Pesquisa de Salmonella sp em Alimentos Valença, 1ª Edição, 2015, 13p

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André Fioravante Guerra 
Pesquisa de Salmonella sp/25g 
Valença, 1ª Edição, 2015. 13p. 
Disponível em: 
www.microbiologia-de-alimentos.com 
 
 
Pesquisa de Salmonella sp. Valença, 1ª Edição, 2015, 13p. www.microbiologia-de-alimentos.com 
 
PESQUISA DE SALMONELLA sp. 
Salmonella é um gênero bacteriano constituído por 
microrganismos em formato de bastonetes ou cocobacilos, 
Gram negativos, mesófilos, anaeróbios facultativos, não 
esporulados, geralmente móveis (exceção de S. gallinarum 
e S. pullorum). A maioria dos sorovares produz ácidos e 
alguns, sulfeto de hidrogênio (H2S). Fermentam a glicose, 
porém não possuem naturalmente a habilidade de 
fermentar lactose e sacarose. Pertencem a família 
Enterobacteriacea e possui como habitat natural o 
intestino de aves, animais, répteis e humanos. 
Daniel Salmon em 1990 foi o primeiro pesquisador a 
isolar Salmonella ao estudar a microbiota de suínos. 
Atualmente, o gênero está dividido em 2 espécies: S. 
enterica e S. bongori. A espécie entérica está dividida 6 
subspécies: enterica, salamae, arizonae, diarizonae, 
houtenae e indica. Contudo, estas subespécies estão 
divididas em 2510 sorovares. 
Portanto, a grafia científica para Salmonella seria: 
gênero+espécie+subespécie+sorovar. Exemplo: 
Salmonella enterica subsp. enterica sorovar Typhimurium. 
Para simplificar a grafia, convencionou-se grafar somente 
o gênero e o sorovar. Exemplo: Salmonella Typhimurium. 
Para os familiarizados com a escrita científica, essa grafia 
pode parecer um pouco estranha, pois o sorovar é grafado 
com inicial maiúscula e não itálico. Porém, essa é a grafia 
aceita pelo subcomitê de Salmonella da Sociedade 
Internacional de Microbiologia. 
Todos os sorovares de Salmonella são patogênicos. 
Normalmente os sintomas clínicos se manifestam como 
uma enterocolite aguda, conhecido como salmonelose. Os 
sintomas mais comuns são febre, dores abdominais, 
diarreia podendo ou não conter sangue. Porém, casos de 
doenças crônicas como irritação nos olhos, artrite e 
micção (urinar) dolorosa também tem sido reportado na 
literatura. Estes sintomas são conhecidos como síndrome 
de Reiter. 
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PESQUISA DE Salmonella sp. EM ALIMENTOS 
 
1 – Fase de Ressuscitação ou pré-enriquecimento 
Baseia-se na incubação, a 36 ± 1°C por 16 - 20 horas, de 25 ±0,2 g ou mL da amostra, 
adicionada de 225 mL do diluente específico, normalmente utiliza-se água peptonada 
tamponada. Este procedimento visa minimizar os efeitos do processamento industrial 
dos alimentos, capaz de promover estresse nas células de Salmonella, sem inativá-las 
biologicamente. 
Para leite em pó, segundo o FDA (Food and Drug Administration), o diluente utilizado 
deve ser água destilada estéril adicionada de solução de 1% verde brilhante, o que 
visa inibir o crescimento de bactérias Gram positivas. 
 
2 – Fase de Ressuscitação ou Pré-enriquecimento 
Baseia-se na inoculação de alíquotas de amostra da fase de ressuscitação em meios 
contendo substâncias inibidoras de crescimento para a maioria dos microrganismos 
interferentes, seguido de incubação em temperatura seletiva. 
O enriquecimento seletivo de Salmonella deve ser feito obrigatoriamente nos meios 
líquidos seletivos, caldo Rappaport Vassiliadis e caldo Selenito-Cistina. Pode-se 
utilizar adicionalmente o caldo tetrationato. 
No caldo Rappaport Vassiliadis, a presença de verde malaquita e cloreto de magnésio, 
associados à temperatura de 41 ± 0,5ºC por 24 a 30 horas, atuam como agentes 
seletivos da microbiota acompanhante. Enquanto que a presença de peptona de 
farinha de soja estimula o crescimento de Salmonella sp. 
No caldo Selenito-Cistina, o selenito de sódio atua inibindo os coliformes e 
enterococos. Esse meio também deve ser incubado a 41 ± 0,5ºC por 24 a 30 horas. 
 
3 – Fase de Isolamento Seletivo 
Baseia-se no isolamento seletivo do crescimento dos tubos contento caldo 
Rappapport e Selenito em, pelo menos, dois meios sólidos: ágar Verde Brilhante 
Vermelho de Fenol Lactose Sacarose (BPLS) é obrigatório e outro ágar de maior 
impediência escolhido pelo laboratório. 
No ágar verde brilhante, a novobiocina adicionada visa principalmente inibir Proteus 
sp. Na composição há bile bovina e um corante derivado do trifenilmetano (verde 
brilhante), responsável pela inibição de microrganismos Gram positivos. 
Como meio de maior impediência, pode-se utilizar ágar Heckoten, MLCB, Rambach, 
XLD, XLT4 ou outro. 
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No ágar Rambach, a diferenciação entre Salmonella e outros microrganismos é 
promovida pela presença de propilenoglicol, e também por um cromógeno que 
evidencia a hidrólise da lactose. 
No ágar MLCB, a concentração de íons magnésio promove o crescimento de 
Salmonella. A presença de verde-brilhante inibe a microbiota acompanhante. Esse 
ágar não utiliza a fermentação da lactose como sistema de identificação, o que 
possibilita a detecção de cepas de comportamento atípico no BPLS. A produção de H2S 
é evidenciada pela presença de precipitado preto no centro da colônia. Cepas de 
Salmonella H2S negativas, como Salmonella Sendai, Salmonella Berta, Salmonella 
Pullorum e Salmonella Seftenberg, podem produzir colônias azuis. É um meio que, 
associado ao caldo de enriquecimento Rappaport-Vassiliadis, tem sua seletividade 
substancialmente aumentada. A Salmonella Typhi e a Salmonella Paratyphi não 
crescem nesse meio devido à presença de verde-brilhante. 
No ágar Hecktoen os sais biliares inibem o crescimento de microrganismos Gram positivos 
e alguns Gram-negativos. A lactose, sacarose e salicina presentes no meio não são 
fermentados por Salmonella sp., porém, constitui-se sistema de diferenciação dos 
microrganismos com esta capacidade, como Escherichia coli. Como as espécies de 
Salmonella sp. não fermentam estes carboidratos, não há alteração do pH do meio e 
consequentemente não há alteração da coloração dos indicadores fucsina ácida e azul de 
bromotimol. O citrato de amônio férrico e o tiossulfato de sódio detectam a produção de 
sulfeto de hidrogênio, neste caso, as colônias são visualizadas com um centro preto. 
 
4 – Identificação Bioquímica 
 
Baseia-se na evidenciação das propriedades fisiológicas e metabólicas das culturas 
suspeitas por meio da verificação da presença de citocromo oxidase, detecção de 
pirrolidonil peptidase (PYRase) segundo Bennett e colaboradores (1999), produção 
de urease, fermentação da glicose, sacarose e lactose no meio Ferro Três Açúcares 
(TSI), detecção de beta-galactosidase, descarboxilação da lisina; produção de H2S, 
motilidade e produção de indol. 
 
As colônias características do isolamento seletivo devem ser transferidas para um 
meio não seletivo (recomenda-se ágar casoy inclinado) e ser incubadas a 36°C por 24 
horas. O objetivo desta etapa é produzir massa celular para os testes posteriores. 
 
Produção de urease – inocular maciçamente sobre o bisel do ágar ureia ou em tubo 
contendo caldo ureia. Incubar a 36 ± 1ºC por 24 a 30 horas e observar a coloração do 
meio. A manutenção da cor inicial indica que não ocorreu hidrólise da uréia. A 
alteração para rosa intenso é indicativa de alcalinização do meio devido à ação da 
urease sobre a uréia. Salmonella não produz urease. 
Reações em ágar TSI ou ágar Kligler (KIA) - Inocular o ágar através de picada 
profunda e estriamento na superfície inclinada do bisel. Incubar a 36 ± 1ºC por 18 a 
24 horas. No ágar TSI, estão presentes: glicose (1,0 g/L), lactose (10,0 g/L) e sacarose 
(10,0 g/L). Comoa glicose está 10 vezes mais diluída que os outros carboidratos, 
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rapidamente ela é consumida pela fermentação anaeróbica formando ácido no fundo 
do tubo, isto faz a viragem do indicador vermelho de fenol para amarelo. O consumo 
de glicose na superfície do bisel ocorre de forma aeróbica e produz ácido pirúvico, 
que é posteriormente degradado a CO2 e água. Como o metabolismo em aerobiose é 
mais intenso, falta glicose para geração de energia e para suprir essa carência, 
Salmonella utiliza o substrato proteico, produzindo amoníaco (NH3) e alcalinizando o 
meio. Neste caso, há viragem do indicador para rosa intenso. Crescimento típico de 
Salmonella em ágar TSI e KIA apresenta ácido na base, com ou sem produção de gás e 
alcalino ou inalterado no bisel. Se a cepa produzir H2S, este é detectado pela presença 
de citrato de ferro formando um precipitado preto. 
Descarboxilação da lisina - inocular caldo lisina e adicionar selo estéril (vaspar, vaselina 
ou parafina). Este procedimento evita o contato do meio com o ar e, consequentemente, 
falsa alcalinização na superfície por degradação aeróbia do substrato proteico. Ou inocular 
através de picada profunda e estriamento na superfície inclinada do bisel tubo contendo 
ágar Lisina (LIA) inclinado. Incubar a 36 ± 1ºC por 24 a 30 horas. A descarboxilação da 
lisina é observada pela alcalinização do meio, o que é demonstrado pela não alteração de 
cor do indicador. A atividade da enzima lisina descarboxilase é dependente do pH, sendo 
mais ativa em pH abaixo de 5,5. A acidificação do meio é obtida pela fermentação da 
glicose presente. Nessa etapa do processo, ocorre a viragem do indicador púrpura de 
bromocresol, de violeta para amarelo. Posteriormente ocorre a descarboxilação da lisina 
que resulta na produção de uma diamina (cadaverina) e CO2 que conferem ao meio 
características de alcalinidade e nova viragem da cor do indicador, que passa de amarelo 
para violeta. A diamina cadaverina é estável quando produzida em condições anaeróbias. 
Salmonella Paratyphi A e alguns outros sorovares não produzem lisina descarboxilase. 
Motilidade, produção de indol e H2S – inocular em tubo contendo ágar SIM através 
de picada até ¾ de profundidade. Incubar a 36 ± 1ºC por 24 a 30 horas. A motilidade 
é caracterizada pela difusão do crescimento por todo o ágar. Salmonella apresenta 
motilidade positiva com exceção de Salmonella Gallinarum e Salmonella Pullorum. 
A produção de H2S é detectada pela presença de citrato de ferro e amônio devido à 
formação de precipitado preto insolúvel. Aproximadamente 86% das cepas de 
Salmonella produzem H2S. 
Após a leitura da motilidade e produção de H2S, adicionar algumas gotas de reativo de 
Kovac´s ou reativo de Ehrlich ao tubo para verificar se houve produção de indol. A 
oxidação do triptofano presente no meio SIM leva à formação de três compostos: 
indol, escatol e indolacetato. A adição do reativo de Kovac´s resulta na formação de 
um anel vermelho, resultante da reação entre o indol e o dimetilaminobenzaldeído 
contido nesse reativo. Aproximadamente 99% das cepas de Salmonella produzem 
indol. 
Oxidase - espalhar a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase ou 
sobre tiras de papel para teste de oxidase. Fazer a leitura entre 10 e 20 segundos. Após esse 
tempo, podem ocorrer reações falso-positivas. O aparecimento de cor azul (N'N'N'N'-
tetrametil-parafenileno-diamina) ou vermelho intenso (oxalato de para-amino-
dimetilanilina) é indicativo de reação positiva. Todas as cepas de Salmonella são oxidase 
negativas. 
 
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 Obs - Não utilizar alças de níquel-cromo ou de aço para realizar o teste de oxidase, pois 
traços de óxido de ferro na superfície flambada podem produzir reação falso-positiva. 
 
Testes bioquímicos complementares (opcionais) 
 
Desaminação da fenilalanina - inocular sobre a superfície inclinada do bisel de tubo 
contendo ágar fenilalanina inclinado. Incubar a 36 ± 1°C por 18 a 24 horas. Adicionar 
2 a 3 gotas de solução de cloreto férrico a 10%. A alteração da coloração da cultura na 
superfície do bisel para verde indica reação de desaminação da fenilalanina. 
Salmonella não desamina a fenilalanina. 
Reação de Voges-Proskauer - inocular tubos contendo caldo VM-VP em duplicata. 
Incubar um dos tubos a 36 ± 1°C por, pelo menos, 24 horas. O outro tubo deve ser 
incubado a 22 ± 1°C, por 96 horas. Adicionar primeiramente 0,6 mL de solução de α-
naphtol a 5% e em seguida, 0,2 mL de solução de hidróxido de potássio a 40%. Agitar 
os tubos para que haja oxigenação do meio. Aguardar de 10 a 15 minutos. A alteração 
da cor para rosa intenso indica reação de VP positiva. Salmonella apresenta reação 
negativa para VP nas duas temperaturas. 
Detecção da enzima pirrolidonil peptidase (PYRase) - a partir das culturas em ágar 
estoque que apresentaram resultados compatíveis com Salmonella, realizar o teste da 
presença da enzima pirrolidonil peptidase (PYRase). Espalhar a cultura suspeita 
sobre cartão impregnado com ácido L-piroglutâmico, substrato que será hidrolisado 
pela PYRase, quando produzido pelo microrganismo teste. Para revelar a hidrólise do 
ácido L-piroglutâmico, adicionar sobre o cartão algumas gotas de para-
dimetilaminocinamaldeído, o que, nos casos positivos, resultará no desenvolvimento 
de coloração vermelha. Esta prova é útil para diferenciar Citrobacter e Salmonella. 
Todas as cepas de Citrobacter sp. produzem a enzima pirrolidonil peptidase (reação 
positiva). Todas as cepas de Escherichia coli e 96% das Salmonella não produzem essa 
enzima (reação negativa). 
 
5 – Teste de Soroaglutinação 
Baseia-se na reação antígeno-anticorpo, com conseqüente aglutinação do antígeno 
frente ao anti-soro para Salmonella polivalente “O”. 
Ressuspender o cultivo obtido em ágar estoque inclinado (de 18 a 24 horas) em 
aproximadamente 2 mL de solução salina 0,85%. Em lâmina de vidro, placa de Petri 
ou placa de Huddleson, depositar separadamente uma gota de solução salina 2% e 
uma gota do soro anti-Salmonella polivalente "O", diretamente do frasco. Em seguida, 
acrescentar a cada uma delas uma gota da suspensão em teste. Com movimentos 
circulares, realizar a leitura com iluminação sobre fundo escuro entre 1 e 2 minutos. 
Classificar a reação do seguinte modo: 
Positiva: presença de aglutinação somente na gota com cultivo + anti-soro; 
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Negativa: ausência de aglutinação nas duas gotas; 
Não específica: presença de aglutinação nas duas gotas (formas rugosas). 
As culturas que apresentarem resultados compatíveis com Salmonella, porém 
incapazes de assegurar sua identificação por meio da sorologia, deverão ser re-
isoladas em ágar não-seletivo e serem novamente submetidas à reação sorológica. 
 
Na Figura 1 está mostrado passo a passo a análise Pesquisa de Salmonella sp. em 
alimentos. 
 
 
 
 
 
Figura 1 – Pesquisa de Salmonella sp. em alimentos. 
ANEXOS 
Agar Ferro Três Açúcares - TSI 
 
 
 
 
 
 
 
Fermentação aeróbia da glicose com produção de 
ácido pirúvico e posteriormente degradação a CO2 e 
água; 
Alcalinização do meio devido utilização da proteína 
como fonte de energia com consequente 
alcalinização do meio. 
Viragem do indicador para rosa intenso. 
 
Fermentação anaeróbia da glicose com produção de 
ácido; 
Alcalinização do meio; 
Viragem do indicador de vermelho de fenol para 
amarelo. 
 
 Produção de sulfeto de hidrogênio (H2S); 
O H2S com o citrato de ferro e amônio (presente no 
meio) forma um precipitado pretoinsolúvel. 
 
 
Acidificação total do meio devido fermentação da 
lactose; 
Viragem do indicador vermelho de fenol para 
amarelo. 
 
 
 
Produção de gás. 
 
 
 
 Agar Ferro Três Açúcares – TSI - coloração original. 
 
 
 
 Figura 2A 
 
 
 
 Figura 2B 
 
 
 
 Figura 2C 
 
 
 
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Agar Lisina Ferro - LIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Agar lisina após 18 horas de incubação. 
Alcalinização do meio devido produção de lisina 
descarboxilase levando a produção de cadaverina de 
CO2. 
Viragem do indicador para purpura. 
 
Agar lisina após 6 horas de incubação. 
Fermentação da glicose acidificando o meio. 
Viragem do indicador para amarelo. 
 Agar Lisina Ferro – LIA - coloração original. 
 
 
 
 Figura 3A 
 
 
 
 Figura 3C 
 
 
 
 Figura 3B 
 
 
 
Pesquisa de Salmonella sp. Valença, 1ª Edição, 2015, 13p. www.microbiologia-de-alimentos.com 
 
Agar SIM-Motilidade 
 
 
 
 
Agar SIM antes da inoculação. 
 
Agar SIM – motilidade negativo. 
 
Agar SIM – motilidade positivo. 
Produção de H2S por Salmonella Typhimurium 
 
Reação indol negativo. Salmonella Typhimurium. 
Reação indol positivo. Escherichia coli. 
Figura 4A 
 
Figura 4B 
 
Figura 4C 
 
Figura 4D 
 
Figura 5 – Isolamento seletivo de Salmonella sp. Agar Hecktoen (fotos da esquerda), ágar BPLS (fotos da direita). 
BIBLIOGRAFIAS 
BRASIL. Resolução – RDC n°12, de 2 de janeiro de 2001. Agência Nacional de 
Vigilância Sanitária – ANVISA. Diário Oficial da União, 2001. 
BRASIL. Instrução Normativa n°62. De 26 de agosto de 2003. Ministério da 
Agricultura, Saúde, e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária. Diário 
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LÁZARO, N. S.; REIS, E. M. F.; PEREIRA, C. S.; RODRIGUES, D. P. Gênero Salmonella: 
Características epidemiológicas e laboratoriais. Laboratório de Referência Nacional 
de Cólera e outras Enteroingecções Bacterianas – Laboratório de Entereobactérias 
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