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Estrutura e função dos ácidos nucléicos Biologia Molecular - 4° período As descobertas • 1868 Johanm Friedich Miescher isola substancia ácida das células do pus que foi chamada de NUCLEÍNA – Nucleína apresentava grandes quantidades de nitrogênio e fósforo • Década de 1940 é documentada a existência de cadeias polinucleotídicas, o principal componente do material ácido na nucleída de Miescher • 1944 é estabelecido que os ácidos nucléicos estão relacionados com a estocagem e transmissão da informação genética • Havia relutância em aceitar o DNA como responsável pela transmissão genética por ser muito simples Proteínas apresentavam maior variabilidade • O DNA teria que reunir as seguintes características: – Capacidade de auto-replicação – Capacidade de codificar informações em grande número • Os blocos construtivos do DNA eram conhecidos, mas a sua estrutura não. Estes blocos são nucleotídeos formados de: Desoxirribose, Base nitrogenada, Fosfato • 1953 é descrita a estrutura dos ácidos nucléicos. Watson e Crick Propuseram a estrutura da dupla hélice do DNA Construção de modelo Reunião de resultados de experimentos anteriores 1- Componentes químicos do DNA (nucleotídeos) 2- Regra de Chargaff da composição de bases 3- Análise da difração de raios X do DNA O que foi proposto • Cada cadeia polinucleotídica consiste em uma sequência de nucleotídeos ligados por ligação fosfodiéster • Os dois filamentos são unidos por pontes de hidrogênio • Os pares de bases estão intercalados entre as duas cadeias perpendiculares como degraus de uma escada helicoidal • O pareamento de bases é específico (A-T; C-G) que é resultante da formação das pontes de hidrogênio Propriedades do Material genético 1- Replicação fiel a cada divisão celular, ou seja, as características estruturais do DNA devem permitir tal característica; 2- Possuir um conteúdo informacional – codificação das proteínas expressas em um organismo; 3- Ser capaz de mudar, ou seja, ser passivo de mutações (em raras ocasiões) – seleção evolutiva ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLÉICO - DNA Contém toda a informação genética de um organismo Esta informação está organizada em unidades hoje conhecidas como GENES Gene: Segmento de uma molécula de DNA que contém a informação necessária para a síntese de um produto biológico funcional, seja um RNA ou uma protéina Natureza química do ácido nucléico Nucleotídeo São as subunidades dos ácidos nucléicos – DNA e RNA Fosfato Pentose Base Nitrogenada Lig. glicosídica Monossacarídeo que possui 5 átomos de carbono Conformações da Ribose Os ácidos nucléicos apresentam apenas a forma fechada da ribose Ribose X Desoxirribose A desoxirribose, também denominada D-Desoxirribose ou 2-desoxirribose, é derivada da ribose por substituição do grupo hidroxila na posição 2 por hidrogénio, resultando na perda de uma átomo de oxigénio RNA DNA Bases Nitrogenadas O caráter ácido dos nucleotídeos é devido à presença de resíduos de fosfato, derivados do ácido fosfórico – H3PO4, que se dissociam em pH intracelular, liberando íons hidrogênio (H+) e deixando o fosfato carregado negativamente Grupamento fosfato Nucleotídeo – estrutura geral Nucleotídeos • Nucleotídeo: Base nitrogenada + Pentose + Fosfato • Nucleosídeo: Base nitrogenada + Pentose DNA RNA Purinas Pirimidinas Os nucleotídeos, tais quais outros componentes celulares contendo bases purínicas ou pirimidínicas, podem ser facilmente detectados por absorverem LUZ ULTRAVIOLETA (UV). O comprimento de onda correspondente à absorção máxima para a maioria desses compostos é aproximadamente 260nm A medida de ABSORVÂNCIA está relacionada à intensidade de radiação absorvida por uma solução, esta é proporcional à sua concentração e à distância percorrida pelo feixe luminoso através da amostra; Absorção de luz UV pelos nucleotídeos Outras funções dos nucleotídeos Além de formarem os ácidos nucléicos, os nucleotídeos possuem outras funções nas células • Carreadores de energia química – ATP (Além do ATP, outros nucleotídeos, CTP, TTP e GTP, podem desempenhar esta função. Os mono- e dinucleotídeos AMP e ADP também são importantes intermediários energéticos no metabolismo) • Componentes de cofatores enzimáticos (Alguns nucleotídeos são componentes de nicotinamida adenina dinucleotídeos, NAD+(oxidada) e NADH (reduzida), e de flavina mono- e dinucleotídeos, FMN (oxidada)e FAD (reduzida). Estes compostos existem nas formas oxidada e reduzida, o que os torna cofatores importantes para as reações de oxirredução catalisadas enzimaticamente • Mensageiros químicos (cAMP intracelular responde a sinais extracelulares, transferindo-os para o processo metabólico no interior da célula) Transportador de energia A hidrólise do fosfato gera energia química que pode ser usada em diferentes reações químicas Formação da dupla hélice do DNA Formação da dupla hélice do DNA Formação da cadeia de nucleotídeos A ligação dos nucleotídeos é feita através de ligações fosfodiéster São ligações covalentes onde o grupo fosfato de um nucleotídeo é ligado ao grupo hidroxila do próximo nucleotídeo Formação da ligação fosfodiester envolve o ataque nucleofílico do 3’ OH da cadeia crescente no fosfato do carbono 5´ do nucleotídeo trifosfatado que será incorporado A ligação do tipo fosfodiéster é resultante de uma REAÇÃO DE CONDENSAÇÃO entre nucleotídeos-trifosfatos, ricos em energia, com liberação de pirofosfato inorgânico (P2O6 3-) e água Reação de condensação entre dois nucleotídeos e formação de ligação fosfodiéster entre a hidroxila do C3' de um nucleotídeo e o fosfato do C5' do nucleotídeo adjacente A cadeia de DNA e RNA possuem propriedades hidrofílicas: -O grupo hidroxila do resíduo de açúcar forma ligações de hidrogênio com a água. - O grupo fosfato, está ionizado e carregado negativamente em pH 7,0. A carga negativa é geralmente neutralizada por cargas positivas de proteínas e íons metais. Todas as ligações fosfodiéster possuem a mesma orientação ao longo da cadeia, ou seja, cada fita de ácido nucléico possui uma polaridade específica denominadas terminações 5’ e 3’. A direção do crescimento da fita de uma cadeia nucleotídica é sempre 5’ 3’ Oligonucleotídeo: cadeia curta de ácido nucléico ( 50 ou menos nucleotídeos) Polinucleotídeo: cadeia longa de ácido nucléico Características da cadeia nucleotídica O pareamento de bases e a formação da dupla fita de DNA 2 ligações de hidrogênio 3 ligações de hidrogênio Ponte de hidrogênio As fitas do DNA são antiparalelas Watson e Crick deveriam estabelecer se as fitas do DNA seriam paralelas ou antipararelas. Ou seja, se as ligações fosfodiéster que ocorrem no sentido 5’para 3’ ocorreriam na mesma direção ou direções opostas; Uma orientação antiparalela produziu um modelo mais convincente; Posteriormente, evidências experimentais utilizando DNA polimerases confirmaram o antiparalelismo das fitas de DNA; * Ligação de hidrogênio – ligação fraca – representa aprox. 3% da força de uma lig. covalente 10,5 pb A disposição planar dos átomos dos anéis das bases nitrogenadas é importante, pois permite o “empilhamento das bases”. Isto contribui para minimizar o contato das bases com água e as forças de empilhamento estabilizam a dupla hélice quase tanto quanto as pontes de hidrogênio DNA pode apresentar diferentes conformações Diferenças: -N° de pb por volta da hélice - Posicionamento dos pbem relação ao eixo da hélice -Direção do enrolamento da hélice (esquerda ou direita) 1- diferentes conformações da desoxirribose 2- rotações nas ligações da desoxirribose com o fosfato 3- rotação na ligação entre a base nitrogenada e a desoxirribose As variações estruturais no DNA são resultados de : DNA pode apresentar diferentes conformações Conformação B presente em condições fisiológicas. É a mais comum Conformação A Presente em condições de altas concentrações de sais ou em estado parcialmente desidratado Conformação Z Forma levógira. Ocorre em duplas hélices ricas em par G:C. Trechos curtos em procariotos e eucariotos. Regulate DNA metabolism, such as replication, transcription, recombination, and mutation, are still under investigation. Propriedades químicas do DNA A dupla fita de DNA pode ser desnaturada e posteriormente renaturada Replicação e Transcrição do DNA Propriedades químicas do DNA Propriedades químicas do DNA Desnaturação - Variação extrema de pH - Aumento da temperatura - Baixa concentração iônica - soluções alcalinas - Soluções concentradas de formamida e uréia Renaturação (anelamento) -Condições fisiológicas A temperatura em que se atinge o ponto médio da desnaturação total de um DNA é chamada “temperatura de fusão”ou “temperatura de transição”, sendo representada por Tm (melting temperature). A estabilidade do DNA dupla hélice e, portanto,os valores de Tm dependem de diversos fatores, tais como natureza do solvente, tipo e concentrações de íons na solução e pH. DNA parcialmente desnaturado Ácidos nucléicos de diferentes espécies podem formar híbridos * RNA e DNA também podem formar híbridos DNA genômico de todos os procariotos e de alguns vírus são moléculas circulares. Também são encontrados nas mitocôndrias e cloroplastos. DNA Circular Desnaturação de um DNA circular Molécula helicoidal Complementar Antiparalela Duas periodicidades: 22A – Sulco maior 3.4A – Sulco menor Possui diferentes conformações (forma B, A e Z) Separação reversível da dupla fita (desnaturação/ renaturação) Linear ou circular Características da Estrutura do DNA Transformações não enzimáticas nos nucleotídeos • Purinas e pirimidinas podem sofrer alterações espontâneas na sua estrutura; • As taxas de ocorrências destas alterações são geralmente muito baixas, mas são fisiologicamente significativas; • Alterações na estrutura do DNA que produzem mudanças permanentes na informação genética, são chamadas MUTAÇÕES; Principais transformações: - Desaminação - Depurinação Desaminação Perda espontânea do grupamento amino Depurinação Reações promovidas por radiações UV Dímeros de timina RNA – Aspectos estruturais e funcionais Estrutura do RNA Molécula de fita simples que pode apresentar diferentes conformações Ribose X Desoxirribose A desoxirribose, também denominada D-Desixirribose ou 2-desoxirribose, é derivada da ribose por substituição do grupo hidroxila na posição 2 porhidrogénio, resultando na perda de uma átomo de oxigénio RNA DNA Características da estrutura do RNA Açúcar é a ribose (possui um grupamento hidroxila no C2) É formado por : adenina, citosina, guanina e URACILA Devido ao grupamento hidrolixa no C2, a estrutura do RNA se torna mais lábil do que a do DNA. Em uma solução alcalina, o RNA é clivado em mononucleotídeos enquanto que o DNA não É uma molécula de fita simples que pode apresentar diversas estruturas secundárias Instabilidade do RNA OH- ions in the solution remove a proton from the 2′-OH of ribose; the 2′-O- then is attracted to the central, relatively positive, phosphorus. The resulting inter-mediate can be resolved by the cleavage of the phosphodiester bond and the breaking off of the next nucleotide in the chain Diferentes conformações da molécula de RNA Diferenças no tamanho e nas conformações dos vários tipos de RNA permitem que eles possuam funções específicas nas células; As estruturas secundárias nas fitas simples de RNA são formadas pelo pareamento de bases; “Hairpins” ou grampos são formados pelo pareamento de bases envolvendo ≈5 – 10 nucleotídeos; “stem-loops” ou voltas são formados pelo pareamento de bases que são separadas por ≈50 a centenas de nucleotídeos; Estes arranjos podem formar estruturas terciárias mais complexas denominadas “pseudoknot” ou falso-nó; Figure 4-12RNA secondary and tertiary structures (a) Stem-loops, hairpins, and other secondary structures can form by base pairing between distant complementary segments of an RNA molecule. In stem-loops, the single-stranded loop (dark red) between the base-paired helical stem (light red) may be hundreds or even thousands of nucleotides long, whereas in hairpins, the short turn may contain as few as 6 – 8 nucleotides. (b) Interactions between the flexible loops may result in further folding to form tertiary structures such as the pseudoknot. This tertiarystructure resembles a figure-eight knot, but the free ends do not pass through the loops, so no knot is actually formed Diferentes conformações da molécula de RNA Figure 6-6RNA can fold into specific structures RNA is largely single-stranded, but it often contains short stretches of nucleotides that can form conventional base-pairs with complementary sequences found elsewhere on the same molecule. These interactions, along with additional “nonconventional” base-pair interactions, allow an RNA molecule to fold into a three-dimensional structure that is determined by its sequence of nucleotides. (A) Diagram of a folded RNAstructure showing only conventional base-pair interactions; (B) structure with both conventional (red) and nonconventional (green) base-pair interactions; (C) structure of an actual RNA, a portion of a group 1 intron(see Figure 6-36). Each conventional base-pair interaction is indicated by a “rung” in the double helix. Bases in other configurations are indicated by broken rungs. Diferentes conformações da molécula de RNA Uracila pareia com Adenina Vantagem evolutiva do uso da Timina no DNA Tipos de RNAs RNA também pode estocar informação genética Vírus de RNA Experiência de Fraenkel-Conrat e Singer (1957) Vírus do mosaico do tabaco Holmes ribgrass Dogma da Biologia Molecular DNA RNA Proteína Entendimento de como a informação hereditária é expressa Como essa maquinaria surgiu???? O mundo do RNA Hipótese de que um mundo de RNA tenha existido antes do aparecimento das células atuais RNA – molécula autocatalítica • Capaz de catalisar uma variedade de reações químicas incluindo a sua própria síntese; • Sistemas de auto-replicação de RNA não foram encontrados na natureza, porém tal cenário pode ser evidenciado em laboratório; • Os primeiros biopolímeros foram provavelmente “polímeros semelhantes ao RNA – pré-RNA • A base da hipótese do mundo do RNA é que as moléculas de RNA atuam tanto como carreadores de informação quanto de catalisadores ; Moléculas pré-RNA Ribozimas Moléculas de RNA com propriedades catalíticas Família de moléculas de RNA de suporte mútuo, uma catalisando a reprodução das demais Hipótese de que o RNA precedeu o DNA e as proteínas na evolução - Nas células primordiais Moléculas de pré-RNA teriam funções genéticas, estruturais e catalíticas. O RNA teria gradualmente adquirido estas funções. -Nas células atuais O DNA é o repositório da informação genética, e as proteínas realizam a grandemaioria das funções catalíticas nas células. Hoje, o RNA participa como um intermediário na síntese protéica, embora continue atuando como catalisador em várias reações importantes. O Dogma Central da Biologia Molecular O dogma central define o paradigma da biologia molecular, em que a informação é perpetuada através da replicação do DNA e é traduzida através de dois processos: A transcrição que converte a informação do DNA em uma forma mais acessível (uma fita de RNA complementar) e através da tradução que converte a informação contida no RNA em proteínas A exceção é a replicação retroviral, na qual o RNA viral é molde para síntese do DNA do provírus Dogma central - A perpetuação do ácido nucléico pode envolver tanto DNA ou RNA como material genético - A expressão da informação genética celular é geralmente unidirecional
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