Aula Replicação de DNA

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Replicação de DNA
Universidade Federal da Bahia
Instituto Multidisciplinar em Saúde
Campus Anísio Teixeira
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Introdução
O DNA é um dispositivo maravilhoso para o armazenamento estável da informação genética.
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As fitas parentais do DNA são completamente desenoveladas antes que cada uma seja copiada?;
A replicação começa em lugares aleatórios ou em um ponto único?;
Depois da iniciação em qualquer ponto no DNA, a replicação prossegue em uma direção ou em duas?.
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A replicação do DNA segue um conjunto de regras fundamentais:
A replicação do DNA é semiconservativa;
A replicação começa na origem e usualmente prossegue bidirecionalmente;
A sintese de DNA prossegue em uma direção 5’ 3’ e é semidescontinua.
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Como ocorre a replicação?
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Meselson & Stahl (1958)
 Replicação semiconservativa;
Escherichia coli;
Centrifugação em gradiente de densidade;
 Uso do isótopo N14 e N15; 
 Crescimento por 14 gerações; 
 Bandeamento em gradiente. 
 N14 N14: banda leve.
 N14 N15: banda intermediária.
 N15 N15: banda pesada.
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O DNA é capaz de se autoduplicar para conservar a informação genética;
A molécula se abre e novos nucleotídeos são acrescidos, sempre seguindo a ordem A-T e G-C;
Ao final se tem duas “moléculas-filhas” que conservam a metade da “molécula-mãe”.
Conclusão
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Em que direção ocorre a replicação?
- Unidirecional com duas origens.
- Unidirecional com uma origem.
- Bidirecional com uma origem.
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- Replicação bidirecional: identifica duas forquilhas de replicação; 
- Estrutura .
John Cairns (1963)
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John Cairns (1963)
Autorradiografia em DNA de E. coli tratadas com meio contendo Timidina marcada com trítio (H3). 
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Qual enzima envolvida na replicação?
- Arthur Kornberg e colaboradores (Nobel 1959):
- E. coli: DNA polimerase DNA dependente (DNA pol I);
 Adicionam desoxinucleotídeos trifosfatados;
 Ligação do grupo livre 3’- OH;
 Direção: 5’  3’. 
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- Fidelidade de replicação: 109 pb replicados : 1 erro;
- Atividade exonucleásica 3’  5’ (correção de erros de leitura);
- Atividade exonucleásica 5’  3’ (liga-se à fita dupla do DNA em locais de aberturas – corrige quebras);
- Necessita de um RNA iniciador ou primer.
Características gerais da DNA polimerase
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 1955: Acúmulo de evidências que a DNA pol I não é adequada à replicação:
- Baixa processividade: velocidade na qual os nucleotídeos são adicionados;
- Estudos genéticos mostram muitas enzimas envolvidas na replicação;
Mutações na DNA pol I de E. coli: crescimento normal.
 1970: Descoberta das DNAs pol II e III:
- DNA pol II: função aparente de reparo;
- DNA pol III: 
	- Mais complexa: várias subunidades;
	- Envolvida na replicação (replicase DNA) e correção de erros.
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As DNA polimerases IV e V, identificadas em 1999, estão envolvidas em uma forma não usual de reparo
DNA polimerase
Arthur Kornberg descobriu a DNA polimerase I, dividiu um
Prêmio Nobel com o Samuel Ochoa.
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Exonuclease (degrada ácidos nucléicos a partir de uma extremidade da molécula)
Endonuclease (pode começar a degradar sítios internos específicos em uma molécula ou fita única de ácido nucléico
Atividade e exonuclease e endonuclease
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Desoxinucleosídeo
5´-trifosfato
entrando
Fita de DNA
em crescimento
(primer)
Fita de DNA
molde
* Toda DNA polimerase necessita de um molde.
* Toda DNA polimerase requer um iniciador.
* Toda DNA polimerase sintetiza DNA na direção 5´ para 3´, adicionando nucleotídeos em uma hidroxila 3´
Regras sobre as DNAs polimerases....
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Mecanismo de ação da DNA polimerase
 O íon Mg2+ inferior facilita o deslocamento do pirofosfato.
O íon Mg2+ superior facilita o ataque do grupo 3´-hidroxila do
iniciador no fosfato alfa do nucleotídeo trifosfato
 Pareamento do nucleotídeo que chega com o nucleotídeo do molde 
 O mecanismo
Catalítico envolve dois íons Mg2+.
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DNA polimerase I
Fragmento maior da digestão proteolítica da DNA pol I, sem a atividade exo 5´ à 3´.
Fragmento Klenow
Deslocamento do corte
(Nick translation)
Remove e substitui o primer/leitura de revisão
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DNA polimerase III associada 
a DnaB helicase
Subunidade requerida para a 
processividade ótima
Núcleo (αƐƟ)
Núcleo (αƐƟ)
DNA polimerase III
Síntese da fita líder (contínua) e atrasada (descontínua)
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Pontos centrais da polimerização
Necessidade de um molde;
Um iniciador é requerido: a DNA pol só adiciona nucleotídeos em uma fita pré-existente;
Processividade: número de nucleotídeos adicionado, em média, depende da dissociação e reassociação com o molde;
Se a síntese prossegue sempre na direção 5’  3’, como podem as duas fitas serem sintetizadas simultaneamente?
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Contribuição da geometria do par de bases – fidelidade da replicação
correta
incorreta
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Uma nova fita de DNA é sempre sintetizada em direção 5’ 3’, com OH 3’ livre como ponto de alongamento do DNA.
Como podem ambas as fitas serem sintetizadas simultaneamente? 
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Estrutura assimétrica (anti-paralela);
Fita líder: síntese contínua / mesma direção do movimento da forquilha de replicação;
Fita atrasada: síntese descontínua / direção oposta ao movimento da forquilha de replicação;
Fragmentos de Okasaki:
	- Bactérias: 1000 a 2000 nucleotídeos.
	- Eucariotos: 100 a 200 nucleotídeos.
Reiji Okasaki e colaboradores (1960)
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Replicação em procariotos
•Dividida em três etapas:
	- Iniciação;
	- Elongação;
	- Terminação.
• Iniciação:
- Origem: Ori C;
- 245 pb altamente conservadas;
- Duas sequências-chave:
	- 3 repetições de 13 pb ricos em AT;
	- 4 repetições de 9 pb.
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Etapas na replicação do cromossomo da E. coli
Iniciação
Alongamento
Terminação
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Crescimento e Reprodução Bacteriano
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 Proteínas envolvidas na iniciação
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A replicação do cromossomo da E. coli inicia no sítio de origem da
replicação (oriC).
ORI-C
Alvo de metilação
GATC
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 ± 20 moléculas de DnaA ligam-se a 4 repetições 
de 9pb
As 3 repetições de 13pb ricas em A=T são desnaturadas
Hexâmeros da proteína DnaB helicase se liga e desenovela ainda mais o DNA com ajuda da DnaC
1) ETAPAS DA INICIAÇÃO
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Helicase (DnaB) + primase (DnaG) = iniciossomo
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Proteínas envolvidas na replicação (alongamento)
 Helicase 
 Proteínas ligadoras de fita simples (SSB)
 Girase
 DNA polimerase I e III
 Primase
 Grampo deslizante
 Ligase
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DNA helicase
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DNA topoisomerase ou girase
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Proteínas ligadoras de fita simples (SSB)
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DNA primase
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Grampo deslizante
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Retirada dos “primers” – DNA pol I
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- A DNA ligase sela as quebras
Requer um grupo OH livre na extremidade 3' de uma das cadeias de DNA e um grupo fosfato na extremidade 5' da outra cadeia.
DNA ligase
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Ligase
Proteína ligadora a DNA
Helicase
DNA polimerase
DNA polimerase
Primase
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A síntese do DNA é semi-descontínua e requer um iniciador (primer) de RNA
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 Fragmentos de Okasaki ocorrem na fita descontínua
 A DNA polimerase III é responsável pela síntese da maior parte do DNA
 A DNA polimerase I remove o primer de RNA e preenche as lacunas
 A DNA ligase sela as quebras
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 TERMINAÇÃO:
-	Região 350 Kb flanqueada por 7 sítios de terminação;-	Forquilha anti-horário: TER A;
-	Forquilha horário: TER C;
Proteína TUS;
Desligamento da DNA pol III das fitas: topoisomerase
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Replicação em eucariotos
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 Joel Huberman e Arthur Riggs
(1968)
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- Várias origens de replicação ao longo dos cromossomos lineares;
- 1 origem a cada 3 – 300 Kb;
Conjuntos de 20 a 80 replicons;
Mecanismos para ativação dos replicons e prevenção de re-replicação: pouco compreendidos;
- DNA helicase é necessária.
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- Replicação Bidirecional:
Um experimento através da auto-radiografia de moléculas de DNA marcadas de culturas de células mamárias revelou grupos de replicons (unidades de replicação) com um ponto de origem de replicação central.
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Proteínas envolvidas na replicação
 Helicase 
 Proteínas ligadoras de fita simples (SSB)
 Girase
 DNAs polimerase (~13 sendo 5 mais importantes)
 Primase associada a DNA pol a
 Grampo deslizante
 Ligase
- Topoisomerase associada a Rp-a
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DNA polimerases eucarióticas
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Mecanismo para o início da replicação em eucariotos
ORC tem papel semelhante a dnaA
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cdK = quinane dependente de clclina
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ALONGAMENTO
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“Passagem” por um nucleossomo
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Duas proteinas fundamentais para esse processo:
Nap­1  transporta histonas de seu local de sínte­ se no citoplasma até o núcleo 
CAF­1  leva-­as até os sítios cromossômicos de montagem do nucleossomo
 
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Inibidores da “re-replicação do DNA”
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 Os cromossomos de eucariotos são lineares e apresentam sequências repetitivas em suas extremidades denominadas telômeros
A síntese da fita “leading” continua até o término da fita molde de DNA, no entanto, no telômero a extremidade feita pela primase na fita “lagging” não é digerida.
Como o iniciador é instável, ele se degrada com o tempo diminuindo, assim, o tamanho do cromossomo.
Telomerase age evitando a perda do fim do cromossomo.
Replicação dos telômeros
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Estrutura: sequências repetitivas de DNA sem função codificante;
Evitam a formação de cromossomos dicêntricos e perda de informação genética;
Similares em organismos diversos;
Fórmula geral: C (1-8) A / T (1-4);
Remoção inadequada do último RNA iniciador e substituição por DNA;
Molécula linear se encurta a cada ciclo de replicação;
Telomerase: promove o mecanismo de síntese nos telômeros;
Contém uma sequência curta de RNA que serve como molde;
Atuação é restrita em alguns tipos celulares: processo normal de envelhecimento e morte celular;
Terapia contra o câncer: se inibida, a célula tende à morte.
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Diferenças na replicação
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Replicação de eucarioto
Replicação de procarioto
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Deslocamento de corte – nesse processo, uma fita de RNA ou DNA pareada a um molde de DNA é simultaneamente degradada pela atividade exonucleásica 5’ – 3’ da DNA polimeraseI e substituída pela atividade polimerásica da mesma enzima. Essas atividades apresentam papel tanto no reparo quanto na remoção de iniciadores. O corte é posteriormente selado pela ligase.
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1- cada Dna A se liga a um ATP. E o DNA se enovela ao redor desse complexo.
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