´ına padra˜o e duas amostras teste a partir da case´ına obtida. Para cada amostra, mediu-se a absorbaˆncia da case´ına no espectrofotoˆmetro em 550nm. A partir do coeficiente angular obtido pela regressa˜o linear do gra´fico absorbaˆncia x mg/ml(proteina) para a soluc¸a˜o padra˜o, podemos estimar a concentrac¸a˜o da caseina obtida em termos de sua absorbaˆncia, comparando-a a` curva de padronizac¸a˜o. Tabela 1: Volumes de reagentes adicionados para construc¸a˜o da curva de padronizac¸a˜o da case´ına. 3 Tubo Soluc¸a˜o padra˜o (ml) Borato (ml) Biureto (ml) Absorbaˆncia (λ = 550nm) A 1.0 0.0 4.0 0.703 B 0.8 0.2 4.0 0.642 C 0.6 0.4 4.0 0.532 D 0.5 0.5 4.0 0.446 E 0.4 0.6 4.0 0.385 F 0.2 0.8 4.0 0.190 T1 1.0 0.0 4.0 0.059 T2 0.5 0.5 4.0 0.062 Para obter a curva, realizou-se uma regressa˜o linear da concentrac¸a˜o de prote´ına em func¸a˜o da absorbaˆncia para a soluc¸a˜o padra˜o. relatorio.png Figura 1: Curva de padronizac¸a˜o da case´ına. 4 Tabela 2: Concentrac¸a˜o x absorbaˆncia Tubo Concentrac¸a˜o (mg/ml) Absorbaˆncia (λ = 550nm) A 4.0 0.703 B 3.2 0.642 C 2.4 0.532 D 2.0 0.446 E 1.6 0.385 F 0.8 0.190 T1 ? 0.059 T2 ? 0.062 Atrave´s da regressa˜o linear, obteve-se a curva de padronizac¸a˜o da case´ına, dada pela func¸a˜o C(Abs) = 0.16Abs+ 0.10. Tomando as absorbaˆncias das soluc¸o˜es teste T1 e T2, obtem-se, aproxi- madamente, C(T1) = 0.1193 e C(T2) = 0.1198. Contudo, como ha´ o dobro de case´ına em T1 em relac¸a˜o a T2, a concentrac¸a˜o desse, portanto, deveria ser maior. Como claramente na˜o houve perda durante o preparo da soluc¸o˜es ate´ a sua medida no espectofotoˆmetro, provavelmente o grupo colocou a mesma concentrac¸a˜o em ambos os tubos, de modo a obter valores aproximadamente ideˆnticos. 3 Eletroforese A eletroforese e´ um me´todo que utiliza a migrac¸a˜o de mole´culas ionizadas, de acordo com carga ele´trica e massa molecular, por um gradiente de potencial ele´trico. Enta˜o, ela proporciona uma separac¸a˜o de mole´culas com base em seu tamanho, a medida em que cada mole´cula adquire uma velocidade diferente quando aplicado um campo ele´trico. Na pra´tica, observamos a migrac¸a˜o de uma prote´ına (case´ına) por um gel de poliacrilamida em uma estrutura submetida a uma fonte de tensa˜o. O gel, por sua vez, e´ uma substaˆncia bastante inativa, ou seja, na˜o reage quimicamente com a case´ına (isso possibilita que a prote´ına se desloque por seus poros e “canais” sem sofrer alterac¸o˜es qu´ımicas). As prote´ınas podem adquirir cargas positivas ou negativas em func¸a˜o do pH do meio, e por isso e´ necessa´rio utilizar uma soluc¸a˜o tampa˜o para a manutenc¸a˜o do pH. O tampa˜o aplicado possui substaˆncias como o Tris-HCl e o SDS, que quebram as interac¸o˜es na˜o covalentes da case´ına, promovendo um processo de desnaturac¸a˜o proteica. Ale´m disso, o SDS se liga a` prote´ına, o que lhe confere uma carga total negativa. Consequentemente, a case´ına ira´ migrar do polo negativo para o positivo. Caso uma mistura de prote´ınas seja submetida a eletroforese, espera-se que cada mole´cula se mantenha em uma faixa estreita do gel. Abaixo temos uma representac¸a˜o esquema´tica da unidade de eletroforese e a fonte de tensa˜o (e´ va´lido notar que no experimento realizado a unidade de eletroforese estava disposta na vertical): 5 Figura 2: Caption 3.0.1 Resultados Obtendo a distaˆncia referentes ao marcado, em preto na imagem do gel, conseguimos os dados necessa´rios para calcular Rf. Com o aux´ılio de uma tabela com valores padro˜es para a massa molar desses marcadores adquirimos tambe´m o valor de log(massa molar) e plotamos ambos no gra´ficos apresentado abaixo. 6 Figura 3: Caption 7 Tabela 3: log(MM) x Rf log(MM) Dist(cm) Rf 4.18 1.10 0.275 3.80 1.45 0.362 3.58 1.75 0.437 3.36 2.25 0.5623.17 2.55 0.637 2.99 3.00 0.750 2.66 3.75 0.937 8 Figura 4: Caption 9 Figura 5: Caption Como os pontos do marcador esta˜o em vermelho, para a reta padra˜o, obtive´mos a seguinte equac¸a˜o: log(MM) = −2.19Rf + 4.63. Com isso, fomos capazes de, usando as bandas descritas abaixo e apresentadas por trac¸os vermelhos na imagem do gel e em azul no gra´fico, encontrar valores para os componentes separados da case´ına. Banda Rf MM(kDa) 1 0.275 53.13 2 0.575 29.10 3 0.837 16.37 Comparando com os dados da literatura, nossa eletroforese resultou em, provavelmente, Soroal- bumina(MM = 66 kDa), alfa1-case´ına(MM = 23 kDa) e alfa-lactoglobulina(MM= 14.17 kDa). Por mais que a soroalbumina na˜o fosse esperada, conseguimos obter a alfa1-case´ına e na˜o a alfa2 ou beta, comprovando a sua maior quantidade na soluc¸a˜o analisada 10 Figura 6: Caption 11 4 Questo˜es 1)Esta e´ a reac¸a˜o da formac¸a˜o da colorac¸a˜o amarela entre a soluc¸a˜o de molibdato de amoˆnio com o fosfato. Ela ocorre na presenc¸a de , pois e´ necessa´rio um meio a´cido, sendo que o precipitado amarelo cristalino e´ o fosfomolibdato de amoˆnio produzido pela reac¸a˜o. Ale´m disso, empregamos na equac¸a˜o o molibdato de amoˆnio e na˜o sua fo´rmula comercial (paramolibdato de amoˆnio) por uma questa˜o de simplicidade, o que na˜o implica em um erro, pois os ı´ons da equac¸a˜o esta˜o presentes nas condic¸o˜es experimentais da reac¸a˜o. 2)O biureto e´ um reagente composto por hidro´xido de so´dio e sulfato de cobre que pode ser usado para detectar a presenc¸a de ligac¸o˜es pept´ıdicas. A reac¸a˜o dos ı´ons cu´pricos com os a´tomos de nitrogeˆnio das ligac¸o˜es pept´ıdicas acarreta o deslocamento dos a´tomos de hidrogeˆnio (ocorre em meio alcalino) e isso gera uma mudanc¸a de colorac¸a˜o caracter´ıstica (o biureto e´ um reagente azul, mas ao reagir com a prote´ına, o meio se torna violeta). 3 e 4)Na˜o conseguimos obter o rendimento da case´ına, pois mesmo com o teste do fosfato re- sultando em negativo, na˜o houve sedimentac¸a˜o apo´s a ultima lavagem, impossibilitando a filtrac¸a˜o. 5)Outra te´cnica que pode ser aplicada para determinar a massa molecular da case´ına e´ o da cro- matografia de exclusa˜o. Nela ha´ um volume de eluic¸a˜o da prote´ına que e´ determinado a partir de seu tamanho. Diferentemente da eletroforese em gel, as prote´ınas que levam um tempo maior para migrar sa˜o as de menor massa molecular nesse tipo de te´cnica. Ademais, pode-se determinar a massa molecular da case´ına com espectrometria de massas, que utiliza me´todos de ionizac¸o˜es brandas. 6) 5 Bibliografia Apostila de Pra´ticas de Bioqu´ımica- IQSC- USP Lehiningher - Princ´ıpios de Bioqu´ımica 12
Compartilhar