Métodos diagnósticos para pesquisa de Imunoglobulinas(Ig)

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Imunologia 
 
 
 
 
MÉTODOS DIAGNÓSTICOS PARA PESQUISA DE 
IMUNOGLOBULINAS (Ig) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Sumário 
 
Introdução ........................................................................................................................ 2 
 
Objetivo ............................................................................................................................ 2 
 
1. Produção programada de imunoglobulinas .............................................................. 2 
 1.1. Geração de anticorpos policlonais ......................................................................... 2 
 1.2. Anticorpos monoclonais ......................................................................................... 3 
2. Métodos laboratoriais utilizando Ig..............................................................................3 
 2.1. Quantificação de antígeno por imunoensaios.......................................................3 
 2.2. Identificação e purificação de proteínas..............................................................5 
 2.3. Imunoprecipitação e cromatografia por imunoafinidade..................................5 
 2.4. Western blotting....................................................................................................5 
 2.5. Marcação e detecção de antígenos em células e tecidos...................................6 
 2.6. Citometria de fluxo e separação de células ativadas por fluorescência............6 
 2.7. Imunofluorescência e imuno-histoquímica.........................................................6 
 
Exercícios ......................................................................................................................... 7 
 
Gabarito ............................................................................................................................ 7 
 
Resumo ............................................................................................................................. 8 
 
 
 
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Introdução 
Vimos nas apostilas: classificação e comportamento das imunoglobulinas 
(ig), imunoglobulinas I: ligação à antígeno, imunoglobulinas II: função efetora, que 
durante a resposta imune adaptativa são produzidas imunoglobulinas (Ig) altamente 
específicas para um determinado antígeno. Devido à essa importante propriedade, 
podemos utilizar as Ig, fora do organismo, para identificar diversas substâncias em 
laboratório. 
A partir do conhecimento dos principais elementos da imunidade adaptativa 
podemos avaliar como é possível manipular esses elementos in vitro e in vivo. Isso é 
feito com o objetivo de ampliar o conhecimento sobre a imunidade ou para a 
elaboração de reagentes (basicamente pelo emprego de anticorpos). 
Nesta apostila vamos abordar em termos práticos como as Ig podem ser 
utilizadas em testes diagnósticos. 
Objetivo 
• Verificar as inovações tecnológicas serão abordadas na imunologia, bem 
como os exames usados para diagnósticos laboratoriais 
 
1. Produção programada de imunoglobulinas 
Além de desempenharem um papel fundamental na defesa do nosso 
organismo contra patógenos infecciosos, as imunoglobulinas (Ig) também são 
reagentes incrivelmente úteis e extremamente específicos para a detecção e 
quantificação de outras proteínas e de muitas outras substâncias. 
As Ig tem muitas aplicações práticas, que vão desde a purificação de 
proteínas pela utilização de colunas com afinidade pelas Ig, a detecção de 
hormônios circulantes em amostras de sangue ou urina para diagnóstico clínico, a 
verificação da expressão e da localização subcelular de proteínas, a imunoterapia 
contra o câncer e o uso como antídotos em casos de picada de aranha e cobra. 
Vamos abordar agora, em termos práticos, o mecanismo de produção em 
laboratório dessas proteínas de incrível adaptabilidade. 
 
1.1. Geração de anticorpos policlonais 
As proteínas são excelentes imunógenos, ou seja, capazes de provocar 
resposta imune, e contém inúmeros epítopos (estrutura mínima necessária para o 
 
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reconhecimento pelas Ig). Sendo assim, a injeção do antígeno em um animal quase 
sempre induz a produção de uma mistura de anticorpos contra diferentes epítopos 
do antígeno. Alguns anticorpos dessa mistura podem ser direcionados a epítopos 
existentes em outros antígenos, no que é denominado reatividade cruzada. 
 
1.2. Anticorpos monoclonais 
A técnica de produção de clones imortais de células que sintetizam uma única 
especificidade de anticorpo mediante fusão de células produtoras de Ig normais com 
uma linhagem tumoral de células B apropriadas. Esse método torna possível o 
cultivo de clones de células B individuais até um ponto em que se produza enormes 
quantidades de Ig antígeno-específica. 
 
2. Métodos laboratoriais utilizando Ig 
Devido à alta especificidade das Ig para antígenos particulares elas formam 
ótimos reagentes para a detecção, purificação e quantificação dos antígenos. As Ig 
podem ser produzidas contra praticamente qualquer tipo de macromoléculas e 
pequenas moléculas químicas, e por isso podem ser usadas para estudar 
praticamente qualquer molécula em solução ou nas células. 
 
2.1. Quantificação de antígeno por imunoensaios 
Métodos imunológicos para quantificar e concentrar o antígeno fornecem 
sensibilidade e especificidade excelentes e se tornaram técnicas padrão para 
pesquisa e aplicação clínica. 
Todos os métodos imonoquímicos de quantificação se baseiam em ter um 
antígeno ou anticorpo puro em quantidades que podem ser medidas por uma 
molécula indicadora, ou um marcador. 
 
EXEMPLO 
 
 
 
O antígeno ou anticorpo é marcado com um 
radioisótopo, ele pode ser quantificado por 
instrumentos que detectam os eventos de decaimento 
radioativo. Este ensaio é denominado 
radioimunoensaio. 
 
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 Um antígeno ou anticorpo acoplado covalentemente a uma enzima pode ser 
quantificado com um espectrofotômetro, e determinar a taxa na qual a enzima 
converte um substrato límpido em um produto colorido. Este ensaio é denominado 
imunossorvente ligado à enzima (ELISA). 
 A variação do ensaio de ELISA mais comumente utilizada é o ensaio em 
sanduíche. Este ensaio usa duas Ig que se ligam à diferentes epítopos em um 
antígeno para determinar sua concentração conforme o esquema representado na 
figura seguinte. 
 
Ensaio de ELISA sanduíche 
 
 Uma quantidade fixa de Ig é fixada no fundo de uma placa e as soluções de 
teste contendo o antígeno, a qual se deseja determinar a concentração, ou uma série 
de soluções padrão com concentração conhecida são adicionadas aos poços e 
deixadas aderir. O antígeno que não se ligou a Ig é removido por lavagem, e uma Ig 
secundária, que pode ser uma enzima ligada ou radiomarcada é adicionada para 
também aderir. O antígeno fica no meio, entre as duas Ig, e quanto mais antígeno 
estiver presente na solução, mais enzima ligada ou Ig radiomarcado irá se ligar. Os 
resultados das soluções padrão são utilizados para criar uma curva de concentração 
que depois será utilizada para calcular a concentração da solução teste. Este tipo de 
 
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ensaio pode ser utilizado na clínica para determinar a concentração do vírus da 
imunodeficiência humana (HIV), vírus da hepatite, dentro outros. 
 
2.2. Identificação e purificação de proteínas 
Ensaios de imunoprecipitação e cromatografia por imunoafinidade utilizam 
Ig para identificar e caracterizar proteínas presentes em uma mistura, como por 
exemplo, amostras biológicas. 
 
2.3. Imunoprecipitaçãoe cromatografia por imunoafinidade 
Na imunoprecipitação uma Ig específica se liga a um antígeno proteico em 
uma mistura de proteínas para identificar uma em especial. Usualmente é 
adicionado a mistura de proteína (normalmente células específicas lisadas), e uma 
proteína A estafilocócica (ou proteína G) covalentemente ligada a partículas de 
agarose é adicionada na mistura. 
A região Fab da Ig se liga às proteínas-alvo, e a região Fc da Ig se liga a 
proteína A ou G nas partículas. Em seguida as partículas são lavadas através de 
adição de detergente e centrifugação para eliminação das proteínas indesejadas. A 
proteína alvo que foi ligada à Ig pode ser eluída das partículas e dissociada da Ig com 
o uso de uma solução desnaturante (que pode ser sódio dodecil sulfato) e as 
proteínas são separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida-sódio dodecil 
sulfato. Essas proteínas podem ser detectadas por eletroforese com coloração do gel 
de poliacrilamida. 
A cromatografia por imunoafinidade é um método que se baseia em Ig ligadas 
a um suporte sólido em coluna para purificar antígenos a partir de uma solução. 
Uma mistura de antígenos passa pela coluna e a Ig se liga ao antígeno alvo. O 
restante das moléculas que não se ligou será lavado. O antígeno ligado é eluído com 
a troca do pH ou com soluções com muito sal, que vai quebrar as interações entre Ig 
e antígeno. 
 
2.4. Western blotting 
O Western blotting é um método que detecta proteínas específicas em uma 
mistura de proteínas de uma amostra biológica. Este método é capaz de determinar 
o tamanho e a expressão relativa de uma proteína. Para isso, em uma amostra 
contendo proteína é adicionado detergente (dodecil sulfato de sódio), que faz com 
que as proteínas fiquem em cadeias lineares e cobertas com carga negativa. Estas 
proteínas são então separadas de acordo com seu tamanho por eletroforese em gel. 
As proteínas são então transferidas para uma membrana, de forma que esta fique 
com as mesmas bandas apresentadas no gel. A membrana é então incubada com 
 
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uma Ig primária, que reconhece especificamente a proteína de interesse. Após, a 
amostra é lavada para que toda Ig não ligada seja retirada. A membrana é 
novamente incubada com uma Ig secundária, que se liga especificamente à 
primária, e está ligada a uma enzima que produz cor ou luz. Desta forma uma 
proteína específica é facilmente identificada. 
 
2.5. Marcação e detecção de antígenos em células e tecidos 
Imunoglobulinas específicas para determinados antígenos expressos em tipo 
celulares particulares são utilizadas para identificar essas células em tecidos ou 
suspensões celulares e para separar essas células de populações misturadas. Nesses 
métodos as Ig podem ser marcadas por fluorescência, radioatividade ou partículas 
magnéticas. 
 
2.6. Citometria de fluxo e separação de células ativadas por 
fluorescência 
Diferentes receptores presentes na superfície celular ou a expressão 
intracelular de diferentes moléculas podem ser utilizados para diferenciar células de 
diferentes linhagens teciduais, estados de maturação ou ativação. Ig contendo 
marcadores fluorescentes se ligam à receptores específicos presentes na membrana 
celular. Desta forma, as células que apresentam os receptores ligados à Ig emitem 
fluorescência. O citômetro de fluxo é um equipamento que analisa células 
individualmente e detecta a fluorescência emitida pelas células. Desta forma, este 
equipamento é capaz de determinar o número de células que expressam o receptor 
ao qual a Ig com marcador fluorescente foi ligada. 
 
2.7. Imunofluorescência e imuno-histoquímica 
As Ig também podem ser utilizadas para identificar a distribuição de um 
antígeno dentro de um tecido ou de compartimentos celulares. Para isso, o tecido 
ou célula é marcado com uma Ig ligada a um fluorocromo ou enzima e a posição do 
marcador é feita por um microscópio apropriado, como por exemplo o confocal. 
Nestes métodos imunomicroscópicos os sinais podem ser aumentados a 
partir da utilização da técnica de sanduíche. 
 
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Exercícios 
1. (Autora, 2019) Qual das seguintes técnicas tem como princípio a ligação 
do antígeno a uma Ig fixada no poço e outra Ig marcada? 
a. Citometria de fluxo. 
b. Western blotting 
c. ELISA 
d. ELISA sanduíche 
e. fluorocromo 
 
2. (SEE/DF, 2018) Acerca das técnicas e dos métodos para avaliar a função 
imunológica, julgue os itens seguintes. As aplicações da citometria de 
fluxo incluem fenotipagem de leucócitos, diagnóstico e classificação de 
leucemias e de linfomas. 
a. Certo 
b. Errado 
 
3. (Autora, 2019) Qual a principal vantagem dos anticorpos monoclonais em 
relação aos anticorpos policlonais? 
a. Especificidade 
b. Reprodutibilidade 
c. Economia 
d. Rapidez 
e. Facilidade 
 
Gabarito 
1. Resposta correta: d. A descrição corresponde classicamente à técnica de 
ELISA sanduíche. 
2. A afirmação está correta. A citometria de fluxo é capaz de analisar células 
em diferentes estados de maturação e com diferentes receptores de 
superfície, marcados com Ig ligadas a marcadores imunofluorescentes. 
3. Resposta correta: a. A principal vantagem dos anticorpos monoclonais é 
que eles são específicos não apenas para um antígeno, mas também para 
determinado epítopo. Isso minimiza a possibilidade de reação cruzada. 
 
 
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Resumo 
A partir da produção in vitro de anticorpos monoclonais foi possível o 
desenvolvimento de diversas técnicas utilizando imunoglobulinas (Ig) específicas 
para aplicação tanto na pesquisa quanto na prática clínica. Métodos imunológicos 
para quantificar e concentrar o antígeno fornecem sensibilidade e especificidade 
excelentes e se tornaram técnicas padrão para pesquisa e aplicação clínica. 
O ensaio de ELISA se baseia em um antígeno ou anticorpo acoplado 
covalentemente a uma enzima que será quantificado com um espectrofotômetro, e 
determinar a taxa na qual a enzima converte um substrato límpido em um produto 
colorido. As Ig podem ser utilizadas para identificar e caracterizar proteínas e para 
purificar proteínas específicas em misturas por métodos de imunoprecipitação e a 
cromatografia por imunoafinidade. 
 A técnica de Western blotting é utilizada para identificar e determinar a 
quantidade relativa e o peso molecular de uma proteína dentro de uma mistura de 
proteínas ou outras moléculas. A técnica de citometria de fluxo é capaz de detectar a 
fluorescência de células individuais em uma suspensão e assim determinar o 
número de células que expressam a molécula à qual o marcador fluorescente se liga. 
Métodos imunomicroscópicos avaliam Ig marcadas para identificação da 
distribuição do antígeno em um tecido ou compartimento celular. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Referências bibliográficas 
DELVES, P. J. et al. Roitt - Fundamentos de Imunologia. Edição: 13a ed. [s.l.] Guanabara Koogan, 2018. 
ABBAS, A. Imunologia Celular e Molecular. Edição: Com Pin ed. [s.l.] Elsevier, 2015. 
Referências imagéticas 
Autora, 2019