III Unidade INTRODUÇÃO Digestão Enzimática do Amido

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHÃO
CCBS- CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS
CURSO DE FARMÁCIA
PROF. DRª ANA PAULA SILVA DE AZEVEDO DOS SANTOS
AMILASE SALIVAR
Anna Beatriz Soares Freitas
Emylly Dhayara da Silva
Gabriel Silva Abrantes Reis
Mychely Martiliano Nunes
Sandy Mara da Silva Souza
São Luís
2019
1 INTRODUÇÃO
Praticamente todas as reações no corpo são mediadas por enzimas, as quais são proteínas catalisadoras que aumentam a velocidade das reações, sem sofrerem alterações no processo global. Dentre as muitas reações biológicas que são energeticamente possíveis, as enzimas seletivamente canalizam substratos para rotas úteis. As enzimas direcionam, assim, todos os eventos metabólicos. (LEHNINGER, 2006)
As enzimas apresentam uma capacidade de reagir com determinadas partes das células, denominados substratos, formando complexos, ou mesmo ligações covalentes denominadas atividade biológica. Essa atividade vai depender do número de cadeias peptídicas e arranjos.  A determinação da atividade enzimática envolve a medida da velocidade da reação com a enzima pura e com condições que permita que a velocidade seja máxima. Essa velocidade varia com fatores diversos tais como: concentração de enzima ou de substrato temperatura e pH.
Um exemplo de enzima é a amilase salivar, que é uma hidrolase cuja função é degradar os carboidratos. Esta é predominantemente produzida pelas glândulas parótidas e pâncreas. O amido começa a ser digerido na boca por ação da enzima α-amilase salivar, também chamada de ptiliana, que hidrolisa as ligações α (1-4) da cadeia do amido, dando origem a glicose, maltose e oligossacarídeos.
A α-amilase salivar em condições especificas de pH e temperatura, catalisa a hidrólise das ligações da cadeia glicosídica do polissacarídeo amido. É importante mencionar que a hidrólise do amido é evidenciada na presença do Iodo, Lugol. A α- amilase salivar, em condições específicas de pH 6.8 e temperatura 37 °C.
2 OBJETIVO
Realizar hidrólise química e enzimática do amido.
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 MATERIAIS
• Solução de amido a 1% 
• Solução de lugol
• Solução de HCl 1:2
• Solução salina a 0,95% 
• Saliva
• Erlenmeyer
• Proveta
• Tubos de ensaio
• Pipeta graduada
• Banho de gelo
• Banho em água aquecida
3.2 METODOLOGIA
O experimento foi realizado em duas etapas: hidrólise química e hidrólise enzimática.
1)Hidrólise Química
Com o auxílio de uma proveta, 30 ml de solução de amido 1% foram colocados em um erlenmeyer, em seguida foram acrescentados 3 ml de HCl.
Três tubos de ensaio foram enumerados e em cada um deles colocado 5 ml de água destilada. No tubo 1 foi pipetado 5 ml da solução contida no erlenmeyer e levado pro banho de gelo. No tubo 2 também foram pipetados 5 ml da solução do erlenmeyer, mas dessa vez foi levado pro banho de água aquecida por 10 min e depois para o banho de gelo. Por fim, 5 ml da solução do erlenmeyer foram colocados no tubo 3 e levado para o banho de água aquecida por 20 min e depois para o banho de gelo.
Após todos os tubos estarem imersos no banho de gelo, os mesmos são retirados. Depois que atingiram a temperatura ambiente, foram adicionadas 10 gotas de solução de lugol em cada tubo.
2)Hidrólise enzimática
Com uma proveta, 30 ml de solução de amido 1% foram colocados em um erlenmeyer e acrescentado, com o auxílio de pipeta, 1 ml de saliva.
Três tubos de ensaio foram enumerados e em cada um foram colocados 5 ml de água destilada. Em seguida foram pipetados 5 ml, em cada tubo, da solução contida no erlenmeyer, sendo o tubo 1, após esse processo, colocado em banho de gelo, o tubo 2 e 3 deixados em temperatura ambiente por 10 e 20 min, respectivamente, e depois levados para o banho de gelo.
Após todos os tubos estarem imersos no banho de gelo, os mesmos são retirados. Depois que atingiram a temperatura ambiente, foi adicionado 10 gotas de solução de lugol em cada tubo.
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Após a aplicação dos métodos, foi possível realizar a análise qualitativa (hidrólise enzimática), por coloração com Lugol, e a análise quantitativa (hidrólise química), pela qual nessa o amido foi totalmente hidrolisado à glicose, também foi usado lugol na mesma.
1)Hidrólise Química
A adição de amido em uma solução ácida é devido à sua solubilidade em meio ácido. A solubilidade dos carboidratos depende da disponibilidade dos grupos hidroxila para formar ligações de hidrogênio com a água. No caso dos polissacarídeos (amido), a solubilidade é muito baixa devido à grande quantidade de ligações de hidrogênio intracadeias, fato que minimiza a interação com a água. A solubilização só é obtida por meio da hidrólise ácida (neste caso foi utilizado o HCl). Em relação ao uso do lugol, esse foi utilizado devido à facilidade e rapidez dos resultados. As moléculas de amido podem ter diferentes graus de ramificação, onde a conformação mais comum da amilose é uma hélice com seis resíduos em volta, que quando as moléculas de iodo (presentes no lugol) se encaixam dentro dessa hélice, formam um complexo de amido-iodo, que possui cor azul-escuro característica (CAMPBELL & FARRELL, 2007). Com essa formação de coloração é possível identificar a presença ou não do amido e assim verificar a atividade de alfa-amilase salivar. A alfa-amilase (EC 3.2.1.1 – 1,4-a-D-glucano gluconoidrolase) correspondem a endoamilases que atuam ao acaso ao longo das cadeias de amilose e amilopectina hidrolisando as ligações a-1,4 e liberando maltooligossacarídeos. Também chamadas de enzimas dextrinizantes. O método lugol, irá reagir com as dextrinas, produzidas durante a hidrólise como produtos intermediários. As diferenças das tonalidades da coloração azul/roxo dos tubos são explicadas pelas diferenças de tamanho e complexidade das dextrinas. Nos tubos que ocorreram hidrólise química, nomeados de Q1, Q2, Q3, representados da esquerda para direita na imagem a seguir, notou-se que entre eles há diferenças dos meios, o primeiro apresentou-se mais concentrado e com formação de partículas, o líquido do segundo apresentou-se mais uniforme, já o terceiro o líquido era menos viscoso apresentando grandes partículas espessas nesse. O lugol adicionado não “corou”, a partir disso observou-se a presença de pouco amido.
Figura 1. Tubos de ensaio usados no teste.
2)Hidrólise Enzimática
Em humanos, a digestão do amido se inicia na boca. Com a mastigação há liberação da enzima α-amilase, presente na saliva. Ela catalisará a hidrólise nas ligações glicosídicas (α1 → 4) da amilose, resultando em maltose, glicose e amilopectina; e das ligações (α1 → 4) da amilopectina, resultando em dextrina, mistura de polissacarídeos. No suco pancreático também haverá atividade de amilases. A β-amilase catalisará a quebra de ligações (α1 → 4) dos polissacarídeos resultantes da hidrólise da amilopectina e esta última reação terá como produto o dissacarídeo maltose. Para obtenção de glicose, monossacarídeo de vital importância no metabolismo, entra a atividade da enzima maltase, agido na hidrólise das ligações da maltose. Os grânulos de amido são insolúveis mas absorvem água e a sua estrutura sofre expansão devido a presença da água que fica retida. Uma solução de amido é uma mistura de grânulos inchados e grânulos fragmentados juntamente com dispersões coloidais e dextrinas originadas dos grânulos dissolvidos e quando uma suspensão aquosa de amido é aquecida acima de um certo limite, as ligações fracas das regiões amorfas se dissociam ocorrendo expansão tangencial e uma hidratação que continuamente aumenta formando uma estrutura continua cujas micelas são unidas (neste teste foi usado banho de gelo, o que permite a ocorrência do contrário). Os grânulos então apresentam uma expansão que é irreversível e sem qualquer organização estrutural. Continuando a expansão, a amilose é lixiviada para a fase aquosa entre os grânulos, no que resulta um aumento substancial da viscosidade. A gelatinização inicia-se no centro do grânulo, no hilum,e prossegue rapidamente para a periferia. Inicia-se primeiramente nas regiões amorfas do grânulo pois as ligações de hidrogênio são mais fracas nestas regiões. As temperaturas de gelatinização e entalpias associadas com as endotermas de gelatinização variam em amidos de diferentes fontes e podem ser atribuídas a diferenças no grau de cristalinidade, ou seja, como se organizam os biopolímeros no grânulo. As suspensões de amidos após a gelatinização torna-se adequado substrato para a ação de enzimas que vão rompendo as ligações existentes nos biopolímeros, amiloses e amilopectinas, e liberando em solução moléculas de glicose e pequenos biopolímeros denominados dextrinas que por sua vez irão também ser decompostos. Estas enzimas são denominadas “enzimas amilolíticas” são em sua maioria produzidas por fungos ou bactérias que modernas tecnologias em bioprocessos tornaram-nas muito eficientes e disponíveis a custos acessíveis para uso industrial. Nos tubos H1, H2, H3, representados na figura 1, da direita para a esquerda, pôde-se perceber as diferenças de coloração mediante à presença do lugol, o primeiro apresentou-se de cor menos azul/roxa menos intensa, o segundo de intensidade moderada e último de alta intensidade, confirmando a presença de amido e menor ação da enzima amilase salivar.
5 CONCLUSÃO
Para a maioria dos seres humanos, o amido é a principal fonte de carboidratos na dieta. A digestão inicia na boca, onde a amilase salivar hidrolisa as ligações glicosídicas internas do amido, produzindo fragmentos polissacarídicos curtos ou oligossacarídeos.O glicogênio e o amido ingeridos na dieta são hidrolisados por a-amilases e glicosidases, enzimas presentes na saliva e no intestino que rompem ligações glicosídicas entre as unidades de glicose. Na prática acima descrita podemos observar a atividade enzimática da amilase salivar, onde ocorreu a catálise do amido pela enzima. Com a realização dessa prática podemos observar que as enzimas possuem um alto grau de especificidade em relação ao substrato e que fatores como concentração de substrato, da enzima e a temperatura estão intimamente ligados a ocorrência e velocidade destas reações de catálise. Ao final do experimento foi possível realizar a análise qualitativa da hidrólise enzimática, por coloração com Lugol, e a análise quantitativa da hidrólise química, pela qual nessa o amido foi totalmente hidrolisado à glicose. 
REFERÊNCIAS
LEHNINGER, A.L.; NELSON, D.L.; COX, M.M. Princípios de Bioquímica. 2. ed. São Paulo: Sarvier, 2000.
UNESP. Determinação da atividade da amilase salivar. Disponível em:
<http://www.foa.unesp.br/home/departamentos/ciencias_basicasdeterminacao-da-atividade-da-amilase-salivar-2016.pd f>.Acesso em 2 maio. 2019.