Exercício eletroforese

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Exercício 2 
DNA e Eletroforese 
Você já aprendeu sobre as enzimas de restrição e como elas clivam o DNA em 
fragmentos. Você também deve ter notado que, em alguns mapas de restrição, uma 
enzima pode produzir muitos fragmentos de DNA. Para realizar a digestão com 
enzimas de restrição, basta acrescentar ao DNA a enzima desejada e deixa-la agir 
num tempo e temperatura apropriados. Antes de a reação começar, a mistura no tubo 
parece um fluido claro. Ao término da reação, a mistura continua clara! Olhando 
apenas para o tubo, como você pode dizer que aconteceu alguma coisa? 
Para verificar o produto de uma reação de digestão com enzimas de restrição, você 
deve ser capaz de visualizar os diferentes fragmentos produzidos. Existem corantes 
químicos que coram o DNA, mas obviamente não é bom adicionar estes corantes à 
mistura no tubo. No laboratório, os cientistas utilizam um processo chamado 
eletroforese em gel para separar os fragmentos de DNA de modo que eles podem 
visualizar o resultado de uma digestão (além de outros procedimentos). 
A eletroforese em gel utiliza a natureza química do DNA para separar os fragmentos. 
Sob circunstâncias normais, os grupos fosfato na cadeia do DNA são carregados 
negativamente. Então, as moléculas de DNA são muito mais atraídas pelo que é 
carregado positivamente. No gel de eletroforese, as moléculas de DNA são colocadas 
em um campo elétrico (o qual tem um pólo positivo e um pólo negativo) e vão migrar 
para o pólo positivo. 
O campo elétrico faz com que as moléculas de DNA se movam, mas para que elas se 
separem e sejam distinguidas umas das outras, todo o processo ocorre em um gel (daí 
vem o nome eletroforese em gel). Para separar o DNA, são utilizados diferentes tipos 
de gel. O gel mais freqüentemente utilizado na eletroforese de DNA é chamado de 
agarose e se comporta como uma gelatina comestível, porém sem açúcar e sem cor. 
Para fazer um gel para DNA (ou para moldar um gel), você deve dissolver a agarose 
em pó em um tampão fervente, colocar em um recipiente apropriado e deixar resfriar. 
Enquanto isto esfria, solidifica. 
Para aplicar o DNA no gel de agarose, utiliza-se um pente apropriado na agarose 
ainda líquida e já disposta no recipiente. Quando a agarose se solidifica e o pente é 
retirado, permanece uma fila de pequenos orifícios no gel. As amostras de DNA são 
colocadas nos poços antes do início da eletroforese. 
Para a eletroforese, todo o gel é colocado em uma cuba de eletroforese com um 
tampão (água + sal). É aplicada uma corrente elétrica, a qual vai fluir através do 
tampão e do gel. Quando a corrente é aplicada, as moléculas de DNA começam a 
migrar para o pólo positivo do campo elétrico (Figura 2). 
 
 ­ 
 
 
 
 
 
 + 
 
 
Figura 2. Na eletroforese, o gel é colocado em uma cuba com solução salina e é 
aplicada uma corrente elétrica. O DNA carregado negativamente migra para o pólo 
positivo. 
Todo o DNA migra para o pólo positivo, mas o material do gel torna a migração mais 
difícil para as moléculas de DNA maiores do que para as menores. Então, em um 
mesmo período de tempo, um fragmento pequeno de DNA pode migrar muito mais 
longe do que um fragmento grande. Você pode pensar no gel de eletroforese como 
uma pista de corrida onde os “corredores” (as moléculas a serem separadas) se 
separam como atletas em uma corrida real (Figura 3). As moléculas menores correm 
mais rápidas. Duas moléculas do mesmo tamanho vão correr exatamente juntas. 
+ 
+ 
+ 
 
Figura 3. Na eletroforese, os “DNAs pequenos” sempre ganham. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cuba de eletroforese com 
solução salina 
      
 
 
 DNA Fonte de 
energia 
Após algum tempo, a corrente elétrica é cortada e o gel é colocado em uma solução 
corante. Após a coloração, o DNA pode ser visualizado. O método mais utilizado 
pelos pesquisadores é a coloração com brometo de etídio. Quando o brometo de 
etídio se liga ao DNA, este fluoresce sob luz ultravioleta (UV). (Obs: O brometo de 
etídio é mutagênico e requer extrema cautela durante a sua utilização e recipientes 
adequados para descarte). O padrão observado é uma série de riscos (bandas) no 
gel; cada banda é composta por moléculas de DNA de um tamanho. Na verdade, 
existem milhões de moléculas de DNA em uma mesma banda, mas elas são do 
mesmo tamanho (ou de tamanhos muito próximos). Após a digestão com enzimas de 
restrição, o gel deve apresentar uma banda para cada fragmento de tamanho diferente 
produzido na digestão. O fragmento menor será aquele que migrou mais longe do 
poço onde foi colocado a amostra e o fragmento maior será aquele que migrou menos 
(Figura 4). 
 
A B 
 Amostras 
 
 9.000 (Não há amostras 
 8.000 no restante do gel) 
 
 
 
 4.000 
 3.000 
 
 2.000 
 
 
 
 
 
Figura 4. Uma das finalidades da eletroforese em gel é separar produtos 
de digestão com enzimas de restrição. (A) Mapa de restrição com o 
tamanho dos fragmentos em pares de base. (B) Esquema de um gel 
após a eletroforese. 
 
8.000 2.000 3.000 4.000 9.000 
1. Digestão com enzima de restrição 
2. Eletroforese 
3. Visualização e análise do gel 
Atividade 
Nas próximas páginas, você tem três representações de uma molécula de DNA 
(Apêndice 1) e o esquema de um gel de eletroforese (Apêndice 2). No Apêndice 1 
estão representados os sítios de três enzimas de restrição diferentes na mesma 
molécula de DNA. Você vai simular a digestão deste DNA com cada uma das três 
enzimas e então vai simular a eletroforese dos fragmentos de restrição em um gel de 
agarose. 
1. Corte as três figuras da molécula de DNA. 
2. Simule a atividade da enzima de restrição EcoRI na molécula de DNA que mostra 
os sítios da EcoRI, cortando a faixa nas linhas verticais que representam os sítios 
da EcoRI. Após ter “digerido a molécula com a EcoRI” mantenha os seus 
fragmentos de restrição. 
3. Agora você vai digerir a segunda molécula de DNA com a BamHI. Preserve os 
fragmentos de restrição obtidos. 
4. Faça o mesmo com a última molécula de DNA, utilizando a enzima HindIII. 
5. Em seu gel de eletroforese imaginário, você vai separar os fragmentos da EcoRI, 
BamHI e HindIII como se você tivesse aplicado estas amostras em poços 
diferentes e adjacentes no gel. Arrume os seus fragmentos como se eles 
estivessem sido separados através de eletroforese em gel de agarose. (Os 
fragmentos maiores devem ficar mais próximos dos poços onde as amostras 
foram aplicadas). 
6. Agora, separe os fragmentos BamHI e coloque-os adjacente aos fragmentos 
EcoRI. Certifique-se de ter ordenado cada fragmento EcoRI corretamente pelo 
tamanho com relação aos fragmentos BamHI que você já havia disposto. 
7. Repita o mesmo procedimento para os fragmentos HindIII. Agora você deve ter 
três grupos de fragmentos dispostos na sua frente. 
8. Agora olhe para o esquema de um gel de eletroforese dado no Apêndice 2. Note 
que ele tem uma escala de tamanho dado em pares de bases disposta à esquerda 
dos poços do gel. Utilizando esta escala como um guia, desenhe o padrão obtido 
com a digestão que você realizou. Utilize um poço para a digestão com EcoRI, 
outro para a digestão com BamHI e um terceiro para a digestão com HindIII. 
9. Utilize as informações obtidas nas fitas de papel que você recortou para desenhar 
as bandas representando os fragmentos de restrição em pares de bases. 
Todos os fragmentos menores no gel estão na frente dos fragmentos maiores? Você 
notou que o tamanho da escala parece não ter intervalos regulares? Isto ocorre 
porque os fragmentos de tamanhos diferentes se comportam de forma diferente nogel 
de agarose. 
 
Apêndice 1 
 
Você tem a representação de três moléculas de DNA com 15.000 pares de bases. 
Cada representação mostra a localização de diferentes sítios de restrição (linhas 
verticais). Os números entre os sítios de restrição mostram os tamanhos (em pares de 
bases) dos fragmentos que serão gerados após a digestão do DNA com as 
respectivas enzimas. 
 
Sítios de restrição da EcoRI 
 
 
 
 
Sítios de restrição da BamHI 
 
 
 
 
Sítios de restrição da HindIII 
 
 
 
 4.000 3.500 2.500 5.000 
 6.000 4.000 3.000 2.000 
 8.000 4.500 2.500 
Apêndice 2 
 
Esquema de um gel de agarose. 
 EcoRI BamHI HindIII 
 
Escala de tamanho 
em pares de bases 
 
 8.000  
 
 6.000  
 
 
 
 4.000  
 
 3.000  
 
 
 2.000  
 
 
 
Amostras 