2 - Cromatografia e eletroforese

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Instituto de Química – UNESP – Araraquara 
Licenciatura em Química 
 
 
Cromatografia em papel e Eletroforese 
 
 
Giovana Cristina da Silva 
Gabriela Hernandez 
Tais Ribeiro da Silva 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Araraquara 
2019 
 
 
 
Objetivo 
 Estudar duas técnicas de separação de aminoácidos que, quando usadas em 
conjunto, a análise de seus resultados podem levar a identificação de aminoácidos 
presentes em uma amostra de composição desconhecida. 
Cromatografia em papel 
A cromatografia em papel é uma técnica na qual é possível fazer a separação de 
aminoácidos tanto em função da polaridade da sua cadeia lateral, como também pelo 
peso molecular que o mesmo apresenta. 
Para realização do experimento foram aplicadas diferentes soluções de 
aminoácidos em papel, juntamente com uma solução de composição desconhecida 
como mostrado na Figura 1 
 Como solvente, utilizou-se uma solução de butanol: Ácido Acético: H2O (4:1:5). 
Todas as substâncias utilizadas como solvente tem por características um momento 
magnético diferente de zero, ou seja, são moléculas polares. Para explicar o que ocorre, 
pode-se usar como base as estruturas de cada aminoácido: 
 
Figura 1 - Preparo do papel 
 
 
Tendo em vista que o papel é uma substância polar, assim como o solvente 
utilizado, todos os aminoácidos que apresentarem uma polaridade elevada, irão interagir 
com o papel e ficarão mais retidos. Por consequência, se deslocarão pouco, resultando 
num valor de Rf pequeno. Já os aminoácidos apolares irão sofrer pouca interação com a 
fase estacionária, sendo arrastado com maior facilidade pelo solvente. 
 Sendo assim, a valina e a leucina apresentarão maior Rf. Isso se deve à presença 
de uma cadeia lateral apolar nessas estruturas, as quais serão mais deslocadas pelo 
papel. A tirosina deve apresentar um valor intermediário do Rf. Apesar de apresentar 
uma cadeia lateral polar, a mesma não apresenta nenhuma carga. Com isso, a interação 
amino-acido-solvente ou aminoácido-papel não será forte o suficiente pra reter o 
aminoácido. 
 O ácido glutâmico, a lisina, a histidina e a arginina apresentarão valores 
pequenos de Rf, visto que suas cadeias laterais polares possuem um grupo carregado 
positivamente ou negativamente, contribuindo para uma maior polaridade. Assim, a 
interação com a fase estacionária será muito grande, fazendo com que essas substâncias 
fiquem mais retidas perto de onde foram aplicadas. 
 Os diferentes valores de Rf, tanto esperados como observados, podem ser 
justificados também pelo tamanho da cadeia. Aminoácidos menores tem maior 
facilidade de eluir pela fase estacionária e ser arrastados pelo solvente, como é o caso da 
valina e da leucina. Já aminoácidos maiores terão maior dificuldade em percorrer a fase 
estacionário devido ao seu maior peso molecular, resultando num valor menor de Rf 
como é o caso do ácido glutâmico, da lisina, da histidina e da arginina. Para revelar o 
resultado obtido, utilizou-se solução de ninidrina. 
Para o cálculo do Rf utiliza-se a seguinte fórmula: 
 𝑅𝑓 = 
𝑑𝑖𝑠𝑡â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑝𝑒𝑟𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑒𝑙𝑎 𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡â𝑛𝑐𝑖𝑎 (𝑐𝑚)
𝑑𝑖𝑠𝑡â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑝𝑒𝑟𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑒𝑙𝑎 𝑓𝑟𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑜 𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒 (𝑐𝑚)
 
Neste cromatograma a distância percorrida pela fase móvel (solvente) equivale a 15,7 
cm. Os valores de Rf teórico e calculado encontra-se detalhado na Tabela 1. 
Tabela 1 : Aminoácidos e seus respectivos valores de Rf teórico e experimental 
Aminoácido Rf Teórico Rf Calculado 
Tyr 0,45 0,28 
Val 0,60 0,40 
Leu 0,70 0,60 
Glu 0,30 0,20 
Lys 0,24 0,04 
His 0,20 0,07 
Arg 0,20 0,1 
Amostra X 
 0,60 
 0,40 
 0,28 
 
 
 
Resultado da Cromatografia 
Através dos valores de Rf calculados das manchas do cromatograma, observa-se que 
pode haver na amostra X os seguintes aminoácidos: Leucina, Valina e Tirosina, o que 
pode ser comprovado observando-se o cromatograma. 
 
Figura 2 - Resultado do cromatograma, indicando que os aminoácidos presentes na amostra são Valina, 
Leucina e Tirosina 
Eletroforese 
 A eletroforese permite a separação de aminoácidos em determinado valor de pH 
em função do ponto isoelétrico apresentado por cada um. Ou seja, dependendo do pH 
usado no experimento, o aminoácido apresentará uma carga positiva ou negativa, sendo 
atraído para o respectivo polo de carga oposta. Depois de revelada a solução com 
ninidrina, é possível descobrir a composição de uma amostra desconhecida. 
 O experimento foi realizado em dois meios diferentes. O primeiro era um meio 
levemente acidificado (pH = 6), enquanto na segunda situação tinha-se um meio básico 
(pH = 10). As amostras foram aplicadas no papel conforme esquematizado a seguir: 
Figura 3 - Preparação da eletrofose pH = 10 Figura 4 - Preparação da eletroforese em pH = 6 
 
 
 Depois de aplicada as diferentes amostras e feita a eletrólise, obteve-se o 
seguinte resultado: 
 
 
 Tendo em vista os resultados revelados com solução de ninidrina, bem como do 
ponto isoelétrico de cada aminoácido, é possível analisar os possíveis aminoácidos 
presentes na amostra de interesse X. 
Tabela 2: Ponto isoelétrico de alguns aminoácidos 
Aminoácido Ponto Isoelétrico 
Glu 3,22 
Tyr 5,66 
Leu 5,98 
Lys 9,74 
Val 5,97 
His 7,59 
Arg 10,76 
 
 Para a eletroforese realizada em meio de pH = 6 (levemente acidificado), o único 
aminoácido capaz de ser diferenciado é o ácido glutâmico. Como o meio encontra-se em 
um valor de pH maior que o seu ponto isoelétrico, o aminoácido apresentará uma carga 
negativa em sua cadeia, sendo atraído para o polo positivo da eletroforese. 
 
 
 Para o segundo caso, no qual o pH do meio estava básico (pH = 10), a maioria 
dos aminoácidos apresentados na Tabela 2 estão em um pH acima do seu ponto 
isoelétrico. Portanto, todos esses irão apresentar uma carga negativa na sua estrutura, 
sendo atraído em direção ao polo positivo. Alguns possuem mais cargas negativas do 
que outros, gerando uma diferença na distância percorrida na eletroforese. O número de 
cargas está relacionado com a quantidade de grupo ionizáveis presente no aminoácido. 
 A única exceção nesse último caso é a arginina que está no seu estado neutro. 
 Com base no resultado obtido para a amostra X, os possíveis aminoácidos 
presentes são Leucina, Tirosina, Valina e Alanina. Tomando como base a eletroforese, o 
aminoácido que se tem certeza de estar presente na amostra desconhecida X é Leucina, 
Tirosina e Valina o qual pode ser observado o quanto percorreu sem que haja a presença 
de outro aminoácido. 
 
Conclusão 
Através da técnica de Cromatografia e Eletroforese é possível determinar os 
aminoácidos presentes na amostra X. Na Cromatografia, identificou-se como possíveis 
componentes da mistura os seguintes aminoácidos: Leucina, Valina e Tirosina; na 
Eletroforese a pH = 6 identificou-se Leucina, Valina e Tirosina, enquanto que a pH = 
10: Histidina, Lisina, Leucina, Tirosina, Valina. Observando os resultados e 
comparando as técnicas considerando os aminoácidos comuns presentes em ambas, é 
possível afirmar que os componentes presentes na amostra X são: Leucina, Valina e 
Tirosina os quais apareceu na Cromatografia e na Eletroforese em ambos os valores e 
pH. 
Referência Bibliografia 
Nelson, D. L.; Cox, M. M. ; Princípios de Bioquímica de Lehninger; 5ª edição; Editora 
Artmed, 2011