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Revista Trópica – Ciências Agrárias e Biológicas V. 3, N. 1, p. 8, 2009 Efeito genotóxico da infusão de capítulos florais de camomila Aleson Vieira1, Marcelo de A. Guimarães2, Grace Q. David1, Isane V. Karsburg1, André &. R. Campos2 Resumo - A camomila (Matricaria recutita) é utilizada na medicina popular, na forma de infusão, para tratamento de dispepsia, perturbações estomacais, diarréia, náuseas e outras. O efeito genotóxico da infusão dos capítulos florais desidratados de camomila foi avaliado através do sistema teste Allium cepa, que é validado pelos: Programa Internacional de Segurança Química e Programa Ambiental das Nações Unidas como eficiente teste para análise e monitoramento in situ da genotoxicidade de substâncias ambientais. Este trabalho objetivou estudar os efeitos genotóxicos em diferentes concentrações (10, 15 e 20 g.L-1) de infusão dos capítulos florais de camomila. O indíce mitótico, percentual de células que encontravam-se em uma das quatro fases da mitose, variou entre 71 e 89% nos tratamentos analisados. Já na testemunha 100% das células analisadas estavam em plena divisão mitótica. A porcentagem de células em apoptose variou de 22 a 58%, sendo a menor porcentagem encontrada na infusão com menor concentração. Observou-se que as infusões contendo as duas maiores concentrações de capítulos florais de camomila desencadearem o processo de necrose nas radículas de Allium cepa. Conclui-se que infusões de camomila possuem efeito genotóxico, pois todas as concentrações causaram inibição do ciclo celular e aumento expressivo no número de células em apoptose. Palavras-chave: Apoptose, mitose, planta medicinal, Allium cepa, Matricaria recutita. Evaluation of genotoxic effects of chamomile floral chapters infusion Abstract - The chamomile (Matricaria recutita) is used in the popular medicine, in infusion form, for dyspepsia treatment, stomach disturbances, diarrhea, nauseas and others. The genotoxicity effect of the infusion of dehydrated floral chapters of chamomile was evaluated through the Allium cepa system´s test, which is validated by Chemical Safety's International Program and Environmental Program of the United Nations as an efficient test for analysis and monitorament in situ of the genotoxicid of environmental substances. The objective of this work was to study the genotoxic effects of chamomile infusions with different concentration (10, 15, and 20 g.L-1) of chamomile floral chapters. The mitotic index, percentage of cell presenting normal mitotic division, varied between 71 and 89%. The control presented 100% of the cells in normal mitotic division. In the different the percentage of cell in apoptosis varied between 22 a 58%, being the lowest percentage correspondent to the lowest infusion concentration. Additionally, necroses in Allium cepa radicules were observed the infusions with the two highest concentrations of chamomile floral chapters. Infusions of chamomile possess genotoxic effects, once all concentrations caused alterations in cell cycle and increase the number of cells in apoptosis. Keywords: Cells in apoptosis, mitosis, medicinal plants, chamomile, Allium cepa, Matricaria recutita. Recebido e aceito 1 Universidade do Estado de Mato Grosso (UNEMAT). Departamento de ciências Biológicas. CEP 78580-000, Alta Floresta, MT. E-mail: alesonvieira@hotmail.com 2 Universidade Federal de Viçosa (UFV). Departamento de Fisiologia Vegetal. CEP 36570-000, Viçosa, MG. E-mail: mguimara@hotmail.com I&TRODUÇÃO Muitas plantas medicinais de uso popular renomado apresentam propriedades tóxicas, que justificam muito cuidado com suas dosagens. Ainda que a simples presença destas substâncias não desqualifique seu uso medicinal, é importante que se saiba se os efeitos são acumulativos, ou se a planta é definitivamente imprópria para uso interno. O conceito errôneo de que as plantas são remédios naturais e portanto livre de riscos e efeitos colaterais deve ser reavalidado. A obediência ás dosagens prescritas e o cuidado na identificação precisa do material utilizado pode evitar uma série de acidentes (Lorenzi et al., 2002). Dentre as recomendações para tratamentos com plantas medicinais prescreve-se períodos de uso máximo entre 21 e 30 dias, intercalados por um período de descanso entre 4 e 7 dias, também, para que o vegetal possa atuar com toda a eficácia e para que possíveis efeitos óxicos sejam reduzidos (Martins et al., 2003). Os prováveis efeitos tóxicos de muitas das plantas ainda são ignorados, portanto deve-se utilizar apenas aquelas cujos efeitos sejam bem conhecidos (Martins et al., 2003). . VIEIRA, Aleson , GUIMARÃES, Marcelo de A. et al __________________________________________________________________________________________ Revista Trópica – Ciências Agrárias e Biológicas V. 3, N. 1, p. 9, 2009 O emprego de plantas medicinais tem evoluído desde as formas mais simples de tratamento local, até as formas tecnologicamente sofisticadas da fabricação industrial. A utilização do princípio ativo pode ser empregado na medicina caseira através do uso direto da planta na forma de preparações caseiras, como infusões, chás, tinturas e pós, ou na forma de compostos puros isolados. Por isso a planta medicinal, quando bem escolhida e usada corretamente, apresenta a mesma eficácia do medicamento industrial (Lorenzi et al., 2002). Apesar das vantagens apresentadas pelo uso das plantas medicinais (Serigato et al., 1997; Lorenzi et al., 2002; Martins et al., 2003), alguns critérios sempre devem ser tomados, principalmente no que se refere à identificação do quadro clínico apresentado (doença ou sintoma), á escolha correta da planta a ser utilizada e a adequada preparação (Serigato et al., 1997; Martins et al., 2003). A camomila é uma planta comumente usada na medicina caseira, sendo indicada na dispepsia, perturbações estomacais em geral, diarréia, náuseas, inflamações das vias urinárias e distúrbios menstruais. Age como sudorífico e emoliente. Exteriormente, emprega-se o infuso em compressas, ou o pó das sementes esmiuçadas, sobre feridas difíceis de curar, afecções da pele em geral, hemorróidas, inflamações dos olhos e boca. A parte usada para fins terapêuticos é constituída dos capítulos florais secos ao ar e conservada ao abrigo da luz (Lorenzi et al., 2002; Duarte et al., 2003; Martins et al., 2003). Seus principais constituintes químicos são o óleo essencial contendo camazuleno, matricia, bisabolol (antiinflamatório), flavonóides e colina (Lorenzi et al., 2002; Martins et al., 2003). Embora trate-se de uma planta intensamente utilizada para fins medicinais pouco se sabe sobre a segurança do seu uso, dosagem e contra-indicações. Uma das formas para identificar possíveis efeitos tóxicos é a avaliação de genotoxidade através de bioindicadores. A avaliação de alterações cromossômicas em raízes de Allium cepa apresenta-se como uma alternativa barata e eficiente para o estudo dos efeitos de extratos vegetais. Este método é validado pelo Programa Internacional de Segurança Química, Organização Mundial da Saúde (IPCS, OMS) e o Programa Ambiental das Nações Unidas (UNEP) como um teste para análise e monitoramento in situ da genotoxicidade de substâncias ambientais (Sregeman et al., 1992 citado por Galvão, 2008; Teixeira et al., 2003; Fachinetto et al., 2007; Bagantini et al., 2007). Diante da demanda de estudos sobre o emprego de M. recutita , este trabalho visa estudar os efeitos genotóxicos desta espécie em Allium cepa, verificando o comportamento mitótico deste em diferentes concentrações de infusão dos capítulos florais de M. recutita. MATERIAL E MÉTODOS Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Citogenética e Cultura de Tecidos Vegetais da Universidade do Estado de Mato Grosso (UNEMAT) Campusde Alta Floresta. Foram preparadas infusões utilizando 3 concentrações de chá de capítulos florais desidratados de M. recutita: 20 g.L-1, 30 g.L-1 e 40 g.L-1. Estas concentrações foram definidas de acordo com a dosagem recomendada para este tipo de infusão. A infusão foi preparada adicionando-se água fervente sobre os capítulos florais desidratados, sendo a solução homogeneizada e mantida em repouso por 15 minutos (Serigato et al., 1997; Lorenzi et al., 2002; Martins et al., 2003). Após o resfriamento à temperatura ambiente os bulbos de Allium cepa previamente limpos foram colocados em contato com a infusão. Para cada concentração de chá foram dispostos 5 bulbos de A. cepa, tendo como testemunha 3 bulbos onde as raízes germinaram em água destilada. Desta forma ocorreu-se diariamente à troca da infusão e da água, até o momento da coleta. Foram coletadas as radículas de cebola que apresentavam de 1 a 2 cm de comprimento entre o 23º e o 30º dia. O material coletado foi fixado em metanol (P.A) e ácido acético (P.A) (3:1), efetuando-se três trocas de fixador em intervalos de 15 minutos. Posteriormente o material foi mantido sob refrigeração até o momento do preparo das . VIEIRA, Aleson , GUIMARÃES, Marcelo de A. et al __________________________________________________________________________________________ Revista Trópica – Ciências Agrárias e Biológicas V. 3, N. 1, p. 10, 2009 lâminas. Para a preparação das lâminas, os meristemas foram lavados 3 vezes com água destilada em placa de Petri. As radículas foram cuidadosamente secas em papel absorvente e colocadas em solução de HCl 1N por 15 minutos, sendo posteriormente lavadas três vezes com água destilada, realizando as trocas em intervalos de 15 minutos. As radículas foram dispostas sobre a lâmina de microscopia, sendo a região meristemática seccionada com o auxílio de um bisturi. Ao material em plena atividade celular foi acrescentado uma gota do corante orceína acética 2%, sendo realizada uma leve dissociação com o auxílio de um bisturi. Em seguida o material foi coberto com a lamínula, procedendo-se o esmagamento do material com o bastão de vidro. O excesso do corante foi retirado com papel filtro (Guerra et al., 2002; Galvão, 2008). Foram analisada 40 lâminas, 10 de cada amostra, sendo 2000 células visualisadas para cada tratamento. Calculou-se o índice mitótico para cada tratamento, dividindo-se o número de células em mitose (prófase, metáfase, anáfase e telófase) pelo número total de células (interfase e mitose) multiplicando-se o resultado por 100 (Oliveira et al., 1996; Pires et al., 2001). As imagens foram registradas por uma câmera digital SONY 7.2 mega pixels, acoplada a um microscópio Nikon E200. RESULTADOS E DISCUSSÃO Nas avaliações citológicas de A. cepa células mitóticas normais foram observadas na testemunha, permitindo a identificação das diferentes fases da divisão celular (Figuras 1A , 1C , 1D e 1E). Já as células anormais foram observadas nos tratamentos com infusão de M. recutita (Figuras 1 B e F). Entre as anomalias observadas, destacaram-se células apresentando prófase com cromossomos isolados (Fig 1B) e células em apoptose (Figura 1F). A análise das fases de divisão mitótica encontradas em cada um dos tratamentos aplicados permitiram a realização do cálculo do índice mitótico e da porcentagem de células em apoptose (Figuras 2 e 3). O indíce mitótico, percentual de células que encontravam-se em uma das quatro fases da mitose, variou entre 71 e 89% nos tratamentos analisados. Já na testemunha 100% das células analisadas estavam em plena divisão mitótica. Constatou-se que a porcentagem de células em apoptose variou de 22 a 58%, sendo a menor porcentagem encontrada na infusão com menor concentração. Com base nos resultados observados verificou-se um aumento significativo no número de células em morte celular, concomitante ao aumento das doses de M. recutita. Dados semelhantes, de regressão do índice mitótico, sem a observação de alterações cromossômicas, foram observados por Camparato et al. (2002) em seus trabalhos com a espinheira santa (Maytenus ilicifolia) e com a Pata-de-vaca (Bauhinia candicans Benth.) no qual através de análises de células meristemáticas de bulbos de A. cepa, verificaram que concentrações mais elevadas de extrato promoveram redução no índice mitótico, mas não o surgimento de alterações cromossômicas. A análise qualitativa dos fitoquímicos mostrou que a espinheira-santa contém em suas folhas saponinas, taninos e flavonas tal como a Pata-de-vaca (Bauhinia candicans). . VIEIRA, Aleson , GUIMARÃES, Marcelo de A. et al __________________________________________________________________________________________ Revista Trópica – Ciências Agrárias e Biológicas V. 3, N. 1, p. 11, 2009 A B C D E F AA B C D E F Figura 1. Diferentes fases da divisão mitótica de Allium cepa. (A) Prófase, (B) Prófase com cromossomo isolado, (C) Metáfase, (D) Anáfase, (E) Telófase e (F) Células em apoptose. Barra = 10 µm. Figura 2. Indíce mitótico calculado para raízes de A. cepa submetidas a infusão de M. recutida com diferentes concentrações. Figura 3. Porcentagem de células em apoptose encontradas em raízes de Allium cepa submetidas a infusão de M. recutida com diferentes concentrações. . VIEIRA, Aleson , GUIMARÃES, Marcelo de A. et al __________________________________________________________________________________________ Revista Trópica – Ciências Agrárias e Biológicas V. 3, N. 1, p. 12, 2009 Fachinetto et al. (2007), em seu trabalho com infusões de Marcela (Achyrocline satureioides), verificou o efeito anti-proliferativo de infusões da referida planta sobre células de A. cepa, atribuindo esta observação à atividade dos diferentes compostos químicos presentes na infusão. Rice (1984) descreve que alguns compostos têm atividade alelopática inibitória em altas concentrações, no entanto em baixas concentrações podem não estimular o mesmo processo. As observações apresentadas para M. recutida demonstram que mesmo a menor concentração analisada desencadeou aumento expressivo do número de células em apoptose, indicando que a infusão de 10 g.L-1 apresentava altas concentrações de compostos alelopáticos. O aumento das percentagens de células em apoptose com o aumento da concentração da infusão está em concordância com o observado por Cardoso et al. (2006), indicando a relação entre número de células em apoptose e a quantidade de substâncias químicas presentes na infusão. Este resultado é mais evidente em extratos vegetais em que os compostos mutagênicos estão presentes em maiores concentrações (Chung et al., 2005). Segundo Rodrigues et al. (1992) os compostos alelopáticos são inibidores de crescimento, apresentando diferentes formas de ação, como por exemplo: interferência na divisão celular, alteração na permeabilidade de membranas e na atividade enzimática. Neste contexto, verificou-se que as raízes de cebola foram sensíveis às infusões apresentando concentrações de 15 e 20 g.L-1. Este trabalho mostra que as infusões de M. recutida interferem no processo de divisão celular, bem como estas infusões desencadeiam a necrose das radículas de A. cepa. O processo de necrose caracterizou-se tanto pelo escurecimento das radículas quanto pela redução do seu crescimento, indicando a atividade fitotóxica desta infusão (Periotto et al., 2004; Ferreira et al., 2002). CO&CLUSÕES 1- As infusões de M. recutita possuem efeito genotóxico, uma vez que todas as concentrações causam inibição do ciclo celular e aumento expressivo no número de células em apoptose no sistema teste A. cepa. 2- São necessários estudos complementares para definir com precisão as dosagens e períodos de utilização terapêuticos, garantindo a segurançana utilização desta infusão, bem como a maximização dos benefícios que a M. recutita pode propiciar. 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