Aula6-CinéticaEnzimática

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Bioquímica I 
 
Curso Técnico em Química 
INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E 
TECNOLOGIA DO RIO DE JANEIRO 
CAMPUS RIO DE JANEIRO 
Prof. Dr. Marcio Martins Loureiro 
 
marcio.loureiro@ifrj.edu.br 
CINÉTICA ENZIMÁTICA 
• Consiste na abordagem mais antiga para entender o mecanismo de 
funcionamento das enzimas. 
 
 
• Até os dias atuais, permanece entre as abordagens os mais 
importantes. 
 
 
• Possui como principal objetivo, determinar a velocidade das 
reações, bem como ela se modifica, em resposta a mudanças nos 
parâmetros experimentais. 
CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO 
• É um fator-chave que afeta a velocidade das reações catalisadas por enzimas 
 
• O estudo dos efeitos da concentração do substrato é complicado, pois o mesmo 
pode modificar-se durante o curso de uma reação in vitro, à medida que ele é 
convertido em produto. 
 
• Uma abordagem que simplifica os experimento de cinética enzimática é medir a 
velocidade Inicial (Vo). 
 
• Em reações típicas, as enzimas podem estar presentes em quatidades 
nanomolares, enquanto o substrato pode estar em ordem de magnitudade de 5 ou 
6 vezes maior. 
 
• se apenas início da reação for monitorada (1 minuto ou menos), a mudança em S 
pode estar limitada a alguns poucos por cento e S pode ser considerada constante. 
 
CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO 
• Em concentrações baixas de substrato, Vo aumenta quase 
linearmente com o aumento de S. 
 
• Em altas concentrações de substrato, Vo aumenta em pequenas 
quantidades em resposta ao aumento de S. 
 
• O ponto além do qual um aumento em Vo é insignificantemente 
pequeno com o aumento de S e chamada de Velocidade máxima 
(Vmáx). 
MODELO CINÉTICO MICHAELIS-MENTEN 
• A curva que expressa a relação entre S e Vo tem a mesma forma 
geral para a maioria das enzimas e pode ser expressa 
algebricamente pela equação de Michaelis-Menten. 
S= Substrato 
Vo = velocidade Inicial 
Vmax= Velocidade máxima 
Km= Constante de Michaelis 
O Km é a constante de Michaelis, que 
corresponde à relação entre as 
constantes de velocidade de formação 
e dissociação do complexo ES 
O COMPLEXO ES É A CHAVE PARA ENTENDER 
O COMPORTAMENTO CATALÍTICO 
• Em 1913, Michaelis e Menten, propuseram 
que a enzima primeiro combina-se com o 
substrato de forma reversível e relativamente 
rápida 
 
 
 
• Em seguida o complexo ES é rompido em 
uma segunda etapa mais lenta (limitante), 
fornecendo a enzima livre + produto 
 
 
 
 
•Sendo a segunda reação mais lenta, ela limita 
a velocidade de reação total, logo a velocidade 
total deve ser proporcional à concentração de 
espécies que reagem (ES) 
• No início da reação a concentração de P é desprezível e permite 
simplificar, considerando que a reação inversa E+P ES pode ser 
ignorada. 
• A Vo é determinada pela quebra de ES formando o produto, que é 
determinado por ES. 
MODELO CINÉTICO MICHAELIS-MENTEN 
• ESTADO ESTACIONÁRIO é aquele em que apesar de estarem 
ocorrendo mudanças nas concentrações de S (diminuindo) e de P 
(aumentando), não há variação da concentração dos intermediários 
da reação (ES) 
MODELO CINÉTICO MICHAELIS-MENTEN 
Velocidade de formação de ES = Velocidade de decomposição de ES 
K1 [E].[S] = (K-1 + K2) [ES] 
[E] [S] 
(K-1 + K2 ) / K1 
= [ES] 
A equação de Michaelis-Menten define a relação quantitativa entre 
Velocidade Inicial (Vo), Velocidade Máxima (Vmax), concentração inicial do 
substrato (S), todas relacionadas pela constante e Michaelis (Km). 
Dividindo-se por Vmax, obtem-se: 
Resolvendo-se para Km, obtêm-se: 
Km + [S] = 2 [S], ou: 
quando 
MODELO CINÉTICO MICHAELIS-MENTEN 
Quando Vo é exatamente metade da 
Vmax, então: 
O KM PODE SER USADO COMO INDICADOR DA 
AFINIDADE DA ENZIMA PELO SUBSTRATO 
• No numerador, temos duas constantes de velocidade 
de reações de DECOMPOSIÇÃO de ES e no 
denominador, a constante de velocidade da 
FORMAÇÃO de ES. 
 
• Dessa forma, km é uma medida da AFINIDADE da 
enzima pelo substrato. 
• Km equivale ao valor da concentração de substrato que faz com que a reação 
atinja metade da sua Vmáx. 50% dos sítios ativos da enzima estão ocupados 
pelo substrato. 
 
• Quanto menor for a quantidade de substrato para isso acontecer, maior é a 
afinidade da enzima por seu substrato. Assim: 
 
• Enzima com ALTO Km = enzima com BAIXA afinidade pelo substrato. 
 
• Enzima com BAIXO Km = enzima com ALTA afinidade pelo substrato. 
O KM PODE SER USADO COMO INDICADOR DA 
AFINIDADE DA ENZIMA PELO SUBSTRATO 
• km fornece uma medida da concentração de substrato necessária para ocorrer 
uma catálise importante. 
O VALOR DE Vmax VARIA MUITO DE UMA 
ENZIMA PARA OUTRA 
• O número de etapas da reação e a identidade das etapas limitantes da 
velocidade podem variar de acordo com a enzima. 
• Neste caso, onde a liberação do produto é a etapa limitante (EP E+P), na 
saturação, a maior parte da enzima está na forma EP e Vmáx = k3 [Et]; 
• kcat é uma constante de velocidade mais geral que serve para descrever a etapa 
limitante de uma reação enzimática na saturação. 
 
•Kcat é uma constante de primeira ordem da velocidade, tendo como unidade a 
reciproca do tempo. 
 
•Também é chamada de número de reciclagem/renovação enzimática 
(turnover). Número de moléculas de substrato convertidas a produto por unidade 
de tempo, quando a enzima está saturada com substrato. 
OS PARÂMETROS Kcat E Km PERMITEM AVALIAR 
A EFICIÊNCIA CINÉTICA DE ENZIMAS 
• A melhor maneira de comparar as eficiências catalíticas de enzimas diferentes, ou o 
número de vezes que diferentes substratos são catalisados pela mesma enzima é 
comparar a relação kcat/km para as duas reações. Este parâmetro, chamado de 
constante de especificidade, e corresponde a taxa de conversão de ES em E + P. 
 
•A constante de especificidade relaciona-se tanto com a afinidade da ligação do substrato 
à enzima como com a capacidade catalítica desta. 
•Existe um valor máximo teórico para esta constante, imposto pela velocidade com que E e 
S podem se difundir em soluções aquosas. Este limite é de cerca de 108 a 109 M−1s−1 é 
denominado limite de difusão. 
 
•Considerando-se que cada colisão resulta em catálise, a velocidade global de formação 
do produto, não será limitada pela velocidade da reação da enzima, mas sim pela 
velocidade de difusão das moléculas em solução. 
 
•Enzimas que possuam uma constante de especificidade perto deste valor são designadas 
enzimas cataliticamente (ou cineticamente) perfeitas. 
OS PARÂMETROS Kcat E Km PERMITEM AVALIAR 
A EFICIÊNCIA CINÉTICA DE ENZIMAS 
CATÁLISE DE REAÇÕES COM 2 OU MAIS SUBSTRATOS 
• Na maioria das reações enzimáticas dois (ou mais) substratos se ligam à enzima 
e participam da reação; 
 
• A velocidade destas reações também pode ser analisada pela abordagem de 
Michaelis-Menten. A enzima em questão possui diferentes valores de km para 
cada substrato; 
 
• Reações enzimáticas com dois ou mais substratos geralmente envolvem a 
transferência de um grupamento funcional ou um átomo de um substrato para o 
outro. 
Hexoquinase 
•Em alguns casos, ambos os substratos ligam-se a enzima simultaneamente, em 
algum ponto do andamento da reação, formando um complexo não covalente 
ternário. 
 
• Os substratos podem se ligar à enzima em uma ordem específica, ou de maneira 
aleatória. 
•Em outros casos, um dos substratos é convertido a produto e se dissocia antes da 
ligação do segundo substrato (mecanismo ping-pong). 
CATÁLISE DE REAÇÕES COM 2 OU MAIS SUBSTRATOS 
GRÁFICO DE LINEWEAVER-BURK (DUPLO-RECÍPROCO) 
• A equaçãode Michaelis-Menten pode ser algebricamente transformada em equações que 
serão mais úteis para a interpretação de dados experimentais. Um exemplo disso é a 
utilização dos valores recíprocos de ambos os lados da equação. 
 
• Os dados obtidos geram uma reta, a qual cruza o eixo y (que, neste caso, é o inverso da 
V0) e o eixo x (que, neste tipo de gráfico, é o inverso da [S]). 
• A equação de Michaelis e Menten gera uma hipérbole, ao 
passo que a de Lineweaver-Burk gera uma reta, muito mais 
fácil de analisar. y = ax + b 
Inversão da equação 
Separação dos Numeradores 
Simplificação 
INIBIÇÃO ENZIMÁTICA 
• Tendo em vista que as enzimas catalisam inúmeras vias 
metabólicas nos organismos vivos, a inibição enzimática consiste 
no objetivo principal de diversas drogas capazes de interferir na 
ação enzimática, diminuindo ou paralisando a catálise. 
CLASSIFICAÇÃO DOS MECANISMOS DE 
INIBIÇÃO ENZIMÁTICA 
REVERSIVEIS – Ocorre dissociação rápida do complexo Enzima-
Inibidor, os quais se ligam por interações não covalentes. 
 
Competitiva 
Incompetitiva 
Mista 
Não Competitiva 
 
 
 IRREVERSÍVEIS – O inibidor se liga covalentemente á enzima ou 
destrói um grupamento funcional, ou ainda pode formar um 
complexo estável por associação não covalente. 
 
Análogos de Substrato 
Inibidores Suicidas 
Análogos de Estado de Transição 
MECANISMOS DE INIBIÇÃO REVERSÍVEIS: 
INIBIDORES COMPETITIVOS 
• Esta classe de inibidores competem com o substrato pelo sítio ativo da enzima, 
pois são estruturalmente parecidos, combinando-se com a enzima para formar 
um complexo Enzima –Inibidor, sem ocasionar catálise. 
•Este tipo de inibição pode ser analisada quantitativamente pela cinética do estado 
estacionário. 
quando e 
MECANISMOS DE INIBIÇÃO REVERSÍVEIS: 
INIBIDORES COMPETITIVOS 
• αKm (Km aparente) é Km observado na 
presença de inibidor 
 
• A ligação reversível entre enzima e 
inibidor permite o deslocamento da 
ligação a favor do substrato através do 
aumento de sua concentração 
 
• Quando [S] excede [I] a probabilidade 
do inibidor se ligar a enzima diminui e a 
reação apresenta o valor normal de Vmax. 
 
• Quando [S] atinge Vo = 1/2 Vmax, a 
presença do inibidor aumenta o valor do 
Km aparente através do fator α. 
MECANISMOS DE INIBIÇÃO REVERSÍVEIS: 
INIBIDORES INCOMPETITIVOS 
• Esta classe de inibidores liga-se em um sítio distinto do sítio ativo do substrato. 
Além disso, eles se ligam apenas ao complexo ES. 
• Na presença deste tipo de inibidor a equação de Michaelis-Menten altera-se para: 
onde e 
MECANISMOS DE INIBIÇÃO REVERSÍVEIS: 
INIBIDORES INCOMPETITIVOS 
• Em altas concentrações de substrato, 
Vo se aproxima de Vmax /α’ 
 
• Na presença de um inibidor 
incompetitivo, Vmax diminui 
 
• O Km aparente também diminui, porque 
a [S] necessária para atingir ½ Vmax 
diminui através do fator α’. 
 
• A razão Km / Vmax permanece a mesma. 
 
• Estes inibidores decrescem o número 
de turnover ao invés de diminuir a 
proporção de complexo ES. 
MECANISMOS DE INIBIÇÃO REVERSÍVEIS: 
INIBIDORES MISTOS 
• Esta classe de inibidores também se ligam a sítios distintos do sítio ativo, ao 
qual o substrato se liga. Entretanto, os inibidores podem se ligar tanto a enzima 
quanto ao complexo ES. 
• A equação de velocidade que descreve a inibição mista é: 
Onde α e α’ são descritas 
como anteriormente 
MECANISMOS DE INIBIÇÃO REVERSÍVEIS: 
INIBIDORES MISTOS 
• Um inibidor misto afeta Km e Vmax. 
 
• Diminui o número total de enzimas 
ativas, sem diminuir a proporção de 
moléculas ligadas ao substrato, mas não 
é sobrepujada pelo aumento da 
concentração do substrato. 
MECANISMOS DE INIBIÇÃO REVERSÍVEIS: 
INIBIDORES NÃO COMPETITIVOS 
• Esta classe de inibidores também se ligam a sítios distintos do sítio ativo, ao 
qual o substrato se liga. Entretanto, os inibidores podem se ligar tanto a enzima 
quanto ao complexo ES. 
• Caso experimentalmente raro,.onde α = α’ 
 
• Diminui Vmax sem alterar Km 
RESUMO DE MECANISMOS DE INIBIÇÃO REVERSÍVEIS 
CLASSIFICAÇÃO DOS MECANISMOS DE 
INIBIÇÃO ENZIMÁTICA 
REVERSIVEIS – Ocorre dissociação rápida do complexo Enzima-
Inibidor, os quais se ligam por interações não covalentes. 
 
Competitiva 
Incompetitiva 
Mista 
Não Competitiva 
 
 
 IRREVERSÍVEIS – O inibidor se liga covalentemente á enzima ou 
destrói um grupamento funcional, ou ainda pode formar um 
complexo estável por associação não covalente. 
 
Inibidores Suicidas 
Análogos de Substrato 
Análogos de Estado de Transição 
MECANISMOS DE INIBIÇÃO IRREVERSÍVEIS 
• Esta classe de inibidores consistem em importantes ferramentas para 
elucidação do mecanismo enzimático, bem como permitem identificar resíduos de 
aminoácidos com funções chave no sítio ativo, os quais se ligam covalentemente 
ao inibidor, depois que a enzima é inativada 
Reação de Inibição da quimiotripsina com o diisopropilfluorfosfato (DIFP) 
Quimiotripsina 
diisopropilfluorfosfato 
(DIFP) 
MECANISMOS DE INIBIÇÃO IRREVERSÍVEIS: 
INIBIDORES SUICIDAS 
• Esta classe de inibidores consistem em compostos relativamente 
não reativos, até que se liguem ao sítio ativo da enzima específica. 
 
• Estes inibidores passam pelas primeiras etapas químicas de uma 
reação enzimática, mas ao invés de ser transformada em um 
produto normal, é convertido para a forma de um composto muito 
reativo, que se combina irreversivelmente com a enzima. 
 
• Também são chamados de inibidores com base no mecanismo. 
MECANISMOS DE INIBIÇÃO 
IRREVERSÍVEIS: INIBIDORES SUICIDAS 
MECANISMOS DE INIBIÇÃO IRREVERSÍVEIS: 
ANÁLOGOS DO ESTADO DE TRANSIÇÃO 
Inibidores de protease do HIV 
MECANISMOS DE INIBIÇÃO IRREVERSÍVEIS: 
ANÁLOGOS DE SUBSTRATO 
REGULAÇÃO ENZIMÁTICA 
REGULAÇÃO ENZIMÁTICA 
• Nas mais variadas vias metabólicas, grupos de enzimas trabalham 
conjuntamente para realizarem um determinado processo metabólico, onde o 
produto de uma reação enzimática é substrato de outra. 
 
• A maioria destas enzimas se comportam de acordo com a cinética de Michaelis-
Menten, onde sua atividade regulada pela lei de ação das massas, ou seja, se o 
substrato estiver presente, ocorre catálise. 
 
• Cada via apresenta uma ou mais enzimas que influenciam na velocidade da 
sequência de reações como um todo, denominadas Enzimas Regulatórias, as 
quais podem apresentar aumento ou diminuição da atividade catalítica, em 
resposta a certos sinais 
 
• Ajustes na velocidade de enzimas regulatórias permitem que as células 
atendam suas necessidades energéticas e de biomoléculas para seu 
desenvolvimento e manutenção. 
 
• Normalmente estas enzimas catalisam a primeira reação da via metabólica. 
REGULAÇÃO ENZIMÁTICA: ENZIMAS ALOSTÉRICAS 
• As enzimas alostéricas agem através da ligações reversíveis e não covalentes 
com compostos regulatórios denominados moduladores alostéricos ou 
efetores alostéricos, que geralmente são pequenos metabólitos ou cofatores. 
 
• Outras enzimas são reguladas por modificações covalentes reversíveis. 
 
• Mudanças conformacionais induzida pela 
ligação de moduladores, podem tornar a 
enzima mais ou menos ativa. 
 
 
• O modulador pode ser o próprio substrato 
(Enzimas homotrópicas) 
 
 
• Quando o modulador não é o substrato, a 
enzima é chamada heterotrópica. 
 
 
• As enzimas alostéricas geralmente possuem 
1 ou mais sítios de ligação ao modulador 
 
Aspartato transcarbamoilase 
Catalisa reação inicial de biossíntese de nucleotídeos pirimidínicos 
• Estas enzimas geralmente apresentam 2 ou mais subunidades proteicas. 
 
Apresenta2 grupamentos volumosos (cada um com 3 cadeias polipeptídicas 
catalíticas - Azul e roxo) e 3 grupamentos regulatórios (cada um com 2 cadeias 
polipetídica - Vermelha e amarela) 
 
Apresenta 12 cadeias polipetídicas 
REGULAÇÃO ENZIMÁTICA: ENZIMAS ALOSTÉRICAS 
• Em alguns sistemas multienzimáticos, a enzima 
regulatória é inibida pelo produto final daquela via, sempre 
que a concentração deste produto exceder as 
necessidades celulares. 
 
• quando ocorre diminuição de atividade da enzima 
regulatória, as outras enzimas da via podem operar em 
velocidades diferentes, de modo que seus respectivos 
substratos ficam esgotados. 
 
• A velocidade e produção de um determinado produto final 
da via é assim equilibrada com as necessidades celulares. 
 
• Este mecanismo de regulação é denominado como 
Inibição por retroalimentação ou inibição por feedback. 
 
REGULAÇÃO ENZIMÁTICA: ENZIMAS ALOSTÉRICAS 
• As enzimas alostéricas apresentam relações entre Vo e [S] 
diferentes daquelas da cinética de Michaelis-Menten. 
 
• As enzimas alostéricas respondem a variações na concentração 
de substrato, bem como são susceptíveis a regulação por outras 
moléculas. 
Cinética Sigmoidal Cinética Hiperbólica 
REGULAÇÃO ENZIMÁTICA: ENZIMAS ALOSTÉRICAS 
OUTRAS ESTRATÉGIAS DE REGULAÇÃO ENZIMÁTICA 
MODIFICAÇÕES COVALENTES REVERSÍVEIS 
• Grupos variados podem ser adicionados/removidos a um ou mais 
resíduos de aminoácidos da enzima regulatória, em reações 
conduzidas por enzimas distintas. 
OUTRAS ESTRATÉGIAS DE REGULAÇÃO ENZIMÁTICA 
Fosforilação 
• Consiste no tipo de modificação regulatória mais importante. 
• Estima-se que 1/3 de todas as proteínas de uma célula eucariótica 
sofra um ou mais eventos de fosforilação na sua regulação. 
Adição de P – Proteína-cinases 
 
Remoção de P – Proteína-fosfatases 
OUTRAS ESTRATÉGIAS DE REGULAÇÃO ENZIMÁTICA 
Fosforilações múltiplas possibilitam um controle requintado da 
regulação enzimática 
OUTRAS ESTRATÉGIAS DE REGULAÇÃO ENZIMÁTICA 
Clivagem Proteolítica 
• Em algumas enzimas, o precursor inativo (Zimogênio) é hidrolisado para formar 
a enzima ativa. 
• Estas clivagens específicas provocam modificações estruturais que expõe o sítio 
ativo da enzima. 
• Esses mecanismos de ativação são irreversíveis, logo, são necessários outros 
mecanismos para sua inativação (ligação de proteínas inibidoras ao sítio ativo)