Relatório de dosagem de proteínas

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Coordenadoria de Biotecnologia 
 
Curso de Bioquímica 
 
 
 
Prática: Dosagem de proteínas pelo método do Biureto 
 
Alunos: Leilane Durval, Isaac Gama e Gabriel Ramos 
 
Turma: FM161 
 
Professores: Ana Claudia e Marcio Martins 
 
Data da realização da prática: 
 
Data da entrega do relatório: 30/04/2021 
 
Avaliação: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Critério: Nota: 
Apresentação 
Introdução 
Objetivos 
Métodos 
Resultados 
Discussão 
Bibliografia 
Total: 
 
 2 
 
Apresentação 
 
Esta prática (ainda não executada de forma literal devido a pandemia do corona vírus), teve como 
objetivo a determinação da quantidade de proteínas em uma solução de concentração desconhecida. 
Para isto, foi utilizada a espectrofotometria através do método de biureto. O reação do biureto com as 
proteínas resulta na coloração das soluções pela cor violácea. O relatório foi feito utilizando-se 
informações do roteiro da prática, descrição da metodologia e dos materiais utilizados, e das soluções 
testadas, que foram detalhadamente explicadas na aula síncrona do professor Márcio. O cálculo das 
concentrações de proteína das amostras foi calculado a partir da fórmula Ci*Vi=Cf*Vf; Com os 
dados obtidos nas contas e no espectrofotômetro, construiu-se o gráfico da Curva Padrão de Caseína, 
relacionando a concentração de proteína com a absorbância em uma reta linear crescente. A equação 
da reta obtida foi y= 0,1568x, que através dela foi-se possível calcular a concentração desconhecida 
de caseína presente no tubo 5. A análise conclusiva foi feita a partir dos resultados satisfatórios 
observados, demonstrando a eficácia e praticidade do método utilizado. 
 
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I. Introdução 
 
I. A. Métodos para a dosagem de proteínas 
 
As proteínas são compostos nitrogenados orgânicos complexos, que em sua composição 
possui cadeias de aminoácidos e estão presentes em todas as células vivas. Sabe-se também, portanto, 
que elas desempenham um papel importantíssimo em quase todos os processos biológicos, já que 
podem atuar de diversas formas, como por exemplo na forma de enzimas, hormônios, 
neurotransmissores e outros. 
Devido à grande importância dessa macromolécula nesses diversos processos biológicos, há 
grande interesse das mais variadas áreas de estudos, por isso, os métodos para a determinação destes 
compostos é de alto interesse para um grande variedade de profissionais. E apesar de finalidades 
distintas, os interesses se intersecionam na escolha do método mais adequado, mais barato e mais 
eficaz. 
Dito isto, tem-se o desenvolvimento fundamental de métodos espectrofotométricos para a 
determinação de proteínas totais, sobretudo, estudos comparativos dessas metodologias, para que seja 
possível o uso da mais vantajosa em aspectos econômicos e eficazes. 
Existem vários métodos para a determinação da concentração de proteínas, os mais comuns 
frequentemente utilizam a espectrofotometria na região ultravioleta e do visível (UV-Visível). Não 
existe metodologia considerada de uso universal para todos os meios, os geralmente mais utilizados 
são o do biureto, de Lowry, do ‘’ Coomasie brilliant blue’’ BG-250 ou reagente de Bradford, do BCA 
ou reagente de Smith, e de absorção de proteínas no ultravioleta. (Zaia, 1998) 
O método utilizado nesta prática será o do biureto, devido ao seu baixo custo e boa 
sensibilidade. 
 
 
I. B. Método do biureto 
 
O biureto é formado a partir do aquecimento da Ureia, ele possui ligações semelhantes as 
ligações peptídicas encontradas na formação de proteínas e por isso este método, que é utilizado para 
determinar a concentração de proteínas em diversos meios (como por exemplo: na urina, em 
alimentos, na saliva, no tecido animal, entre outros), recebeu justamente esse nome. No esquema a 
seguir pode-se observar a produção de biureto e amônia após o aquecimento de ureia: 
 
 
 
 
O reativo do biureto consiste em uma solução de Sulfato de Cobre (CuSO4) e tártaro duplo de 
Sódio e Potássio (KNaC4H4O6). Na reação em meio alcalino há interação das proteínas com os íons 
Cu2+, no produto da reação se tem a formação de coloração violácea, ou seja, após a reação, quanto 
mais escura for a coloração da solução maior será a concentração de proteínas no meio. A seguir 
pode-se observar a representação da interação entre as ligações peptídicas de uma proteína ou 
peptídeo com íons Cu2+: 
 
 
 
 
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 (Interação ligação peptídica / Cu2+) 
 
As substâncias coloridas geradas no produto da reação absorvem luz na região visível, 
portanto é possível quantifica-las, e essa quantificação é realizada por meio de espectrofotometria, 
que é o procedimento a ser realizado nesta prática. 
 
 
 
II. Objetivos 
 
Está prática tem como seu objetivo, a dosagem de proteínas feita com o auxílio do método de 
biureto. Com os resultados obtidos através do método de espectrofotometria, realizar a construção do 
gráfico da Curva Padrão de Caseína e o gráfico de sua respectiva equação, tornando possível o 
cálculo da concentração da solução desconhecida de caseína. 
 
 
 
III. Material e Métodos 
 
 III. A. Material 
 
Foram utilizados 7 tubos de ensaio, micropipeta P1000, micropipeta P5000, ponteiras, 1 estante 
de tubos, 1 Becker de 50mL e 6 cubetas. Já as soluções utilizadas foram a solução padrão de Caseína 
(5mg/mL) diluída em PBS pH 7,4 e a amostra de caseína de concentração desconhecida diluída em 
PBS pH 7,4. Além do reagente do biureto e do tampão fosfato com salina em pH 7,4. 
Equipamento: Espectrofotômetro. 
 
Reagente do biureto: CuSO4. 5 H2O 0,15% p/v 
 Tartarato duplo de sódio e potássio 0,60% p/v 
 KI 1,00% p/v 
 NaOH 1,00 mol/L 
 
PBS pH 7,4 (Tampão fosfato com salina em pH 7,4): KCl 2,680 mmol/L 
 KH2PO4 1,470 mmol/L 
 NaCl 0,137 mmol/L 
 Na2HPO4. 7 H2O 8,060 mmol/L 
 
 
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 III. B. Métodos 
 
Pegou-se uma alíquota de aproximadamente 7 mL da solução padrão de caseína em um tubo 
de ensaio; pegou-se outra alíquota de aproximadamente 10 mL da solução de PBS em um Becker e 
em seguida levou-se as duas para pipetar na bancada; Primeiramente identificou os tubos do B (tubo 
branco) ao 5; Transferiu-se o PBS, com o auxílio da pipeta P5000, a quantidade devida necessária de 
PBS para cada tubo; Transferiu-se diferentes quantidades das soluções de Caseína (5mg/mL) os tubos 
conforme indicado na tabela do roteiro de prática, onde apenas o tubo branco não recebeu nenhuma 
quantidade de proteína; Transferiu-se 5mL de reagente de biureto para todos os tubos. 
Homogeneizou-se a solução e deixou-se por 10 minutos em repouso para a estabilização da 
reação. Posteriormente, transferiu-se o conteúdo de cada tubo para uma cubeta, enchendo-a acima da 
metade; leu-se as absorbâncias das soluções, contra a solução do tudo branco, com o espectrômetro 
configurado do comprimento de onda de 540nm; Anotou-se os valores. 
 
 
 
IV. Resultados 
 
IV. A. Tabela de construção da curva padrão, onde apenas o tubo branco não recebeu nenhuma 
quantidade de proteínas. Valores de absorbância obtidos no espectrômetro. 
 
 
 
 
 
IV. B. Tubos enumerados de B ao 5 após homogeneização e o repouso de 15 minutos necessários 
para a estabilizaçãoda reação. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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IV. C. Cálculos da massa de caseína em cada tubo com a fórmula: Ci*Vi= Cf*Vf 
 
Tubo 1: 
Cf = (5mg/ml * 0,5mL) / 7mL = 0,3571 mg/mL 
 
Tubo 2: 
Cf = (5mg/ml * 1mL) / 7mL = 0,7143 mg/mL 
 
Tubo 3: 
Cf = (5mg/ml * 1,5mL) / 7mL = 1,0714 mg/mL 
 
Tubo 4: 
Cf = (5mg/ml * 2mL) / 7mL = 1,4286 mg/mL 
 
 
 
 
IV. D. Gráfico da curva de calibração, feito no papel milimetrado, onde o número de absorbância 
obtido no cumprimento de onda 540nm está representando o eixo das ordenadas (Y) e a concentração 
de caseína mg/mL está representando o eixo das abscissas (X). 
 
 
 
 
 
IV. E. Cálculo da fórmula da equação da reta 
 
Sendo: y= ax + b [0,3571(x); 0,056(y)] 
 
0,056= a*0,3571 + b b = 0 
a=0,056/0,3571 – b 
a=0,1568 – 0 
a=0,1568 
 
y= 0,1568x (fórmula da equação) 
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IV. F. Cálculo da concentração da amostra desconhecida a partir da fórmula da reta do gráfico linear 
da curva de calibração. 
 
y = ax + b 
0,096 = 0,1568x 
x = 0,096/0,1568 = 0,6122 
0,6122/7 = 0,087457142/2 = 0,0437 
 
[ ] do tubo 5= 0,0437 mg/mL 
 
 
V. Discussão 
 
Pode-se observar no gráfico apresentado nos resultados, que o valor da absorbância está 
diretamente ligado com a quantidade de proteínas presentes no meio. 
O tubo branco no gráfico está representado no ponto (0,0), isso porque este tubo continha apenas 
reagentes e uma quantidade nula de proteínas, ele foi utilizado para calibrar o espectrofotômetro para 
que a absorbância tivesse seu início em zero. Ele é chamado de tubo branco exatamente por ter zero 
concentração do que se deseja medir, sendo então utilizado como parâmetro, ou seja, em qualquer 
procedimento similar a este o tubo branco sempre será posto primeiro que os outros tubos no 
espectrofotômetro (a máquina não sabe que está solução é a que não contém absolutamente nenhum 
concentração de proteína, portanto, sempre que ela for colocada é necessário apertar o botão para 
tarar). 
O esboço do gráfico se demonstrou favorável, já que a reta traçada intersectou todos os pontos, 
como era o esperado. 
O cálculo da concentração de cada tubo foi necessário para que fosse possível o esboço correto 
do gráfico, já que apenas se sabia da concentração inicial e todas foram diluídas com a adição dos 
reagentes. 
O valor de b na fórmula da equação foi igual a zero, pois o ponto b é justamente a altura onde o 
eixo Y é atravessado pela reta, que nesse caso, como pode se observar pelo gráfico, foi exatamente 
no ponto (0,0). 
Pode-se dizer que o resultado calculado da concentração do tubo 5 foi favorável, já que se 
observarmos a imagem dos tubos, pode-se perceber que mesmo ainda quando não se sabia o exato 
valor da concentração de proteína que foi posta dentro deste tudo, a cor da sua solução estava bem 
clarinha quando se comparada as outras (exceto ao tubo branco por motivos já conhecidos), nos 
dizendo que ela não poderia ter concentração maior do que a dos outros tubos, já que eles 
apresentaram uma cor mais intensa. 
 
 
VI. Bibliografia 
 
ZAIA, D. Determinação de proteínas totais via espectrofotometria: Vantagens e desvantagens 
dos métodos existentes. Departamento de química - CCB - Universidade Estadual de Londrina – 
86051 – 970 - Londrina - PR. 
 
SOUZA, Karina de Freitas; NEVES, Valdir Augusto. Experimentos de Bioquímica. Disponível em: 
<http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_proteinas/reacoes_coradasdois3.htm>. 
Acesso em 29/04/2021. 
http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_proteinas/reacoes_coradasdois3.htm
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