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Nutrição Microbiana Todos os nutrientes microbianos são originados dos elementos químicos. Hidrogênio, Carbono, Nitrogênio, Oxigênio, Fósforo, Enxofre e Selênio são essenciais a todos os microrganismos. A nutrição microbiana é o mecanismo que fornece ás células as ferramentas químicas necessárias à síntese dos diversos monômeros (nutrientes). • Macro nutrientes: carbono e nitrogênio Fonte de C orgânico: aminoácidos, ácidos graxos e orgânicos, açúcares e etc (heterotróficas). C inorgânico: CO2 (autotróficas). Fonte de N: normalmente inorgânicos, NH3, NO3- ou N2. O N pode ser utilizado somente pelas bactérias fixadoras de N. Outros macro nutrientes P, S, K, Mg, Ca e Na são de fontes inorgânicas. • Micronutrientes Elementos traços, geralmente correspondem aos metais de papel estrutural nas enzimas. Quando necessário são adicionados a partir de uma solução. • Fatores de Crescimento São compostos orgânicos que alguns tipos celulares necessitam em pequenas quantidades, geralmente são vitaminas, aminoácidos, purinas e pirimidinas (Biotina, Cobalamina, Tiamina e Vitaminas B6). As vitaminas são as normalmente requeridas (fazem parte das coezimas). • Meio de Cultura É o nome que se dá à associação qualitativa e quantitativamente equilibrada, de substâncias que, por sua natureza, permitem o cultivo dos microrganismos fora do seu habitat ou meio natural. Este deve conter os elementos necessários ao cultivo do microrganismo (água, fontes de C, N, S, sais, extratos de leveduras e carne, aguar). O pH, a tensão de O2 e esterilidade também são requisitos. Existem duas classes de meios utilizadas na microbiologia: Meios quimicamente definidos: são preparados pela adição de quantidades precisas de compostos químicos (orgânicos e inorgânicos) em água destilada. Meios complexos ou indefinidos: empregam produtos de digestão comercializados em pó (caseína, soja, carne e etc). A desvantagem é a perda de controle em relação à composição do nutriente. Esterilizar todos os meios. • Cultivo de Microrganismos O cultivo artificial em condição previamente definidas e reprodutíveis integra, junto com a esterilização e a prática asséptica, o fundamento científico da técnica microbiana. Classificação dos meios quanto à: Apresentação: sólidos, líquidos ou semi-sólidos. Origem dos constituintes: naturais ou sintéticos. Natureza dos constituintes: meios minerais, orgânicos ou mistos. Finalidade: meios de cultivo, enriquecimento, identificação, diferenciais, especiais e conservação. • Técnica Asséptica É um conjunto de procedimentos empregados para impedir a contaminação durante a manipulação de objetos estéreis ou de culturas microbianas. Exemplo de transferência asséptica: A alça é aquecida ao rubro, o tubo é destampado, a boca do tubo é passada pela chama, a amostra é coletada com a alça estéril, a boca do tubo é novamente passada pela chama, o tubo é tampado e a amostra é transferida para o meio estéril. • Processos Fermentativos Químicos: condições drásticas Enzimáticos: condições brandas Fermentativos: uso de microrganismos em condições brandas. • Conservação de Energia Respiração: é a oxidação completa de um composto orgânico, sendo que o oxigênio ou outro aceptor exógeno irá atuar como aceptor final de elétrons. Fermentação: é a oxidação parcial de um composto orgânico, sendo que o composto orgânico é o aceptor final de elétrons. Ocorre na ausência de um aceptor exógeno (limitações na quantidade de energia gerada). Mecanismo de Síntese de ATP Fosforilação em nível de substrato: ocorre durante as etapas do catabolismo de um composto orgânico. Fosforilação oxidativa: ocorre devido à força próton motiva. Fotofosforilação: ocorrem em organismos fotossintetizantes, similar à fosforilação oxidativa. Exemplo de Fermentação: Glicólise É a oxi-redução internamente balanceada com produção de energia pela fosforilação em nível de substrato. Sendo dividida em 3 estágios: Estágio I: envolve uma série de rearranjos com a formação de 2 moléculas de gliceraldeído 3-fosfato e consumo de 2 ATPs. Estágio II: ocorre a primeira reação de oxi-redução, sendo a energia conservada na forma de ATP, com a formação de 2 moléculas de piruvato e 4 moléculas de ATP. Estágio III: reações anaeróbicas do piruvado, com a formação de produtos de fermentação. • Estágio I Duas fosforilações, nenhuma reação de oxi-redução, sem transferência de elétrons. A enzima aldose cliva a frutose 1,6 bifosfato em 2 moléculas com 3 carbonos (gliceraldeído 3-fosfato e o seu isômero di- hidroxicetona fosfato). • Estágio II 1ª reação redox, a coenzima NAD+ é responsável por receber os átomos de H liberados (há adição de Pi). Ocorre a formação de 4 ATP, dois para cada ácido 1,3 – bifosfoglicério convertido em piruvato. Esta síntese é denominada de fosforilação em nível de substrato. • Estágio III O NAD+, que é um transferidor de elétrons na célula é muito pequeno, necessitando da oxidação do NADH a NAD+ para continuar a glicólise. A regeneração do NAD+ é realizada através de reações envolvendo a redução do piruvato a vários produtos de fermentação. Fermentação / Respiração As fermentações geram pouca energia pois os átomos de C do composto original são parcialmente oxidados e a diferença entre os potenciais de redução do doador de elétrons e o aceptor final de elétrons é pequena. Com O2 ou outro aceptor final apropriado todo o substrato pode ser oxidado a CO2 com maior produção de ATP (respiração aeróbica: O2 é o aceptor final de elétrons). Há uma tabela de par redox, os elétrons doados por compostos no topo da torre são capturados por diferentes aceptores. Quanto maior a distância entre o doador e o aceptor de elétrons maior é a energia liberada. Respiração Aeróbica Pode ser dividida em: I - Transformação do carbono orgânico em CO2 através de vias bioquímicas. II – Síntese de ATP mediada pela força próton motiva. • I Transformação do Carbono Orgânico Glicólise → formação do piruvato + ciclo do ácido cítrico (CAC) → completa oxidação do piruvato a CO2. Ciclo do Ácido Cítrico (CAC): o piruvato é descarboxilado → CO2 + NADH + acetil acoplado à coenzima A (reações catalisadas por complexo enzimático). O grupo acetil da acetil-CoA combina-se ao oxalacetato → formação do ácido cítrico. A energia utilizada para síntese é proveniente da ligação de alta energia da acetil-CoA. São várias reações de hidratação, descarboxilação e oxidação → liberação de 2 CO2 + 3 NADH + FADH. Regeneração do oxalacetato. • II Síntese de ATP mediada pela força próton motiva 1º) Os átomos de hidrogênio do NADH são separados em prótons (H+) e elétrons (e-). 2º) Os prótons (NADH e dissociação da H2O) são bombeados para o meio externo, tornando a membrana externa ácido e de carga positiva. 3º) Os elétrons são transportados até o aceptor final (respiração aeróbia O2). Estabelecimento do estado energizado da membrana. O complexo enzimático ATPsintetase ou ATPase é responsável pela conversão da força próton motiva em ATP. Esta enzima tem um canal de prótons através do qual eles fluem do meio externo para o citoplasma. O processo parece envolver uma alteração conformacional da enzima (motor biológico). • Metabolismo Quimiorganotrófico • Metabolismo Quimiolitotrófico • Metabolismo Fototrófico • Catabolismo X Anabolismo Crescimento Populacional É o aumento de células microbianas em uma população de massa microbiana. Taxa de crescimento: número de células ou massa celular / unidade de tempo.Geração é o intervalo em que uma célula origina duas. Tempo de geração ou duplicação (g): corresponde ao tempo necessário para uma população dobrar de número. (g = t / n). Os tempos de geração variam muito nos diferentes organismos. Dependem dos meios de cultura e das condições de incubação. Onde n representa o número de gerações formadas em determinado intervalo de tempo t. • Parâmetros de Crescimento O aumento do número de células durante o crescimento exponencial ocorre em progressão geométrica. Tem-se a seguinte relação: N = N0.2n N, número de células final, N0 número de células inicial, n, número de gerações. Para calcular o n usa-se o logaritmo. • Ciclo de Crescimento Fase Lag: período variável, onde o número de microrganismos permanece inalterado. É observada quando as células: são transferidas para o mesmo meio, mas vindo de uma cultura antiga (tempo para sintetizar vários constituintes essenciais). São transferidas de um meio mais rico para outro mais pobre (síntese de enzimas). Sofrem traumas físicos ou químicos (tempo para reparar os danos). Não é observada quando uma cultura em crescimento é inoculada no mesmo meio com as mesmas condições de cultivo. Fase Log ou Exponencial: as células estão adaptadas, absorvendo nutrientes, sintetizando constituintes, crescendo e se duplicando. A taxa de crescimento é exponencial (geralmente, procariotos crescem mais rapidamente do que eucariotos). Fase Estacionária: os nutrientes estão escasseando e os produtos tóxicos estão se tornando mais abundantes. Não há crescimento líquido, ou seja, o número de células que se dividem é o mesmo é o mesmo ao número de células que morrem. Nesta fase que são sintetizados vários metabólitos secundários (antibióticos, algumas enzimas, esporulação das bactérias). Fase de Morte: a maioria das células está em processo de morte (embora outras ainda estejam se dividindo). A contagem permanece relativamente constante, enquanto a de viáveis cai lentamente. Em alguns casos ocorre a lise celular. Esta fase também é exponencial, mas a taxa de morte é muito inferior à taxa de crescimento exponencial (na maioria dos casos). • Medidas do Crescimento Microbiano Medidas Diretas: 1ª) Contagem de células totais: contagem microscópica direta com a utilização de câmaras especiais de contagem. (número de células / mL). 2ª) Contagem de células viáveis: é a determinação do número de células capazes de formar colônias em um meio sólido adequado, pressupõem que cada célula viável é capaz de originar uma colônia. 3ª) Medida da turbidez: método rápido e útil para estimar a quantidade de células em uma amostra com o uso do espectrofotômetro. 4ª) Diluição das suspensões celulares: são empregadas várias diluições decimais (10-1) da amostra, deve preparar 2 ou mais placas por diluição (na prática são contadas as placas que possuem entre 30 e 300 colônias). Devem ser expressas em unidades formadoras de colônia (UFC). Ex: na diluição de 10-3 mL tem-se 159 colônias, logo 159 x 103 = 1,59 x 105 células (colônias) por mL da amostra. • Turbidez (absorbância) X Número de células ou peso seco A absorbância é proporcional ao número de células ou peso seco, é necessário construir uma curva padrão (alta densidade celular leva a desvios). • Cultura Contínua Sistema de fluxo no qual um volume constante de meio fresco é adicionado e o mesmo volume de meio saturado é retirado. Quando o sistema atinge o equilíbrio temos que a concentração do substrato (S), células (X) e produto (P) são constantes. Nesse caso tem-se o interesse de manter as células na fase log ou estacionária. Dois fatores são importantes: a concentração de nutrientes (fontes de C ou N) e a taxa de diluição (D) (relação entre a vazão de alimentação F e o volume do meio V → D = F / V). D baixo: as células podem morrer por desnutrição, o nutriente limitante não está sendo adicionado de forma suficiente. D alto: a velocidade de crescimento do organismo não é suficiente para manter a concentração das células constante. Vantagem: a população pode ser mantida na fase exponencial de crescimento por longos período. • Efeitos Ambientais no Crescimento Ajuda a explicar a distribuição dos microrganismos no meio ambiente, otimização das atividades microbianas, possibilita desenvolver métodos de controle. São quatro os principais fatores: temperatura, pH, disponibilidade de água e oxigênio. Efeito da Temperatura: pode ser considerado o principal fator ambiental. - Psicrófilo: T < 15 ºC, muito pouco conhecidos, apenas algas que crescem sob o gelo. - Mesófilos: 20 ºC < T < 45 ºC - Termófilo: 45 ºC < T < 80 ºC - Hipertermófilo: T > 80 ºC, Os termófilos/hipertermófilos são os de maior interesse porque realizam os processos com maior rapidez, menor contaminação e possuem enzimas termoestáveis. Efeito do pH: o pH ótimo é o pH do meio externo. O pH intracelular deve ficar próximo à neutralidade (evitando a destruição de macromoléculas sensíveis aos ácidos ou bases). Nos acidófilos ou alcalinos extremos, o pH intracelular pode variar muito. Em ambientes naturais há uma faixa de pH de 5 a 9 para o crescimento de diferentes tipos de microrganismos. - Bactérias: entrono de 7 (algumas acidófilas 2 – 3,5 e outras alcalifílicas) - Fungos: dentem a ser mais acidófilos que as bactérias. Tampões são adicionados para mandar o pH constante nos meios. Disponibilidade de água: Todos os microrganismos precisam de água, embora as suas necessidades sejam variadas, dependendo da concentração dos solutos (sais, açúcares e etc). No processo de osmose a água se difunde a partir de uma região onde ela está em alta concentração (concentração do soluto baixa) para onde a sua concentração é baixa (concentração do soluto alta). Os microrganismos que vivem em ambientes onde a disponibilidade de água é baixa desenvolvem mecanismos para extrair água do ambiente através do aumento da concentração interna dos solutos (bombeando íons para o interior ou sintetizando solutos orgânicos). Efeito da salinidade: microrganismos marinhos tem a necessidade específica de íon sódio (halófilos) - Halotorerantes: não requerem sal para o seu crescimento, mas podem crescem em presença de altas concentrações de sal. - Halófilos: podem ser discretos (1 a 6 %) ou moderados (6 a 15 %) - Halófilos Extremos: são capazes de crescer em ambientes com concentração de NaCl entre 15 e 30 %. Efeito de Oxigênio: os microrganismos comportam-se de forma diversificada, sendo aeróbios, anaeróbios estritos, aeróbios facultativos, microaerófilos e anaeróbios aerotolerantes. As condições de anaerobiose podem ser conseguidos da seguinte forma: uso de agentes redutores, remoção mecânica de oxigênio (substituindo pelo N ou CO2), sistema GasPak e câmaras de anaerobiose. (a) Aeróbios: como o O2 penetra pouco no tubo, os aeróbios obrigatórios crescem na superfície. (b) Anaeróbios facultativos: são sensíveis ao O2, crescem somente no fundo. (c) Aeróbios facultativos: crescem na presença e ausência de O2, por toda a extensão do tubo. (d) Microaerófilos: se afastam da zona com maior quantidade de O2. (e) Anaeróbios aero tolerantes: crescem por toda a extensão do tubo. Entretanto crescem pouco na superfície (são fermentadores). Fermentação Transformação química provocado por fermento vivo ou por princípio extraído de fermento. Catabolismo anaeróbico no qual um composto orgânico atua como doador e aceptor de elétrons, gerando ATP pela fosforilação em nível de substrato. Processo em que microrganismos, usando como substrato um nutriente, pode produzirbiomassa, enzimas, metabólitos ou modificar compostos. Qualquer processo microbiológico que ocorre em larga escala sem a presença de ar. • Álcool e Bebidas Alcoólicas O álcool pode ser utilizado como combustível, bebida ou insumo em diversas indústrias. • Produção do Álcool Combustível O álcool é obtido principalmente por fermentação do caldo de cana ou melaço (resíduo da fabricação do açúcar), através de um processo bioquímico. Pode ser produzido a partir de qualquer carboidrato, sendo que as leveduras são os agentes de fermentação. • Bioquímica do Processo 1ª etapa: hidrólise da sacarose: C12H22O11 + H2O → C6H12O6 + C6H12O6 Sacarose invertase glicose + frutose 2ª etapa: fermentação alcoólica: C6H12O6 → 2H3C-CH2-OH + 2CO2 + energia Monossacarídeo → etanol + gás carbônico • Agente da Fermentação São empregadas linhagens seletivas da levedura Saccharomyces cerevisae. A cultura deve possuir: crescimento vigoroso, baixa produção de glicerol, elevada tolerância ao etanol (inibidor a altas concentrações, e a tolerância das leveduras é um ponto crítico para uma produção elevada). • Etapas da Fermentação Preparo do substrato, do mosto, do inóculo, fermentação e destilação Preparo do Substrato: a cana de açúcar (MP) é moída até um caldo contento sacarose (10 a 20 %). Há o arraste de impurezas através de peneiras fizas, rotatórias ou vibratórias ou decantação para impurezas menores. Um tratamento mais completo do caldo implica na adição de cal, aquecimento e posterior decantação, tratamento semelhante àquele utilizada na fabricação do açúcar. Preparo do Mosto: é o meio reacional ou de cultivo, a concentração de açúcar é definida conforme a produção pretendida e a viabilidade da levedura. O deve ter: isenção de sólidos, 10 – 20 % de açúcares totais, nutrientes minerais, ph 4,5 – 5,5, temperatura 26 a 35 ºC, contaminação por bactérias (Lactobacillus e Bacillus) < 102 → agentes antissépticos e antibióticos. Preparo do Inóculo: possui duas etapas (laboratório e industrial), concentração de açúcar de 5 – 13 ºBrix, utilizar nutriente para favorecer a multiplicação rápida da levedura (N, Mg, K e outros), aeração (ar comprimido e por aeração mecânica), temperatura 35 – 37 ºC e utilização de antibióticos (inibir o crescimento de bactérias). Obs: nas grandes destilarias utiliza-se leveduras de panificação. Fermentação: é realizada em dorna ou fermentador (reator) fechados ou abertos, operados de forma contínua ou descontínua. • Fermentação em batelada: apresenta 3 fases: 1ª preliminar ou lag: caracteriza-se pela multiplicação celular intensa, pequeno aumento de T e desprendimento de CO2. 2ª tumultuosa: intenso desprendimento de CO2, aumento de T, concentração de álcool e acidez, diminui densidade do meio. 3ª complementar: diminui de desprendimento de CO2 (menor agitação) e diminui T, a concentração de açúcares chega ao fim. Nesse processo são utilizadas várias dornas, que são cheias, fermentadas e processadas uma a uma. Há 4 tipos: Cortes: divide-se o mosto da 1ª fermentação em dois, completa-se o volume e deixa-se fermentar. Um envia- se para a destilaria e o outro é novamente dividido e é utilizado até os rendimentos diminuírem. Reaproveitamento do ióculo: deixa-se o mosto decantar e recupera-se o precipitado. Cultura Pura: a partir de um tubo de cultura. Recuperação de leveduras: através de centrifugação recupera-se as leveduras que são purificadas e novamente utilizadas. Características do processo: alto custo de instalação e automação e manutenção, facilidade no controle microbiológico e limpeza das dornas com maior frequência. • Fermentação contínua: as dornas de grandes dimensões operam da seguinte forma: 1º o mosto é misturado ao inóculo na 1ª dorna. 2º passara pelas demais em um processo contínuo até a última onde a concentração é a menor possível. 3º o vinho bruto desta última é enviado para a centrifugação 4º o vinho centrifugado é enviado para destilação. Característica do processo: facilidade e baixo custo de automação, instalação, difícil controle microbiológico e de limpeza das dornas. Destilação: tem como produto final álcool hidratado (mistura binária álcool-água) 96 ºGL. • Bebidas Alcoólicas É toda bebida que contém etanol em concentrações superiores a 0,5 % (v/v) ou 0,5 ºGL. Fermentadas: são aquelas em que o álcool é obtido por fermentação, mas não é concentrado pelo processo de destilação (o teor alcoólico é menor), cervejas e vinhos. Fermentadas-destiladas: são aquelas em que após a fermentação é realizada a destilação, são aguardentes (30 – 54 ºGL), cachaça, whisky e etc. Não-fermentadas: são obtidas por mistura de álcool, água, açucares em um suco, são licores (18 – 54 ºGL). • Cerveja É uma bebida obtida pela fermentação alcoólica do mosto preparado com malte de cevada e água potável, por ação da levedura, com adição de lúpulo, podendo parte do malte ser substituído por cereais ou por carboidratos de origem vegetal. Componentes do Mosto: Malte: é um grão de cevada que foi submetido a um processo de germinação controlada. Água: deve ser potável e isente de carbonatos para permitir a correção do pH para a faixa ideal. Lúpulo: é a flor fêmea da planta (Humulus lupulus) que contém grande quantidade de resinas amargas. Adjuvantes: cereais não maltadas que servem como fonte de amido (amido e arroz). Agente de fermentação: as leveduras são cepas da Saccharomyces cerevisae cujas habilidades em metabolizar os constituintes do modo depende dos seguintes fatores: características genéticas (cepa da levedura), fisiologia celular (tolerância de stress, viabilidade, vitalidade das células e concentração de inóculo), disponibilidade nutricional (nitrogênio, concentração de açúcares e íons metálicos) e condições físicas (temperatura, pH, oxigênio dissolvido e densidade do mosto). Fluxograma do Processo: Preparo do Mosto → Fermentação → Maturação → Filtração → Envasamento • Preparo do Mosto Baseia-se em fenômenos naturais, tento grande semelhança com a ato de cozinha. A fase fundamental é a transformação de amido em açúcar por meio das enzimas do malte. 1ª etapa - mosto doce: O grão macerado de malte + água e cozido a 40 ºC por 1 hora (ótima para ação das proteases). Após eleva-se a temperatura para 65 – 70 ºC por 30 minutos (T ótima para ação das amilases – sacarificação). A paralisação do processo ocorre quando a temperatura sobe para mais de 75 ºC (desnaturação de proteínas), o mosto doce é filtrado. 2ª etapa - mosto amargo: É feita adição do lúpulo e o mosto é fervido por 2 horas para extração das resinas amargas e precipitação das proteínas e por fim é esterilizado. 3ª etapa - filtração/resfriamento Filtração à quente → pré resfriamento (40 ºC) → filtração → resfriamento (10 ºC). • Fermentação Após o resfriamento o mosto é transferido para o tanque de fermentação e adiciona-se o inóculo, dando início a fermentação que pode ser de dois tipos: Baixa Fermentação: baixas temperaturas (6 – 12 ºC) e maior tempo de fermentação (8 – 14 dias), a levedura se deposita no fundo (cerveja clara 3,5 – 5 ºGL). Alta Fermentação: temperaturas mais elevadas (14 – 23 ºC) e menor tempo de fermentação (5 – 7 dias), cerveja do tipo ale 8 ºGL. • Maturação/Filtração/Armazenamento/Embal agem/Consumo Maturação: a cerveja é resfriada a 0 ºC e a maior parte do fermento é separada por sedimentação, ocorre uma fermentação secundária durante 6 a 30 dias, quando quase todo CO2 da cerveja é produzido, ao término dessa fase, a cerveja está praticamente concluída, comaroma e sabores finais definidos. Filtração: visa a eliminação das partículas em suspensão (proteínas e células de levedura) deixando transparente e brilhante. Armazenamento: é realizado em tanques de pressão para garantir a não assimilação do ar. Embalagem: o envasamento em garrafas, latas e etc, deve ser realizado com cuidado para que não seja incorporado oxigênio dentro das embalagens. Consumo: a cerveja deve ser consumida antes do prazo de validade. • Vinho É a bebida obtida por fermentação de mosto de uva sadia, fresca e madura. Tipos de vinhos, seco (açucares quase totalmente fermentados), doces (contém açúcar residual ou adicionado), fortificado (adicionado conhaque ou outra bebida), espumante (CO2 da fermentação secundária na própria garrafa) e licoroso (grande teor alcoólico e de açúcar). Colheita: no tempo certo. Colheita prematura (vinho aguado), tardia (vinho rico em álcool e com pouca acidez). Esmagamento: consiste em romper a película da baga, para liberar o mosto contido na polpa, que é posto em contato com ar e com as leveduras presentes na superfície da película. Fermentação: o vinho branco pode ser produzido tanto por uvas brancas como as tintas, nas quais foram retiradas as cascas. O SO2 é adicionado par atuar como anticéptico. Envelhecimento: o vinho é separado e sedimento e armazenado em baixas temperaturas, sendo transferido de várias vezes de um recipiente para o outro (trasfega) eliminando o depósito de precipitado. Tratamentos Complementares: clarificação é a aceleração pela adição de compostos denominadas agentes clarificantes (caseína, tanino ou argila bentonita) e filtração é realizada em terras diatomáceas, asbestos ou membranas filtrantes. Engarrafamento: envasa para envelhecimento adicional (tinto) ou comercializado (branco). Durante o envelhecimento ocorrem alterações químicas complexas (redução dos componentes amargos e aprimoramento do sabor e aroma). O teor alcoólico final do vinha varia de 6 – 14 ºGL, depende do teor da fermentação das uvas, da duração da fermentação e das linhagens de leveduras utilizadas. A vedação, com rolha de cortiça, protege o vinho das contaminações microbianas e das oxidações. Uva branca → remoção dos engaços esmagando as uvas (mosto) → (SO2) → o sumo mantém-se em contato com as cascas por 16 – 24 h → prensagem (sai polpa que é descartada) → (leveduras) → tonel de fermentação 10 – 15 dias → (SO2) → envelhecimento por 5 meses → trasfega → (agente clarificantes) → filtração → vinho branco. Uva tinta → remoção dos engaços esmagando as uvas (mosto) → (SO2 e leveduras) → tonel de fermentação pro 3 semanas (a polpa não é removida) → prensagem (sai polpa que é descartada) → envelhecimento em tonel → trasfega → (SO2) → transferência para tonéis limpos 3 vezes ao ano durante 2 anos → (agente clarificante) → tanque de fermentação → filtração → envase, envelhecimento nas garrafas por 6 messes ou mais → vinho tinto.
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