Quantificação de Proteínas com Reagente de Biureto

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FAMAM - FACULDADE MARIA MILZA BACHARELADO EM FARMÁCIA 
 
 Aline da Silva Santos Tavares 
 
 
 
 
 
 
Relatório de Aula Prática: 
 
Quantificação de Proteínas com reagente de Biureto 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Governador Mangabeira 
Setembro 
2019 
 
 
 
Aline da Silva Santos Tavares 
 
 
 
 
 
 
 
 Relatório de Aula Prática: 
 
 Quantificação de proteínas com reagente de Biureto 
 
 
 
Relatório apresentado a Disciplina de 
Bioquímica básica do Programa de Graduação em 
Farmácia da Faculdade Maria Milza, como requisito 
parcial de avaliação. 
 
Docente: Prof. Ciro Ribeiro. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Governador Mangabeira 
 Setembro 
 2019 
 
 
 
 
INDICE 
 
1. Introdução: ......................................................................................................... 4 
2. Objetivos: ........................................................................................................... 5 
3. Metodologia: ...................................................................................................... 6 
4. Resultados e Discussões:................................................................................ 7 
5. Conclusão: ......................................................................................................... 8 
6. Referências: ....................................................................................................... 9 
7. Anexos: ............................................................................................................. 10 
 
 
 
 
 
 
 
 
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1. Introdução 
 
1.1 Proteínas 
 
 Proteínas são polímeros formados de diversas partes menores, monômeros, 
denominadas aminoácidos. São as macromoléculas mais abundantes em nosso 
organismo, ocorrendo em todas as células e em todas as partes das células 
(LEHNINGER, 2014). 
As proteínas são constituídas por aminoácidos que ficam unidos por ligações 
amídicas, chamadas de ligações peptídicas, formando uma ou mais cadeias 
polipeptídicas que, normalmente, são unidas por interações não covalentes (VOET, 
VOET, 2013). 
A ligação peptídica se forma a partir da perda dos componentes de uma 
molécula de água, isto é, um grupo hidroxil e um átomo de oxigênio, sendo 
respectivamente do grupo carboxil ligado ao carbono alfa de um aminoácido e do 
agrupamento amina ligado ao carbono alfa do outro aminoácido (LEHNINGER, 
2011). 
Com isso, pode-se dizer que a reação que une os aminoácidos é a de 
desidratação; A reação inversa, isto é, a reação que quebra a proteína nos 
aminoácidos, ou seja, aquela que rompe as ligações peptídicas é a da hidrólise 
(VOET, VOET, 2013). 
 A condição padrão bioquímica favorece os aminoácidos, ou seja, é uma 
reação exergônica, mesmo sabendo que é uma reação lenta devido à alta energia 
de ativação. Por conta disso, para formar a proteína, é necessário tornar as 
condições termodinamicamente favoráveis a essa situação. Isso é realizado ao 
alterar ou ativar o grupo alfa-carboxil para que ele libere o grupo hidroxil 
(LEHNINGER, 2011). 
Tendo a proteína formada, existem duas extremidades: extremidade 
aminoterminal e extremidade carboxiterminal. A leitura é feita da esquerda para a 
direita. O grupo carboxil e o grupo amino das extremidades, e as cadeias laterais 
que ionizam, contribuem para o comportamento ácido-básico. (VOET, VOET, 2013). 
Existem alguns métodos de determinação de proteínas; Como exemplo, 
pode-se citar: Método de Dumas, Método de Warrentrapp e Will e Reação de 
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Biureto. Os dois primeiros métodos, citados no exemplo, se baseiam no teor de 
nitrogênio (GOMES e OLIVEIRA, 2011). 
O método da Reação de Biureto é um método colorimétrico, utilizado em 
situações que requerem uma determinação rápida, embora não seja tão exato 
(GOMES e OLIVEIRA, 2011). Todavia, ele se baseia na determinação de um 
complexo quadrado planar entre o íon cúprico e as múltiplas ligações peptídicas das 
proteínas. No caso de o complexo ser formado, a solução apresenta uma coloração 
violeta púrpura estável (BRACHT e ISHII -IWAMOTO, 2003). 
 
 
 
2. Objetivos 
 
2.1 Objetivos Gerais 
 
• Determinar de forma quantitativa as proteínas com reagente de Biureto. 
 
2.2 Objetivos específicos 
 
• Observar a mudança de coloração nas soluções; 
• Observar a absorbância das reações no espectrofotômetro. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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 3. Materiais e Métodos 
 
3.1 Materiais 
 
• Solução de Proteína Padrão (Albumina Bovina); 
• Reagente de Biureto; 
• Hidróxido de Sódio (NaOH) 6M; 
• Água destilada; 
• Cubeta; 
• Tubos de Ensaio; 
• Pipeta; 
• Micropipeta; 
• Ponteiras; 
• Espectrofotômetro; 
• Banho Maria à aproximadamente 100°C. 
 
3.2 Metodologia 
 
Inicialmente foi preparada a reação, onde, foram adicionados 2,5 mL de 
reagente de biureto e água destilada com o auxílio da pipeta, foi colocada a ponteira 
na micropipeta, e pipetado 50 μl de proteína padrão (albumina bovina) e adicionado 
duas gotas de NaOH (6M) na cubeta, após isto, foi levado ao espectrofotômetro para 
que fossem analisados e anotados os valores de absorbância presente, usando o 
comprimento de onda de 550 nm. Posteriormente foi transferido para o tubo de 
ensaio e levado ao banho-maria à aproximadamente 100°C, durantes alguns 
minutos, transferido novamente para a cubeta e colocado no espectrofotômetro e 
lida sua absorbância após aquecimento. 
 Na segunda reação: Foram adicionados 2,5 mL de proteína padrão (albumina 
bovina) e água destilada com o auxílio da pipeta, foi pipetado com a micropipeta 50 
μl de reagente de biureto, e foi adicionado duas gotas de NaOH (6M), colocado em 
um tubo de ensaio levado ao banho-maria à aproximadamente 100°C, 
posteriormente transferidos para uma cubeta e colocado no espectrofotômetro e foi 
observada a oscilação de absorbância. 
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4. Resultados e Discussões: 
 
O método de biureto é um dos mais utilizados para quantificação de 
proteínas, sua simplicidade de aplicação é o que o torna tão interessante, pois é 
realizado em equipamentos que estão sempre presentes em um laboratório, tal 
como o espectrofotômetro. 
O biureto (reagente utilizado durante o processo) é produzido a partir de uma 
mistura de um composto contendo cobre, sulfato de cobre, tártaro de sódio 
(complexante utilizado para estabilizar o cobre em solução) e potássio, sendo estes 
dissolvidos em uma solução de hidróxido de sódio. 
Ao colocar o reagente de biureto em contato com a solução contendo as 
amostras de proteína (albumina) e deixá-las em banho-maria, observou-se que o 
meio mudou de cor, sendo a coloração do reagente de biureto azul e após a mistura 
da solução com os outros componentes da reação passa a ter uma coloração 
violeta, tal fato ocorreu, pois o reagente de biureto reagiu com as proteínas 
presentes nos tubos, formando um complexo quadrado planar entre a ligação 
peptídica e o íon cúprico, ou seja, a variação da intensidade de coloração é de 
acordo com a concentração de proteínas presente na amostra. 
Para quantificar as proteínas presentes na amostra, foi necessário observar a 
oscilação de absorbância que apresentava no espectrofotômetro, onde a solução 
antes do aquecimento em banho-maria apresentava oscilaçõesentre: 0,358- 0,369- 
0,371 e após o aquecimento apresentou absorbância de: 0,426. Isto se dá, 
relativamente por que a amostra que tiver maior índice de proteínas tende a ter uma 
maior absorbância, pois o aquecimento faz com que ocorra a quebra das moléculas 
de proteínas presentes, fazendo com que elas fiquem mais agitadas (devido ao 
calor) favorecendo assim a absorção de luz. 
A absorbância, por sua vez, consiste na medida da luz absorvida, onde mede-
se a intensidade de luz absorvida por uma solução corada pela redução da medida 
da intensidade da luz transmitida. Contudo, como a absorbância e transmitância 
tende a ser complementares, quanto maior é a absorbância, menor é a 
transmitância. 
 
 
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A técnica utiliza a propriedade das soluções de absorver ou transmitir a luz 
para quantificar reações. Na prática, a quantidade de luz absorvida ou transmitida é 
proporcional à concentração da substância em solução. Com isto, a oscilação de 
absorbância no espectrofotômetro das reações depende das intensidades das 
radiações emitidas ou absorvidas pelos sistemas em análise. 
 
 
 
5. Conclusão: 
 
As reações de coloração de proteínas permite a caracterização dessas 
análises de suas propriedades físicas e químicas, como ligações peptídicas, 
estrutura molecular e solubilidade. O método de Biureto é positivo, já que foi 
possível a realização da quantificação das proteínas. Pode-se concluir que a análise 
das amostras é possível, já que as amostras utilizadas possuem ligações peptídicas 
em sua composição. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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6. Referências 
 
BRANCHT, A.; I SHII-IWAMOTO, E.L., Métodos de laboratório em bioquímica, 1ª 
ed., Editora Manol: São Paulo, 2003. 
 
CAMPBELL, M. K.; FARRELL, S. O. Bioquímica: bioquímica metabólica, Vol. 1. 5ª 
ed. Thomson Learning: São Paulo, 2007. 
 
LEHNINGER, A.L. Princípios de bioquímica. 5ª ed., Porto Alegre: Artmed, 2011. 
 
VOET, Donald; VOET, Judith G. Bioquímica. 4. ed. Porto Alegre, Artmed, 2013. 
 
ZAIA, D.A.M; ZAIA, C.T.B.V; LICHTIG. Determinação de proteínas totais via 
espectrofotometria: Vantagens e desvantagens dos métodos existentes, 1998. 
Departamento de Química, Departamento de Ciências Biológicas e Instituto de 
Química, Universidade Estadual de Londrina, Paraná. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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7. Anexos 
 
Materiais utilizados na aula prática: