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<p>UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS</p><p>INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS</p><p>AULA 2: EXTRAÇÃO E ANÁLISE ELETROFORÉTICA DE</p><p>DNA BACTERIANO</p><p>Alunos: ANA CAROLINA FERREIRA ROCHA Matrícula: 201600440</p><p>BRUNA MARTINS ARAÚJO 201600444</p><p>CARLOS ANTONIO SILVA OLIVEIRA 201600445</p><p>Curso: BIOTECNOLOGIA</p><p>Introdução:</p><p>Os plasmídeos em procariotos, ou epissomos em eucariotos, são moléculas de DNA</p><p>circular com capacidade de replicação independente e estável, mantendo seu número</p><p>constante através de várias gerações, no estado não integrado ao cromossomo do</p><p>hospedeiro. Os plasmídeos estringentes ocorrem em pequeno número de cópias por</p><p>células, enquanto os relaxados em grande número de cópias por célula.</p><p>Apesar de não serem indispensáveis à vida das células, em determinadas situações os</p><p>plasmídeos podem conferir-lhes propriedades essenciais à sobrevivência. Eles são</p><p>responsáveis por inúmeros casos de resistência múltipla a drogas em bactérias e pela</p><p>estabilidade de importantes microorganismos utilizados na indústria. Genes plasmidiais</p><p>controlam a codificação de importantes enzimas envolvidas em diferentes etapas da</p><p>industrialização do leite e do vinho.</p><p>Os plasmídeos são dependentes da DNA-polimerase (que duplica o DNA), da</p><p>RNA-polimerase (que copia as informações contidas no DNA) e da maquinaria de tradução</p><p>(síntese de proteínas) da célula hospedeira . Devido a sua habilidade de replicação</p><p>independente e recombinação gênica os plasmídeos são amplamente utilizados em</p><p>estudos de engenharia genética e biologia molecular como vetores de genes e/ou</p><p>fragmentos de DNA dos quais se queira saber as sequências de bases ou as sequências</p><p>de aminoácidos.</p><p>Ao ser inserido no plasmídeo o fragmento passa também se replicar seguindo as</p><p>divisões celulares e com isso aumentando exponencialmente seu número, fornecendo</p><p>material suficiente para expressão, sequenciamento e manipulação gênica do fragmento.</p><p>As técnicas de DNA recombinante permite a construção de plasmídeos artificiais, nos</p><p>quais sabe-se exatamente onde se liga o fragmento de interesse. Esses plasmídeos</p><p>artificiais são usados, por exemplo, para a produção de insulina em bactérias.</p><p>Por todas estas vantagem a utilização de plasmídeos é de grande interesse. Entretanto</p><p>para seu uso estes devem ser isolados das células hospedeiras. Neste sentido várias</p><p>técnicas específicas para extração e purificação DNAs plasmidiais foram desenvolvidas.</p><p>.O passo seguinte, depois de extraído o DNA é a análise. Esta pode ser feita através de</p><p>eletroforese em gel de poliacrilamida posteriormente corado pela prata ou em gel de</p><p>agarose, corado por brometo de etídio. Em qualquer uma delas, o material amplificado é</p><p>visualizado como uma banda, a ser analisada de acordo com o seu peso molecular.</p><p>A eletroforese consiste na separação de moléculas ionizadas, de acordo com suas</p><p>cargas elétricas e pesos moleculares em campo elétrico. Moléculas orgânicas como RNA,</p><p>DNA e proteínas são separadas pela migração destas em um gel durante a aplicação de</p><p>um potencial elétrico. O princípio da eletroforese utilizada para separação de DNA, por</p><p>exemplo, baseia-se na carga total negativa do DNA (conferida pelos grupamentos fosfatos).</p><p>Sendo assim, as moléculas de DNA tendem a migrar em direção ao pólo positivo (cátodo).</p><p>Uma molécula de DNA, quando exposta a um campo elétrico, migra para o eletrodo na</p><p>velocidade ou mobilidade eletroforética, proporcional a força do campo e a carga líquida da</p><p>molécula. A mobilidade eletroforética é também inversamente proporcional ao coeficiente</p><p>friccional da molécula, que, por sua vez, é em função do tamanho e forma da molécula, e</p><p>da viscosidade do meio.</p><p>Nessa técnica é utilizada uma cuba com dois compartimentos, eletrodos e solução</p><p>salina para condução de eletricidade. Entre os compartimentos da cuba é encaixado o gel</p><p>que deve ficar submerso. Pequenos poços são feitos no gel durante sua preparação com</p><p>pentes. As amostras são pipetadas nesses poços. Essas amostras devem ser previamente</p><p>misturadas a um corante, chamado gel loading buffer (GelRed). Esse corante é uma</p><p>solução composta de azul de bromofenol (e/ou xileno cianol) e glicerol e é utilizado para</p><p>aumentar a densidade das amostras, impedindo que elas saiam dos poços, além de dar a</p><p>coloração que serve como indicador do progresso eletroforético. Para a migração, aplica-se</p><p>voltagem e corrente elétrica ao sistema.</p><p>A distância que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicação, é comparada com</p><p>a distância que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel.</p><p>Esses fragmentos são os ladders (marcadores de peso molecular), misturas de segmentos</p><p>de DNA de tamanhos variáveis e eqüidistantes entre si, e que são aplicados em um poço</p><p>no gel no início do processo.</p><p>A eletroforese pode ser conduzida em solução com gradiente de densidade ou em</p><p>diferentes meios-suportes, tais como papel de filtro, sílica gel, membranas de acetato de</p><p>celulose, gel de agarose, amido ou poliacrilamida, entre outros. O suporte deve ser química</p><p>e fisicamente inerte, de modo a não interferir na mobilidade das moléculas. No caso de</p><p>eletroforese em géis, como poliacrilamida e agarose, a migração das moléculas é</p><p>profundamente influenciada pelas malhas porosas. Em relação a géis de poliacrilamida ou</p><p>agarose, a porosidade do gel determina o poder de resolução das bandas, sendo este</p><p>geralmente decorrente do grau de polimerização entre os monômeros. Géis de</p><p>poliacrilamida são freqüentemente usados para análises de alta resolução (seqüenciamento</p><p>de DNA/RNA) em análises protéicas e iso enzimáticas que requeiram maior definição das</p><p>bandas. Géis de agarose também são amplamente usados na separação de DNA/RNA,</p><p>especialmente para fragmentos maiores.</p><p>A eletroforese em gel de agarose é o método padrão usado para separar, identificar,</p><p>analisar, caracterizar e purificar fragmentos de DNA. A técnica é capaz de separar misturas</p><p>de fragmentos de DNA que não podem ser separados por outros meios, tais como</p><p>centrifugação com densidade de gradiente ou por velocidade de sedimentação. A</p><p>localização do DNA no gel pode ser determinada diretamente.</p><p>Os géis de agarose são, geralmente, corados com soluções de brometo de etídio (EtBr),</p><p>uma substância intercalante que revela os ácidos nucléicos ao emitir fluorescência sob luz</p><p>ultravioleta. Concentrações de até 1ng de DNA podem ser visualizadas por exame direto do</p><p>gel na luz ultravioleta.</p><p>Materiais:</p><p>• Cultura bacteriana (​E. coli ​cultivada em meio LB, 37°C por 18h)</p><p>• Solução II (NaOH 0,2 M E SDS 1,0% (p/v))</p><p>• Solução III (Acetato de potássio 3 M , ácido acético 3 M, pH 4,8)</p><p>• Tampão TE</p><p>• Etanol PA</p><p>• Etanol 70%</p><p>• Isopropanol</p><p>• Acetato de sódio 3 M</p><p>• Amostra de DNA</p><p>• Marcador de massa molecular de DNA</p><p>• Agarose</p><p>• Tampão TEB 1X</p><p>• Corante Easy view: corante fluorescente para ácidos nucléicos</p><p>• Tampão de amostra</p><p>• Pipeta automática</p><p>• Tubos "eppendorf"</p><p>• Cuba de eletroforese</p><p>• Transiluminador de UV</p><p>Métodos:</p><p>Foram coletados 3 mL de cultura bacteriana de E. Coli em 3 eppendorfs</p><p>e submetidos</p><p>a centrifugação 3.000 rpm por 5 min a temperatura ambiente.</p><p>Foi feito o descarte do sobrenadante e o precipitado foi ressuspendido em 200 µL de</p><p>tampão TE, a solução foi mantida a 4°C por 5 min.</p><p>Foram adicionados 360 µL de solução III, sendo homogeneizado com a ponteira da</p><p>pipeta e a solução foi mantida a 4°C por 5 min, foram retirados os restos celulares</p><p>(proteínas, carboidratos e lipídeos). Após isso foram adicionados 300 µL de solução III, a</p><p>solução foi homogeneizada com a ponteira da pipeta e mantido a 4°C por 5 min.</p><p>Os tubos foram centrifugados a 10.000 rpm durante 5 min a 4 °C. Tendo sido</p><p>coletado o líquido sobrenadante (DNA total)</p><p>Adicionou-se 750 µL de isopropanol, homogeneizando com a ponteira da pipeta e</p><p>mantido a temperatura ambiente por 5 min, para a precipitação do DNA.</p><p>A solução foi então centrifugada a 10.000 rp por 5 min a 4°C, o sobrenadante foi</p><p>descartado e o precipitado ressuspendido em 200 µL de tampão TE.</p><p>O DNA foi precipitado adicionando 3 M de acetato de sódio e 500µL de etanol 100%.</p><p>Os tubos foram centrifugados a 10.000 rpm durante 5 min a 4 °C, coletando-se o</p><p>precipitado e adicionado etanol 70%, centrifugando nas mesmas condições novamente,</p><p>fazendo o descarte do sobrenadante.</p><p>O eppendorf foi mantido aberto durante 5 min para a secagem do DNA, e foi</p><p>ressuspendido em 50 µL de tampão TE.</p><p>Após os procedimentos de extração do DNA, se iniciaram a preparação para os</p><p>procedimentos de eletroforese;</p><p>O gel de agarose foi preparado misturando-se 0,8 mL de agarose em 100 mL de</p><p>tampão TEB, a agarose foi então dissolvida no forno de microondas, a solução foi</p><p>resfriada (60°C), foram adicionados 10 µL do corante Easy View, e a solução foi vertida</p><p>no molde de eletroforese.</p><p>O gel foi despejado na cuba de eletroforese e coberto com tampão TEB 1X.</p><p>Foram misturados 30 µLde solução de DNA e 30 µL do tampão de amostra e 20 µL</p><p>de cada amostra nos poços de gel de Agarose.</p><p>A cuba de eletroforese foi conectada a energia (80V) até o DNA entrar no gel</p><p>(acompanhado pelo corante) e aumentada para 100 V até o fim da corrida.</p><p>Os resultados foram lidos em transiluminador de UV e anotadas as distâncias</p><p>percorridas por cada amostra.</p><p>Resultados:</p><p>Para se obter todo o processo de extração, vários passos devem ser tomados. O</p><p>primeiro é crescer a cultura bacteriana, que havia sido cultivada 1 semana antes. Depois</p><p>foi feita a lise das células, que resultou em um conjunto de organelas e outros dentro do</p><p>tubo.</p><p>Para se obter este conjunto, foi preciso centrifugar, o que fez com que o conjunto</p><p>formasse um aglomerado, que foi descartado. Ao fim do experimento, o DNA foi extraído</p><p>e se encontrava dentro do eppendorf no qual foi ressuspendido com tampão TE. Dentro</p><p>do tubo havia a formação de um corpo, que parecia uma sujeira no fundo do tubo, este é</p><p>o pellet.</p><p>O pellet, de acordo com o glossário de biologia molecular da GenScript¹, é uma</p><p>porção sedimentada que se acumula durante a centrifugação. Assim, durante a</p><p>centrifugação da amostra, seguindo este protocolo de extração de DNA, houve a</p><p>formação do corpo de fundo.</p><p>A eletroforese foi realizada e o seguinte gel foi finalizado:</p><p>Este é o seguinte marcador de massa molecular do gel de agarose:</p><p>Dessa forma, é possível observar que a mobilidade eletroforética é determinada por</p><p>tamanho e conformação do DNA, concentração de agarose, presença de brometo de</p><p>etídeo no gel e voltagem e tipo de tampão. O gel corre no sentido vertical para baixo e</p><p>mostra uma massa molecular relativamente alta em concentração maior e com um</p><p>número de bases que é decresce.</p><p>Conclusão:</p><p>É possível perceber que o objetivo da aula foi concluído já que o experimento foi um</p><p>sucesso. ​Foi identificado todo o material necessário para a realização das técnicas e</p><p>todos os objetivos propostos foram alcançados com êxito.</p><p>A aula foi necessária para aquisição de conhecimentos e como se realizar a extração</p><p>e análise de um DNA. A extração foi guiada pela professora de forma clara,</p><p>possibilitando uma extração bem sucedida com um pellet visível e limpo. A leitura do gel</p><p>foi possível sem problemas já que o mesmo teve um resultado de boa leitura.</p><p>Referências:</p><p>GenScript, Glossário de Biologia Molecular. Disponível em:</p><p>https://www.genscript.com/molecular-biology-glossary/2248/pellet​. Acesso em: 1 de</p><p>dezembro de 2017.</p><p>ELETROFORESE – Genética molecular. Disponível em:</p><p><http://genetica.ufcspa.edu.br/biomedic/conteudo/genetica_molecular/eletroforese.pdf>.Ac</p><p>esso em 09 de dezembro de 2017.</p><p>Nelson, David L.; COX, Michael M. Princípios de bioquímica de Lehninger. Porto</p><p>Alegre: Artmed, 2011. 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 2014.</p><p>MADIGAN, Michael T. et al. Microbiologia de Brock. 14. ed. Porto Alegre: ArtMed,</p><p>2016.</p><p>https://www.genscript.com/molecular-biology-glossary/2248/pellet</p>