Quantificação de Proteínas - Método de Biureto

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Curso Técnico em Biotecnologia 
Processos Bioquímicos 
 
 
 
 
Dosagem de Proteína usando o método Biureto 
 
 
 
 
 
Gabriele Mentz 
Mara Iara Pedroso 
Nathalia Gonçalves 
Pâmela Stradolini 
 
 
 
 
 
 
Profº. Dra. Alessandra Nejar Bruno e Dr. Leonardo da Silva Bittencourt 
 
 
Porto Alegre, 13 de Setembro de 2019 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
1.1 PROTEÍNAS 
Proteínas são polímeros de aminoácidos responsáveis por controlar 
praticamente todos os processos que ocorrem dentro de uma célula. As proteínas de 
cada organismo, da mais simples das bactérias aos seres humanos, são construídas a 
partir do mesmo conjunto onipresente de 20 aminoácidos (Nelson e Cox, 2019). 
As proteínas têm muitos papéis importantes no corpo; diferentes da gordura e 
do glicogênio, elas não são apenas uma reserva de substratos energéticos. A proteína 
muscular é essencial para o movimento corporal. Outras proteínas funcionam como 
enzimas (catalisadores de reações bioquímicas) ou como componentes estruturais de 
células e tecidos. ( 
Os 20 aminoácidos comumente encontrados nas proteínas estão unidos entre si 
por ligações peptídicas. A sequência linear dos aminoácidos ligados contém a 
informação necessária para formar uma molécula proteica com estrutura tridimensional 
única. (Harvey e Ferrier, 2012). 
 
A estrutura de grandes moléculas, tais como proteínas, pode ser descrita em 
vários níveis de complexidade, arranjada em um tipo de hierarquia conceitual. Quatro 
níveis de estrutura proteica são comumente definidos (Nelson e Cox, 2019). 
 
 
Figura 1 - Níveis estruturais de proteína - Princípios de Bioquímica de Lehninger; Nelson e Cox 2019. 
1.1.1 Estrutura Primária 
 
A sequência de aminoácidos em uma proteína é denominada estrutura primária 
da proteína. A sequência linear dos aminoácidos ligados contém a informação 
necessária para formar uma molécula proteica com estrutura tridimensional única. 
(Harvey e Ferrier, 2012). 
 
 
Figura 2- Estrutura Primária de proteína – Bioquímica ilustrada; Harvey e Ferrier, 2012 
1.1.1.1 Ligação Peptídica 
Nas proteínas, os aminoácidos são unidos covalentemente por ligações 
peptídicas, as quais são ligações amida entre o grupo a-carboxila de um aminoácido e 
o grupo a-amino de outro. As ligações peptídicas não são rompidas por condições 
desnaturantes, como aquecimento ou altas concentrações de ureia. Deve haver uma 
exposição prolongada a um ácido ou a uma base forte em temperaturas elevadas para 
hidrolisar essas ligações de forma não enzimática. (Harvey e Ferrier, 2012) 
 
• Características das ligações peptídicas: A ligação peptídica tem um caráter 
de dupla-ligação parcial, ou seja, é mais curta do que uma ligação simples, além 
de rígida e planar. 
 
 
Figura 3 - Características das ligações peptídicas - Bioquímica Ilustrada; Harvey e Ferrier, 2012. 
A ligação peptídica geralmente é uma ligação trans, em grande parte devido à 
interferência estérica dos grupos R quando em posição cis. (Harvey e Ferrier, 2012) 
 
 
1.1.2 Estrutura Secundária 
Estrutura secundária se refere a qualquer segmento de uma cadeia polipeptídica 
e descreve o arranjo espacial de seus átomos na cadeia principal, sem considerar a 
posição de suas cadeias laterais ou sua relação com outros segmentos. (Nelson e Cox, 
2019). 
 
O esqueleto polipeptídico não assume uma estrutura tridimensional aleatória, mas, em 
vez disso, geralmente forma arranjos regulares de aminoácidos que estão localizados 
próximos uns aos outros na sequência linear. (Harvey e Ferrier, 2012) 
 
 
Figura 4 - Estrutura de proteína Secundária - Bioquímica Ilustrada; Harvey e Ferrier, 2012. 
 
1.1.2.1 α Hélice 
Apresenta estrutura helicoidal, que consiste em um esqueleto polipeptídico 
central espiralado e bem compacto, com as cadeias laterais dos aminoácidos que a 
compõem estendendo-se para fora do eixo central, de modo a evitar a interferência 
estérica entre si. (Harvey e Ferrier, 2012) 
 
1.1.2.3 Folha β 
Outra forma de estrutura secundária, na qual todos os componentes da ligação 
peptídica estão envolvidos com ligações de hidrogênio. As superfícies das folhas β 
apresentam uma aparência "pregueada" e, portanto, essas estruturas são 
frequentemente denominadas ''folhas β pregueadas". Ao contrário da α hélice, as folhas 
β são compostas de duas ou mais cadeias peptídicas ou segmentos de cadeias 
polipeptídicas, que se apresentam quase totalmente estendidos. Nas folhas β as 
ligações de hidrogênio são perpendiculares ao esqueleto polipeptídico. (Harvey e 
Ferrier, 2012). 
 
1.1.2 Estrutura Terciária e Quaternária 
A estrutura primária de uma cadeia polipeptídica determina sua estrutura 
terciária. (Harvey e Ferrier, 2012). O arranjo tridimensional total de todos os átomos de 
uma proteína é chamado de estrutura terciária. Enquanto o termo “estrutura secundária” 
se refere ao arranjo espacial dos resíduos de aminoácidos adjacentes em um segmento 
polipeptídico, a estrutura terciária inclui aspectos de alcance mais longo da sequência 
de aminoácidos. (Nelson e Cox, 2019) 
 
Figura 5 - Estrutura de Proteína terciária - Bioquímica Ilustrada; Harvey e Ferrier, 2012. 
Algumas proteínas contêm duas ou mais cadeias polipeptídicas distintas, ou 
subunidades, que podem ser idênticas ou diferentes. O arranjo destas subunidades 
proteicas em complexos tridimensionais constitui a estrutura quaternária. 
 
 
Figura 6 - Estrutura de Proteína Quaternária - Bioquímica Ilustrada; Harvey e Ferrier, 2012. 
1.2 Espectrofotometria 
A espectrofotometria é uma técnica analítica que permite determinar a 
concentração das soluções por meio da intensidade de luz absorvida ou transmitida por 
elas. Com soluções coloridas, em que a intensidade de cor produzida na solução é 
proporcional à concentração da substância que está sendo dosada, conseguimos 
quantificar a concentração de uma dada substância em uma solução. Isso ocorre devido 
às diversas biomoléculas absorverem luz em comprimentos de onda () característicos. 
A luz branca é um espectro contínuo dos comprimentos de onda de todas as cores. Se 
a luz branca atravessar uma solução contendo um composto corado, certos 
comprimentos de onda de luz são absorvidos seletivamente (BRUNO et al., 2014). 
Em 1852, Johann Lambert estudou transmissão de luz por sólidos homogêneos, 
enquanto August Beer estendeu os estudos para a análise das soluções, resultando na 
Lei de Lambert-Beer que determina que: “Quando uma faixa de luz monocromática 
atravessa uma solução colorida, a quantidade de luz absorvida é diretamente 
proporcional à concentração da solução colorida e à espessura da camada 
atravessada.” (NELSON; COX, 2011). 
O espectrofotômetro é um equipamento que compara quantitativamente a fração 
de luz que passa através de uma solução de referência e de uma solução de teste. De 
modo geral, um espectrofotômetro possui uma fonte estável de energia radiante 
(normalmente uma lâmpada incandescente), um seletor de faixa espectral 
(monocromatizadores, como os prismas, que selecionam o comprimento de onda da luz 
que passa através da solução de teste), um recipiente para inserir a amostra a ser 
analisada (a amostra deve estar em recipientes apropriados conhecidos como cubetas) 
e um detector de radiação, que permite uma medida relativa da intensidade da luz. O 
espectrofotômetro inforna quanta luz foi transmitida (T) ou quanta luz foi absorvida (A). 
Desta forma podemos afirmar que: 
Absorbância (A): é a quantidade de luz que uma solução absorve. Apresenta a 
vantagem de variar de forma linear com a concentração da amostra. 
Transmitância (T): é quantidade de luz que uma solução deixa passar, ou seja, 
não absorve. É expressa em porcentagem de luz transmitida.Assim, quando T=100%, 
não há absorção de fótons. 
A determinação da concentração de um soluto em uma determinada solução por 
espectrofotometria envolve também a comparação da absorbância da solução comum 
com uma solução de referência, na qual já se conhece a concentração do soluto. De 
modo geral, essa solução de refência é chamada de solução-padrão. Pode-se então 
diluir a solução-padrão para obter diferentes concentração (pontos), determinar as suas 
respectivas absorbâncias e traçar um gráfico, cujo perfil é conhecido como curva-
padrão. No gráfico da curva-padrão, o eixo Y (vertical) indica a absorbância da amostra, 
enquanto no eixo X (horizontal) indica a concentração em mg/mL da amostra (BRUNO 
et al., 2014). 
Em cada ponto obtido na curva-padrão, obtemos o fator de calibração (FC) de 
cada ponto da curva. Realizando a média dos fatores de calibração parcial, obtemos o 
fator de calibração médio (FCM) e, com ele, calculamos as concentrações 
desconhecidas em uma solução por meio da seguinte fórmula: 
Q ou C (concentração) = A (absorbância da amostra) X FCM 
1.3 Método de Biureto 
Dentre várias técnicas colorimétricas para quantificar proteínas, o método usado 
para esta aula prática foi o método de Biureto, que consiste em uma técnica baseada 
na formação em meio alcalino de um complexo entre íon cúprico (Cu3+) e as múltiplas 
ligações peptídicas das proteínas. O complexo formado apresenta coloração violeta 
púrpura estável, cujo ponto máximo de absorção ocorre no comprimento de onda de 
545 nm. 
Apesar de ser rápido e utilizar reagentes de baixo custo, esse método não é 
muito sensível. Ainda assim, o método de Biureto continua sendo recomendado para a 
determinação da concentração de proteínas totais em plasma sanguíneo, na saliva e no 
leite (ZAIA; ZAIA; LICHTIG, 1998). 
 
2. OBJETIVO 
 
Apreender o princípio, objetivo e procedimento de uma curva padrão e 
determinar a concentração de proteínas através do método do Biureto. 
 
3. MATERIAIS E MÉTODOS 
 
3.2 Materiais 
 
 Reativo de Biureto (48mL) 
• Solução padrão de albumina 5mg/mL (5 mL) 
• 16 Tubos de ensaio de vidro 
• Espectrofotômetro 
• Cubeta 
• Micropipeta de 1000uL (P1000) 
• 1 pipeta de vidro de 5mL e 1 de 1mL 
• Banho maria e termômetro 
 
 
 
3.3 Métodos 
 
Em tubos de ensaio foram adicionados em duplicata quantidades de água e Albumina 
Bovina Padrão (BSA) em diferentes concentrações conforme a tabela abaixo: 
 
TUBO Concentração 
(mg/mL) 
BSA a 5mg/mL 
(uL) 
Água 
(uL) 
04 2 400 600 
03 1,5 300 700 
02 1 200 800 
01 0,5 100 900 
BRANCO 0 0 1000 
 
Também em duplicata, 1mL de cada uma das 3 soluções de proteína preparadas pela 
técnica do laboratório foram adicionadas à outros 6 tubos, 2 com cada solução. 
TUBOS BRANCO TUBO A TUBO B TUBO C 
H2O mL 1,0 - - - 
Soluções mL 0 1,0 (Solução 
A) 
1,0 (Solução 
B) 
1,0 (Solução 
C) 
 
Após, foram adicionados 2,5mL de Biureto em cada um dos tubos, agitou-se e foram 
aquecidos em banho maria a 37ºC por cerca de 10 minutos. 
No espectrofotômetro previamente ligado e calibrado no comprimento de onda 
desejado (545nm) foi medido a absorbância de cada solução. 
 
 
 
4. RESULTADOS 
 
 
 
Tabela de valores de absorbância para cálculo de FCM 
 
ABORBÂNCIA VALOR 1 VALOR 2 MÉDIA FC 
TUBO 1 0,042 0,038 0,04 12,5 
TUBO 2 0,078 0,074 0,076 13,1 
TUBO 3 0,124 0,117 0,120 12,4 
TUBO 4 0,154 0,157 0,155 12,8 
 
𝐹 =
𝑄
𝐴
 
 
𝐹𝐶1 =
0,5
0,04
= 𝟏𝟐, 𝟓 
𝐹𝐶2 =
1
0,076
= 𝟏𝟑, 𝟏 
𝐹𝐶3 =
1,5
0120
= 𝟏𝟐, 𝟒 
𝐹𝐶4 =
2
0,155
= 𝟏𝟐, 𝟖 
 
𝐹𝐶𝑀 =
12,5 + 13,1 + 12,4 + 12,8
4
= 𝟏𝟐, 𝟕 
 
 
𝑄 =
𝐴
𝐹𝐶𝑀
 
 
𝑄 𝑡𝑢𝑏𝑜 𝐴 =
0,038
12,7
= 𝟎, 𝟎𝟎𝟐 
𝒎𝒈
𝒎𝑳
 
 
𝑄 𝑡𝑢𝑏𝑜 𝐵 =
0,040
12,7
= 𝟎, 𝟎𝟎𝟑 
𝒎𝒈
𝒎𝑳
 
 
𝑄 𝑡𝑢𝑏𝑜 𝐶 =
0,087
12,7
= 𝟎, 𝟎𝟎𝟔
 𝒎𝒈
𝒎𝑳
 
 
 
 
 
 
*Eixo y: Absorbância 
*Eixo x: Concentração de BSA 5 mg/mL 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
0,18
0 0,5 1 1,5 2 2,5
A
b
so
rb
ân
ci
a 
Concentração mg/mL (Q)
Curva - Padrão de BSA 5mg/mL lida em 545 nm
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
BRUNO, Alessandra Nejar et al (Org.). Biotecnologia I: Princípios e Métodos. Porto 
Alegre: Artmed, 2014. p 101 - 102. 
NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de Bioquímica de Lehninger. 5. ed. Porto 
Alegre: Artmed, 2011 
Nelson, L.. Cox, M; Princípios de Bioquímica de Lehninger - 6. ed. – Porto Alegre : 
Artmed, 2014. 
NELSON, David L.; COX, Michael M.; Princípios de Bioquímica de Lehninger - 7. Ed. 
Porto Alegre : Artmed, 2019. 
Harvey, A., Ferrier, D; Bioquímica ilustrada - 5. ed. - Porto Alegre : Artmed, 2012. 
Volhardt, K. et al; Química Orgânica – Estrutura e Função 6ª edição; 6ª edição, 
2013. 
ZAIA, D. A. M.; ZAIA, C. T. B. V.; LICHTIG, J. Determinação de proteínas totais via 
espectrofotometria: vantagens e desvantagens dos métodos existentes. Química 
Nova, v. 21, n. 6, p. 787-793, 1998