Imunologia (Anticorpos Monoclonais, Técnicas em Imunologia, ELISA, Western Blotting e Citometria de Fluxo)

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Anticorpos monoclonais 
Foi uma tecnologia desenvolvida em 1975 por 
dois pesquisadores (George Kohler e Cesar 
Milstein). É utilizado para diagnósticos e 
pesquisas clínicas. 
 
Os pesquisadores ganharam o prêmio Nobel de 
medicina em 1984 pelo trabalho com anticorpos 
monoclonais. 
 
O anticorpo é produzido pelos linfócitos B. 
 
Os anticorpos são proteínas. 
 
As células B fazem o reconhecimento de um 
microrganismo, se diferenciam em um 
plasmócito, que vai produzir as antiglobulinas 
(anticorpos) e começa a opsonizar os 
microrganismos. 
 
 - Estrutura geral das imunoglobulinas 
São 2 cadeias pesadas (maiores que acabam 
sendo pesadas) e 2 cadeias leves (parte menor 
que acaba sendo mais leve, são aminoácidos). 
 
Ambas as cadeias são compostas por 
aminoácidos. 
 
A região variável é a parte que varia para se ligar 
em vários anticorpos, se ligam aos epítopos dos 
microrganismos. 
 
A região constante não muda. 
 
Na região variável, temos segmentos chamados 
de segmentos hipervariáveis. Tem pequenas 
sub-regiões, que são os segmentos 
hipervariáveis. 
 
Pode ser chamado de regiões determinantes de 
complementaridade (CDR), são três (CDR1, 
CDR2, CDR3) e são formados por 
aproximadamente 10 aminoácidos. É a 
especificidade do anticorpo. 
 
 
 
As nossas respostas imunológicas são as 
respostas policlonais, porque recruta várias 
células B para o mesmo antígeno. Todas células 
B vão se ligar a diferentes epítopos do mesmo 
microrganismos, então temos respostas 
diferentes, cada uma tem um anticorpo específico 
para cada epítopo. Com isso, a resposta é 
policlonal. 
 
Se injetarmos um antígeno qualquer em um 
mamífero, no soro do mamífero conterá vários 
anticorpos contra o mesmo antígeno mas para 
epítopos diferentes. 
 
- Qual a base da técnica dos anticorpos 
monoclonais? 
A célula B precisa de estímulos para viver na 
cultura (in vitro), só que para cultivar melhor, eles 
fundiram-se com a célula tumoral. 
 
A fusão dá origem a um hibridoma, assim temos 
os anticorpos sendo produzidos que são os 
anticorpos monoclonais. 
 
Após a fusão das células, a célula vai ter dois 
núcleos, ficando nesse estágio até ocorrer a 
mitose. Após algumas mitoses, os cromossomos 
individuais são secretados nas células-filhas. Por 
causa do núcleo anormal de cromossomos (por 
ter juntado dois núcleos), a segregação nem 
sempre resulta em números idênticos de 
cromossomos para as células-filhas. Alguns 
cromossomos podem ser perdidos. 
 
A produção vai apurar caso sejam perdidos 
dependo dos cromossomos, pois perdeu a cadeia 
leve. 
 
O hibridoma possui características tanto dos 
linfócitos B, quanto das células tumorais. 
 
A célula B é imortal, por causa do tumor. 
Capacidade de produção de anticorpos; 
Longa vida da população celular. 
 
Como se chega a um hibridoma produtor de 
anticorpos cuja especificidade seja conhecida? 
O objetivo é produzir anticorpos monoclonais 
específicos para o antígeno X. 
 
1º passo: conseguir o clone de células B. 
 
2º passo: células tumorais que serão fundidas. 
 
3º passo: fusão celular 
4o passo: selecionar células fusionadas. Nem 
todas as células B vão se fundir com as células 
tumorais. 
 
5º passo: separar os clones de hibridomas. 
 
6º passo: selecionar os clones específicos que 
queremos. 
 
7º passo: encontrando o hibridoma que vai 
produzir o monoclonal certo, vai ter a expansão 
dos clones selecionados. 
 
• 1º passo 
Conseguir vários clones de células B específicas 
para um antígeno. 
 
Pegamos o antígeno X, que vai ser injetado em 
um mamífero. Depois de algumas semanas, vai 
ter a resposta imunológica. Depois de algumas 
semanas, faz a eutanásia do animal e retira o 
baço, que vai ter várias células B. 
 
A maioria das células B que estão no baço, é 
para ter células B que produzem o anticorpo para 
antígeno X, mas teremos outras células B no 
baço. 
 
No baço de camundongo imunizado haverá 
linfócito B com anticorpos específicos para o 
antígeno X bem como linfócitos B com anticorpos 
específicos para outras estruturas. 
 
Isolar as células do baço. 
 
• 2º passo 
Cultivar células tumorais que possam ser 
fundidas com os linfócitos B do camundongo 
imunizado. 
 
Em geral, fusões entre células similares são mais 
bem sucedidas do que fusões entre células 
diferentes, por isso a escolha do mieloma como 
fonte de células tumorais. 
 
As características do mieloma: 
Células neoplásicas – imortais 
Derivadas de linfócitos B 
Não secretam anticorpos. 
 
• 3º passo 
Fusão das células tumorais com os linfócitos B. 
 
Pegamos todos os linfócitos que estavam no 
baço, é colocado em um meio de cultura novo 
com as células tumorais. É preciso que se dê 
estímulo para que a fusão ocorra. 
Estímulos para fusão: polietilenoglicol (deixa a 
membrana mais permeável e deixam as células 
se fundirem) ou pulso elétrico (deixa as 
membranas mais permeáveis também). 
Mas nem todas se fundem. 
 
• 4º passo 
Selecionar as células que se fundiram 
(hibridomas). Pois são 3 tipos de células: células 
B não fundidas, mielomas não fundidos e 
hibridomas. 
 
Como selecionar? 
Primeiro, tiramos os linfócitos B, que não vivem 
muito tempo em cultura sem estímulos. 
 
Para remover o mieloma adicionamos meio HAT 
à cultura celular. Meio HAT é um meio de 
seleção, que é composto por hipoxantina, 
aminopterina e timidina. O mieloma não possui a 
enzima HGPRT, que é essencial para a 
sobrevivência celular no meio HAT, logo, não 
conseguem metabolizar o meio HAT. 
 
HGPRT: hypoxanthime guanine phosphoribosyl 
transferase. 
 
Apenas as células tumorais que se fundiram com 
linfócitos B (que possuem HGPRT) são capazes 
de sobreviver neste meio de cultura. 
 
Os hibridomas tem diferentes especificidades. 
 
• 5º passo 
Encontrar e separar os clones de hibridomas 
certos (anticorpo que injetamos). 
 
Como fazer isso? 
São realizadas diluições seriais de modo que a 
concentração final das amostras seja de 1 
células/poço. 
 
Em uma placa com vários poços, haverá uma 
célula de hibridoma por poço. 
 
Essa uma célula é então cultivada e dá origem a 
uma população homogênea de células secretoras 
de anticorpos que possuem a mesma 
especificidade. 
 
Os anticorpos que vieram só de um clone, são 
chamados de anticorpos monoclonais. 
Mas nem todos os anticorpos produzidos pelos 
hibridomas têm a mesma especificidade. Então, 
tem que testar para saber se é o mesmo 
anticorpo. 
 
• 6º passo 
Testar a especificidade de cada anticorpo, para 
encontrar o poço que contenha os anticorpos 
anti-X na placa de ELISA. 
 
No fundo da placa, vamos injetar o antígeno X e 
por cima jogaremos os anticorpos monoclonais. 
Se for o anticorpo para o antígeno X, o receptor 
vai se ligar ao antígeno. Se não for o anticorpo 
certo, não vai se ligar. 
 
Onde houver mudança de cor, há o anticorpo 
específico para o antígeno X. as cores mais 
escuras é onde tem mais ligação. 
 
• 7º passo 
Achamos o anticorpo certo e vamos expandir a 
população de hibridomas produtores de anti-X. 
Em seguida, é colocado em uma garrafa de 
cultura para cada célula e elas vão se expandir. 
Vai formar os anticorpos, que são os anticorpos 
monoclonais. 
 
- Utilidades dos anticorpos 
monoclonais 
Podem ser utilizados para a fenotipagem celular, 
diagnóstico, terapia, pesquisa. 
 
• Terapia 
Câncer, inflamação, doenças cardiovasculares, 
doenças autoimunes, rejeição a transplantes. 
 
Já existem 570 mAbs terapêuticos foram 
estudados em ensaios clínicos por empresas 
comerciais. 
 
79 mAbs terapêuticos foram aprovados pelo 
FDA. 
 
3º mAbs são utilizados para o tratamento do 
câncer. 
 
Os anticorpos murinos (dos camundongos) são 
“vistos” pelo sistema imune como estranhos e 
passam a produzir anticorpos humanos anti-
corpos de camundongos (HAMA). 
 
Causa rápida eliminação destes anticorpos pelo 
hospedeiro e a formação de complexos imunes, 
que causam lesão aos rins. Para tentar resolver o 
problema do HAMA, foram criados outros 
anticorpos monoclonais. 
 
Foi criado o anticorpomonoclonal quimérico que 
tem somente a parte menor com o murino e o 
resto humano. 
O anticorpo humanizado só tem o a parte variável 
do murino e o resto é humano. 
 
Por fim, criaram o totalmente humano, então não 
tem nada de murino. 
 
• Nomenclatura de biofármacos 
O prefixo é formado por uma sílaba que define o 
nome do biofármaco, seguido por outra que 
define o alvo ou a doença de indicação. 
 
O sufixo é formado por uma ou duas letras que 
identificam a fonte do anticorpo, seguido pela 
sílaba “mab” (monoclonal antibody). 
 
 
 
 - histórico dos anticorpos monoclonais 
1986: primeiro mAb terapêutico: Muromonab-
CD3 (orthoclone OKT3). Rejeição aguda de 
transplante. Em 30 de julho de 2011: término da 
comercialização. 
 
1994: primeiro anticorpo quimérico: Abciximab. 
Serve a inibição da agregação plaquetária em 
doenças cardiovasculares. 
 
1997: primeiro MaB com indicação oncológica: 
Rituximabe. 
 
1997: primeiro MaB humanizado: Daclizumab. 
Prevenção da rejeição do transplante. 
 
2002: primeiro anticorpo terapêutico totalmente 
humano: Adalimumabe (humira). Artrite 
reumatoide. 
 
Os anos são os anos de aprovação pelo FDA. 
 
 
Técnicas em Imunologia 
As aplicações são em pesquisa e diagnóstico. 
É trabalhado com o anticorpo, normalmente. 
Se tivermos o anticorpo, é porque estamos com a 
doença ou o microrganismo entrou em contato 
com nosso organismo e criamos o anticorpo. 
Depende do microrganismo. 
São 3 técnicas de imunoprecipitação. 
 
 - Reação de precipitação 
Acontece em química. 
Precipitado é uma substância que foi formado, 
pela reação química e que é insolúvel. Ou seja, 
precipitado é um sólido que se forma e se 
deposita no meio de uma solução líquida. 
Na imunologia: anticorpos + antígenos formam 
uma rede que pode desenvolver um precipitado 
visível. 
Na imunologia, é chamado de imunoprecipitação. 
 
A quantidade de precipitado formado depende 
de: 
Fatores físico-químicos (pH, temperatura); 
Imunologicos (tipo de Antigeno (Ag) e anticorpo 
(Ac). 
Principalmente: concentrações relativas do 
antígeno e de anticorpo equivalentes (zona de 
equivalência). Equivalência: é a igualdade no 
valor de anticorpo e de equivalência. 
Sem equivalência, o precipitado não é totalmente 
adequado, não forma adequadamente e não dá 
para ver a olho nu. 
Quando tiver uma equivalência, são as messas 
quantidades de anticorpo e antígeno. 
 
 
• Imunoprecipitação 
São 3 (mais antigas) mas é difícil utilizarem: 
1) imunodifusão simples 
2) imunodifusão radial dupla 
3) imunodifusão radial simples 
 
• Imunodifusão simples 
Foi desenvolvida por Oudin em 1946. 
Pode ser chamada de método de Oudin. 
Em um tubo de ensaio, colocaram ágar ou 
agarose. Passando o tempo, o ágar fica 
gelificado. 
Antes de gelificar, coloca-se o anticorpos do 
antígeno. Com isso, após a gelificação tem vários 
anticorpos espalhados. 
Após a gelificação, adiciona-se o Ag e aguarda-
se por 1 semana a formação da linha de 
precipitação. Isso acontece pois o antígeno vai se 
difundido e com o tempo, os antígenos vão 
entrando no gel, vai se tendo a ligação dos Ag 
com o Ac. 
Quando os imunoprecipitados são formados no 
gel, o tamanho dos agregados fica maior do que 
o diâmetro dos poros e evita-se a difusão dos 
complexos Ag-Ac. Formando o imunoprecipitado. 
A limitação é o tempo que demora. 
 
 
• Imunodifusão radial dupla 
Desenvolvido por Ouchterlony em 1947. Pode ser 
chamada de método de Ouchterlony. 
Coloca-se ágar ou agarose sobre uma lâmina ou 
placa de Petri. Quando endurece, não tem 
anticorpo. 
Faz-se em seguida, pequenos orifícios no gel e 
são adicionadas as soluções testes de antígeno e 
anticorpo. Vão se difundir por todos os lados do 
gel. 
Ao mesmo tempo ou na sequência, nos buracos 
ao redor de onde foi colocado o anticorpo. Vai se 
disseminar por todos os lados do gel. 
O anticorpo é depositado no meio e é 
disseminado por todos os lados do gel. 
Se for positivo, tem o antígeno para o anticorpo. 
Se o anticorpo esta entrando no gel e o antígeno 
também está entrando, com isso, vão se 
encontrar em algum momento. Se for positivo, 
vamos ter a equivalência (forma arcos de 
precipitação). 
As amostras que são negativas (não tem o 
antigeno) não formam arcos de precipitações. 
 Diagnóstico de: candidíase, 
paracoccidioidomicose, cisticercose. 
Limitação: 24 a 48h para difusão para que a 
preocupação ocorra. 
 
• Imunodifusão radial simples 
Criado por Mancini e Fahey em 1965. Pode ser 
chamado de método de Mancini e Fahey. 
O anticorpo é misturado ao ágar e a mistura é 
colocada em placa de petri de vidro. Antes de 
endurecer. 
Feito orifício no gel onde o antígeno será testado. 
Ocorre difusão do antígeno. Vai entrar no gel e 
vai encontrar com o anticorpo. Conforme isso vai 
acontecendo, vai criando a zona de equivalência. 
A difusão acontece até ser atingida a zona de 
equivalência. Precipitando-se em uma anel (halo) 
em torno do orifício. 
O diâmetro do halo de precipitado se correlaciona 
com a concentração do antígeno. 
Diluição serial do Ag padrão são colocados nos 
orifícios do ágar. O diâmetro vão diminuindo na 
placa conforme for diluindo. Faz isso para 
quantificar para quanto de antigeno tem. 
 
Diagnóstico de alguns fungos: 
Coccidioides immitis, paracoccidioides 
brasiliensis... 
 
• Reação de aglutinação 
Continua sendo utilizada. 
São exemplos de reações de aglutinação: para 
Salmonela, Brucela, Rickettsiae, Plasmodium, 
leismania, Toxoplasma, Candida, Aspergillus, 
Cryptococcus e Toxoplasmose. 
 
Coloca as hemácias primeiro e na sequência é 
colocado o soro da pessoa, que pode ter o 
anticorpo para o microrganismo ou não. 
Acontece com partículas maiores. 
Ac + Ag particulado = agregação visível de 
partículas (eritrócitos, bactérias, fungos, látex). 
Aglutinado = é o que forma com o Ac + Ag 
particulado. 
As células que vão se aglutinar, é colocado a 
amostra. 
Se na minha amostra tiver os anticorpos vão se 
grudar ao microrganismo. 
Se for negativo, o microrganismo vai para o 
fundo. Por isso, o poço é em V, impede de se 
espalhar pela placa, igual iria acontecer se for 
reto. 
Demora 2 horas para acontecer. 
Se for positivo, os anticorpos vão se ligar ao 
microrganismo. Não vão para o fundo do poço 
por conta que forma uma rede (aglutinado). 
 
 
• Aglutinação direta 
Partículas que apresentam determinantes 
antigênicos naturais em sua superfície. Exemplo: 
bactérias, protozoários, etc. 
Aglutinação direta: células ou partículas 
insolúveis + Ac = aglutinação. 
 
No tubo, é colocado o próprio microrganismo 
para a aglutinação. 
 
• Algutinação passiva ou indireta 
Se for uma sensibilização de um antígeno mas é 
uma hemácia ou uma bolinha de látex que tem os 
antígenos do microrganismos. É a aglutinação 
passiva ou indireta. 
 
 
 
 
 
• Inibição da aglutinação 
Com isso, o teste fica positivo. 
 
Teste de aglutinação: Urina + anti-hCG + 
partículas revestidas com hCG. 
Teste positivos: 
Urina com hormônio hCG + anti-hCG, o anticorpo 
hCG vai se ligar ao hormônio. Fica 1h 
acontecendo. Vai se precipitar. 
Em seguida, coloca a partícula revestida com 
hCG. Fica sobrando pois o anticorpo está ligado 
a outra coisa. 
Com isso, não se vê a aglutinação, pois o 
hormônio é pequeno. 
Resultado positivo: não se vê aglutinação. 
 
Teste negativo: 
Urina sem hormônio + anti-hCG. 
Quando coloca o anti-hCG, não vai acontecer 
nada. 
Quando coloca o hCG na hemácia, vai ter a 
aglutinação pois tem anticorpos sobrando. 
Ocorre aglutinação pois anticorpo anti-hCG não 
são bloqueados na incubação inicial porque não 
havia hormônio na urina. Livres, os anticorpos 
podem aglutinar as partículas. 
 
 
• Reação da fixação do complemento 
É a via clássica. 
Para diagnóstico de: Mycoplasma pneumoniae, 
leptospirose, doenças de Chagas, infecções por 
alguns vírus respiratórios (influenza A e B, 
parainfluenza, adenovírus, arbovírus). 
 
Teste positivo: 
Amostra com anticorpo,vão se ligar o anticorpo 
com o antígeno. 
Antígeno + proteínas do complemento 
Anticorpo da amostra se liga ao antígeno, vem as 
proteínas da via clássica. Vai romper a 
membrana por conta do MEK. 
Adiciona-se hemácias já revestidas com 
anticorpo anti-hemácia. O sistema complemento 
não vai agir com a hemácia, pois não vai ter mais 
anticorpos sobrando. 
Na amostra que contem anticorpos não ocorre 
hemólise. 
 
Teste negativo: 
Amostra sem anticorpo. 
Antígeno + proteínas do complemento. Não se 
gruda ao anticorpo, então está livre. 
Amostra sem anticorpos -> não há atividade do 
complemento 
Adiciona-se hemácias já revestidas com 
anticorpo anti-hemácia -> complemento se liga 
ao anticorpo ligado na hemácia. 
Amostra negativa com hemólise. 
 
 
ELISA 
Enzyme-linked immunosorbent assay ou ensaio 
imunoenzimático. 
 
É uma técnica imunoenzimática baseada na 
utilização de antígenos e anticorpos marcados 
com enzima e permitem: detecção, titulação, 
quantificação de substâncias de interesse 
biológico. 
O método se baseia na interação antígeno-
anticorpo 
Usado no diagnóstico de algumas doenças, como 
HIV ou parasitas. 
 
A enzima tem que ter ligada quimicamente a um 
anticorpo. 
A enzima são de dois tipos, que são a peroxidase 
e a fosfatase alcalina. 
 
 - O que é necessário 
Antígeno purificado (se for para detecção ou 
quantificação de anticorpo). 
Anticorpo purificado (se for para detecção ou 
quantificação de antígeno). 
Soluções-padrão (controles positivo e negativo). 
Placa de 96 poços. 
Anticorpo conjugado a uma enzima. 
Substrato da enzima. 
Leitor de ELISA. 
 
 - Tipos de ELISA 
Existem muitas variações, são comumente 
utilizados: 
Direto (sanduíche) para detectar antígenos que 
não sejam anticorpos 
Indireto para detecção de anticorpos. 
 
 
• Elisa direto 
Sensibilização: incubar a placa com anticorpo 
especifico. Anticorpo primário. 
Anticorpo anti o antígeno que estou procurando 
Após a sensibilização, é feito o bloqueio dos 
sítios reativos da placa. É feito com alta 
concentração de proteína (5 mg/ml). Exemplo: 
leite desnatado, albumina bovina, gelatina, soro 
fetal bovino, etc. 
Após o bloqueio, coloca a amostrada a ser 
testada, normalmente soro ou sobrenadante de 
cultura. 
Tudo que não for TNF vai cair. 
Lavar a placa e após a lavagem da placa, ficaram 
retidos a placa apenas proteinas ou 
glicoproteínas específicas para o anticorpo 
primário. 
Após isso, coloca outro anticorpo secundário 
para ligar no TNF. O anticorpo secundário fica 
ligado a uma enzima. 
Na sequência, vamos colocar o substrato, que 
cada enzima tem o seu. 
Quando coloca o substrato da enzima, temos a 
revelação, vai ter uma revelação, que bem pela 
degradação enzimática dá origem a produtos 
solúveis coloridos. Então, a placa muda de cor. 
O produto da reação será em forma de cor. 
 
Lavagens: 
São geralmente feitas com: 
Tampao fosfato (PBS) + 0,05% de Tween 20 
Serve para dissociar as ligações mais fracas, 
evita falsos positivos. 
 
• ELISA indireto 
Antígenos já bem caracterizados. 
Uso de uma proteína para forrar o fundo do poço. 
O plasma se tem o anticorpo sensibilizado, vai se 
ligar. 
Sensibilização com antigeno livre de impurezas. 
Incuba a placa com antigeno conhecido. 
Feita a sensibilização, faz a lavagem e em 
seguida é feita o bloqueio dos sítios reativos da 
placa. Exemplo: leite desnatado, albumina 
bovina, gelatina, soro fetal bovino, etc. 
Adicionar o soro ou sobrenadante de cultura o 
qual procura-se anticorpo específicos para o 
antígeno. 
No soro ou no sobrenadante de cultura podem 
conter diferentes anticorpos. 
Anticorpos de interesse ficam retidos no poço. 
O soro normalmente é do paciente. 
Lavar a placa para remover anticorpos 
inespecíficos. 
Adiciona um anticorpo (anti-anticorpo) já 
conjugado a enzima. 
Lavar a placa. 
Adicionar o substrato da enzima, vai revelar. Com 
isso, muda de cor. 
 
O objetivo do ensaio de ELISA é a quantificação 
ou verificação da presença de um antígeno ou 
anticorpo nas amostras biológicas. 
 
 - Vantagens 
Especificidade; 
Sensibilidade; 
Rapidez; 
Possibilidade de realizar vários testes de uma só 
vez. 
Quantos mais réplicas da amostras, fica mais 
confiável o resultado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Western Blotting 
Serve para detectar proteínas das células que 
fazem síntese proteica, como bactéria e célula 
cancerosa. 
Usado para identificar e determinar a quantidade 
relativa e o peso molecular de uma proteína em 
uma mistura de proteínas ou de outras 
moléculas. 
 
começa com o extraído proteico. Para isso, tem 
que fazer a identificação de proteína em lisado 
celular. 
O lisado é submetido a SDS-PAGE (gel) para 
separar as proteínas. 
SDS (sodium dodecyl sulfate): é um detergente – 
dodecol sulfato de sódio. 
PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis), é um 
gel de poliacrilamida 
Com o SDS-PAGE determina o peso molecular 
de uma proteína e separa as proteinas por 
tamanho molecular, pelo sistema SDS-PAGE. 
O gel é despejado no meio de duas placas de 
vidro. O vidro é separado por espaçadores. O gel 
é colocado em um casting stand, com o gel 
líquido, coloca pentes (plastic combs) que serve 
para pipetar as amostras. Espera secar e colocar 
em outro suporte, os fios é ligado a maquina. Faz 
a carga e faz as proteínas que tem carga descer 
no gel. 
O SDS-PAGE permite a separação baseada na 
filtração molecular da proteína na peneira 
formada pelo polímero entrecruzado de 
acrilamida, separa as proteínas por tamanho. 
As proteínas maiores ficam maiores, as proteínas 
médias ficam no meio e as menores ficam no 
fundo. Isso acontece por conta da eletrophoresis. 
 
- SDS-PAGE – curva padrão 
Proteínas com peso molecular conhecido 
(compra tubinho de proteína, tem miosina, beta-
galactosidase...) 
A porosidade do gel depende da concentração de 
acrilamida. Mais acrilamida fica mais compacta, 
menos acrilamida fica mais frouxa. 
A concentração do gel deve ser apropriada ao 
tamanho do fragmento de interesse. 
Usar gel muito frouxo para uma proteína leve, ela 
vai sair. Por isso, é bom saber o peso da 
proteína. 
 
- Método de detecção/visualização 
É imunológico. 
Detecção intermediada por um anticorpo. 
Proteínas separadas por tamanho no gel, são 
transferidas para uma membrana de nitrocelulose 
por eletroforese. 
Coloca no meio líquido um anticorpo monoclonal 
que é anti-BCL2 (proteína procurada). 
Foi colocado o câncer, colocou no gel, separou 
as proteínas. É transferido pela membrana de 
nitrocelulose, tem que colocar o anticorpo 
monoclonal anti-BCL2. Se a membrana tiver a 
proteína, o anticorpo faz uma mancha preta (se 
ligou). 
Na membrana, as proteínas específicas podem 
ser detectadas por anticorpos de interesse. 
A proteína é inserida na membrana. 
Quando não tem enzima, coloca um anticorpo 
anti-anticorpo que tem a enzima. Joga o 
substrato da enzima, reage a enzima do 
anticorpo e a banda é revelada. 
 
• Teste de HIV 
O Western Blotting é uma variação da técnica 
para detectar presença de anticorpo anti-HIV em 
soro de pacientes, então faz o teste do HIV. 
Uma mistura definida de proteínas do HIV é 
separada por SDS-PAGE e transferidas para 
uma membrana. 
A membrana é incubada com soro do paciente. 
A membrana é entao analisada com um segundo 
anticorpo anti-anticorpo humano conjugado com 
uma enzima (gruda na membrana). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Citometria de fluxo 
Pode ser definida como metodologia, tecnologia 
e/ou ferramenta direcionada ao estudo de 
células. 
 
É utilizada na: 
Identificação, avaliação e diferenciação. 
Pode ser feita diversas características celulares 
como: conteúdo de DNA e RNA, receptores de 
superfície, produção de citocinas e de apoptose. 
 
A citometria de fluxo também é utilizada para 
contar, examinar e classificar partículas 
microscópicas (células) suspensas em meio 
líquidoem fluxo. 
A técnica depende da utilização de um citometro 
de fluxo. 
 
Baseia-se na detecção de substâncias 
fluorescentes (fluorocromos), geralmente, 
acoplados a anticorpos. 
Fluocromos emitem um comprimento de onda 
luminosa, o aparelho detecta isso. 
O citometro purifica uma solução heterogênea de 
celula (Cell Sorting) 
 
Princípio básico: emprego de uma radiação laser 
direcionada que excita os fluorocromos. 
Os fluorocromos ao serem excitados pelo laser, 
emitem luz, que dependendo do comprimento de 
onda, possuem uma cor característica. 
Assim, pode-se pesquisar informações 
biológicas, moleculares e/ou bioquímicas das 
células em suspensão. 
 
Citometro coleta, filtra e convertem em pulso 
elétricos. É mandado por um sistema 
computacional que fazem gráficos. 
A passagem é feita por uma célula por vez, logo, 
as células de uma amostra em suspensão são 
caracterizadas individualmente. 
A flow cell alinha as células, o laser ao inceptar 
as células, a luz é desviada para os detectores e 
dá para citar algumas coisas da célula. 
Dependendo do citometro e da amostra, o fluxo 
pode ser de 10 células por segundo a 10.000 
células por segundo. 
 
Como as células alteram o feixe de laser que 
incide sobre elas? 
Uma parte do feixe é desviada levemente pela 
célula. 
A luz desviada atinge o detector Forward Scatter 
(FSC) ou dispersão frontal. 
Uma parte de feixe é desviada fortemente pela 
célula. 
Essa luz desviada atinge os detectores Side 
Scatter (SSC) ou dispersão lateral. 
 
 - FSC 
O dado gerado a partir do detector FSC fornece 
informações sobre o tamanho da célula. 
Quando o laser incide, sem a célula, não teve 
desvio. 
Porém, quando tem uma célula, o laser a atinge, 
o laser desvia e determina a membrana 
plasmática da célula. 
Uma celula um pouco maior, quando o laser 
atinge, o laser é desviado de maneira maior. 
 
 - SSC 
O dado gerado a partir do detector SSC fornece 
informações sobre o granulosidade da célula. 
Quando a luz do laser atinge a célula, o laser vai 
determinar o tamanho da célula e vai encontrar 
os grânulos e as organelas, por exemplo. Cada 
coisa que a luz encontra, faz ter um desvio da 
luz. Vai nos dar a informação da granulosidade 
da célula. 
Sem célula, o laser passa direto. 
Quando temos uma célula, o laser a atinge e tem 
um leve desvio da luz. 
Uma célula com mais grânulos, o laser atinge, e 
vamos possuiu um desvio mais o forte de luz. 
 
 - Gráfico de tamanho por 
granulosidade 
É um gráfico de pontos. Cada ponto é uma 
célula. 
Quanto mais para cima a célula está, mais 
granulosa. Quanto mais para a direita, maior é a 
célula. 
 
 
 
 - populações diferentes/dot plots 
diferentes 
População de tamanho e complexidade 
parecidos não podem ser diferenciadas apenas 
pela análise de FSC x SSC 
Como então diferenciar células por parâmetros 
mais específicos do que tamanho e 
granulosidade? Para isso, é usado a 
fluorescência (FACS, fluorescence-Activated cell 
Sorter) 
 
É comum a associação de fluorocromos a 
moléculas de anticorpo. 
União da especificidade do anticorpo com a 
utilidade do fluorocromo. 
 
• Flurocromos 
Os flurocromos estão incialmente em repouso, 
excitados por uma fonte luminosa (laser) e 
emitem uma luz de comprimento de onda (cor) 
característica. 
A maioria dos fluorocromos é excitada por um 
laser argônio. 
Produz uma luz azul de 488nm, presentes em 
todos os citometros. 
Outros fluorocromos são excitados por outros 
comprimentos de onda. Algumas citometros tem 
mais de um laser. 
Laser violeta-azul: 405 nm; 
Laser hélio-neônio: 633 nm; 
Laser UV: 355 nm. 
Espectro de comprimento de onda de excitação e 
de emissão do FITC. 
O FITC é excitado por 488 nm de excitação e 525 
nm de emissão. 
O laser argônio excita o FITC e emite outro 
comprimento de onda, a luz é ver. O FITC tem 
um raio de 525 nm de emissão. 
FITC: isotiocianato de fluoresceína. 
Os fluorocromo são essencialmentes compostos 
fluorescentes, que absorvem uma energia 
luminosa em um determinado comprimento de 
onda e emitem luz num comprimento de onda 
maior. Esses dois processos são chamados de 
excitação e emissão, respectivamente. 
 
Mais de um anticorpo pode ser usado na 
marcação para citometria. 
Conhecendo as propriedades de excitação e de 
emissão de cada fluorocromo é possível escolher 
combinações de anticorpo monoclonais a serem 
usadas em conjunto. 
No caso da marcação ser feita com mais de um 
anticorpo monoclonal, deve-se tomar cuidado 
para não escolher fluorocromos cujos 
comprimentos de onda se sobreponham. 
Por exemplo: 
AntiCD4-FITC, antiCD8-PE, antiCD3-PercP em 
um citometro que tenha detectores capazes de 
captar comprimentos de onda de 525 nm, 578nm, 
675nm, respectivamente. 
 
Dá para fazer imunofenotipagem por citometria 
de fluxo. Nós diz quantas células tem o antigeno 
no tempo determinado. 
Não vê a molécula em si, mas o flurocromo indica 
se eles se ligaram. 
 
*colocar imagem* 
 
Um gráfico de dot plot fala a população geral e 
não quais são exatamente as células. 
Populações de tamanho e complexidade 
parecidos não podem ser diferenciadas apenas 
pelas análises de FSC x SSC. 
Como então diferenciar células por parâmetros 
mais específicos do que tamanho e 
granulosidade? 
É comum a associação de fluorocromos a 
moléculas de anticorpo. União da especificidade 
do anticorpo com, a utilidade do fluorocromo. 
Assim, consegue fazer a diferenciação. 
 
 - Combinando os fluorocromos 
 
Os fluorocromos quando excitamos pelo mesmo 
composto, vão emitir comprimentos de ondas 
diferentes e a cor também é diferente. Mas 
alguns emitem a mesma cor, então não pode 
usar na amostra os dois juntos. 
Quanto os anticorpos é jogado junto com as 
células, vão se ligar conforme as células tem as 
moléculas do anticorpo. 
Cada célula é divida no gráfico, então cada uma 
tem um compartimento. 
 
- Imunofenotipagem por citometria de 
fluxo 
A citometria de fluxo vai ler as células, vai passar 
as informações pelo computador e vai formar o 
gráfico com as células espalhadas. 
As células T não tem CD8 e CD4, só vão ter no 
timo os dois quando estão maturando ainda. 
Ambas as células T tem CD3. Para ver qual 
célula expressa o determinada CD. Com isso, é 
colocado o Anti-CD4 FITC, Anti-CD3 PerCP e 
anti-CD8 APC. 
A células com CD4 e 3 vão ter o anti-CD4 e CD3. 
As células TCD8+ vai ter o anti-CD3 e anti-CD*. 
O gráfico vai separar cada conjunto de células. A 
região de simples negativo está vazio porque 
esta na região de duplo positivo, porque dentro 
as célula T não tem nenhuma que não tem o 
CD3. 
O gráfico de CD8, o duplo positivo é porque tem 
as CD8 e CD3. O CD4- é porque a célula não 
tem essa molécula. 
Célula B fica no canto inferior. 
A região simples negativo, tem CD3 mas não tem 
CD8. É a célula T auxiliares. 
 
 
 
 
 
 
Fluorocromos pode não ser associados a 
anticorpos monoclonais. Um exemplo é para ver 
cálcio e DNA. O corante se adere a parte protéica 
da célula e no meio de cultura, vai se dividindo, e 
o corante vai ser diminuindo conforme a célula 
sofreu mitose, uso de fluorocromo na célula. 
 
 - Tipos de gráficos em citometria 
Pode ser dot plot (gráfico de ponto) e histograma. 
No dot plot pode ser FSC-H, que não tem 
fluorocromo, então é preto os pontos. 
Pode ser delimitado por diferenciação de 
diferentes células. São vários parâmetros. 
 
O gráfico de histograma vê um parâmetro por 
vez. É só um parâmetro. Pode sobrepor um 
gráfico sobre o outro para comparar. 
 
 
 
 
• Histograma 
Para representar a relação entre: fluorescência e 
número de células. 
Quanto maior o meu pico mais células temos, 
quanto mais deslocado para a esquerda mais 
fluorescência vamos ter. 
A representação de 10ˆ0 a 10ˆ1 normalmente são 
as células que não foram marcadas. Para saber 
onde é a limitação, é usado um citometrode fluxo 
em branco não marcado com a fluorescência 
para saber qual é o limite das células não 
marcadas. 
Normalmente, é colocado o pico das células não 
marcadas no 10ˆ1 para esquerda, caso tenhamos 
células passando para a direita, pois elas tem um 
pouco de fluorescia, é considerado o que é 
positivo dali da célula não marcada, do pico da 
celula não marcada, quando fazer a análise onde 
terminou a autofluorescência das células que não 
estavam marcadas. 
Pico negativo para a fluorescência que estamos 
olhando e pico positivo para a fluorescência que 
colocamos. 
 
 
Se fizermos uma análise de células B e T, elas 
vão ficar idênticas no gráfico, para diferenciar as 
duas células, é usado um anticorpo multiclonal 
com fluorescência (anti-IgM). 
O anticorpo vai se ligar onde tem o IgM que é na 
célula B, então só vai se ligar na célula B. 
O pico se direcionado para a direita indica que as 
células tem o IgM e o pico se deslocando para a 
esquerda, mostrando que as células T não tem 
IgM. São para células purificas (todas as células 
separadas), se estivem juntas, estariam os dois 
gráficos juntos. 
 
 
Quanto maior o pico, mais células temos. 
Quanto mais o pico se desloca para a esquerda, 
menor é a fluorescência. 
Quanto mais o pico se desloca para a direita 
maior é a fluorescência. 
Cada célula pode ter diferentes níveis de 
fluorescência. 
Pode acontecer que a célula tenha o marcado 
mas não tem tanto, diferente de outra célula pode 
ter mais marcado. Assim, a célula com mais 
anticorpos grudado, mais fluorescência ela vai 
apresentar (se desloca mais para a direita). 
 
A partir de Gates, pode-se determinar a 
intensidade de fluorescência somente das células 
situadas em determinadas regiões. 
 
• Aplicação de Sorting 
Citometros que permitem a separação de 
populações de células puras e homogêneas, a 
partir de uma amostra heterogênea. 
Extração proteica de todas as células e dá para 
separar em tubos. 
Fazemos as marcações, colocamos no citometro 
e vamos adaptar o citometro para carregar a 
membrana da célula CD4 com íons positivo, a 
membrana fica positiva. A célula marcada com 
CD8, carrega a célula com íons negativos, célula 
carregada negativa. 
Feito isso, dentro do citometro, vamos ter placas 
defletoras. Uma é negativa e a outra é positiva. A 
placa defletora negativa vai atrair a célula que 
estão marcadas positivas (CD4). A placa 
defletora atrai as marcadas negativamente 
(CD8). Com isso, a coleta das células em tubos 
diferentes. As células não marcadas são 
descartadas. 
Com isso, temos a purificação das células. 
 
Com boas perguntas e boas ferramentas, é 
possível, pela citometria de fluxo, identificar em 
uma população celular heterógena: pelo 
tamanho, complexidade, fenótipo, viabilidade, 
ativação, funcionalidade. Dá para citocinas que 
as células secretaram.