Biologia Molecular - Western Blot

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Western Blot Western Blot 
A precipitação automatizada é considerada
uma técnica híbrida em razão de mesclar
características do método marcado e do
método não marcado: a mesma não faz uso
de reagentes marcados, mas a
automatização da leitura permite que
apresente uma elevada sensibilidade.
Testes sorológicos ouTestes sorológicos ou
Imunoensaios (IE)Imunoensaios (IE)
Técnicas utilizadas para detectar e quantificar 
 antígenos e anticorpos, ou outras substâncias
que desempenhem o papel de antígeno no
ensaio, tais como fármacos, hormônios, ácidos 
 nucleicos, citocinas, receptores de células etc.
Os reagentes dos imunoensaios podem ser de duas
naturezas:
Reagentes marcados: Os reagentes marcados são
utilizados para que seja evitada a possibilidade de um
resultado falso negativo, pois os mesmos amplificam o
sinal da amostra, o que facilita a leitura/identificação
da molécula de interesse. Além de amplificar o sinal, os
reagentes marcados também conferem maior
sensibilidade ao método, fazendo com que ele seja
capaz de detectar como positivas concentrações muito
baixas da substância de interesse. Basicamente, os
reagentes podem ser marcados por meio de
substâncias radioativas (radioimuno-ensaio),
quimioluminescentes (quimioluminescência),
fluorescentes (imunofluorescência) e enzimáticas.
Reagentes não marcados: haverá uma menor
sensibilidade no método efetuado com o uso de um
reagente não marcado, sendo necessário, nesse caso,
que haja uma formação de imunocomplexos em
grande quantidade para que seja possível visualizar a
reação. Em outras palavras, é necessário que a amostra
contenha um grande número de antígenos ou de
anticorpos para que seja formada uma quantidade de
imunocomplexos grande o bastante para que seja
possível identificar a positividade da reação. Um
exemplo de reação de imunoensaio com reagente não
marcado consiste no método de precipitação não
automatizada.
Técnicas imunoenzimáticasTécnicas imunoenzimáticas
ou enzimaimunoensaio (EIA):ou enzimaimunoensaio (EIA):
São efetuadas por meio da utilização de antígenos
ou anticorpos marcados com enzimas para
amplificar o sinal da reação. Essas técnicas podem
ser utilizadas para três finalidades:
Detecção: a detecção consiste em um método 
 qualitativo que visa verificar se a presença do
material de interesse é positiva ou negativa. Nesse caso
a leitura normalmente é realizada de forma visual.
Titulação: consiste em um método quantitativo que,
através de diluições seriadas da amostra de interesse,
permite que seja verificado até qual grau de diluição
mantém-se o resultado positivo.
Quantificação: refere-se à detecção quantitativa em
relação à presença ou ausência do antígeno ou
anticorpo, sendo essa análise realizada por meio do
espectrofotômetro.
Cabe apontar que a enzima utilizada no
enzimaimunoensaio formará com seu
substrato o que se denomina como
“conjugado”. Para que se possa garantir a
eficiência do conjugado é necessário analisar
alguns aspectos importantes, como o
processo empregado para a realização da
conjugação, a qualidade/especificidade do
anticorpo ou antígeno a ser pesquisado e da
enzima utilizada.
Obs.: o enzimaimunoensaio homogêneo é utilizado
principalmente em relação a moléculas menores,
denominadas haptenos.
Obs.: o enzimaimunoensaio heterogêneo é
utilizado em relação a moléculas maiores, como
antígenos, anticorpos e proteínas.
Os métodos imunoenzimáticos têm grande destaque
no laboratório clínico, pois permitem que haja uma
elevada sensibilidade, comparável à do
radioimunoensaio. Ademais, apresentam as vantagens
de utilizarem reagentes estáveis, não exigem o
trabalho com radioisótopos e podem ser adaptados
tanto a testes simples (como a leitura qualitativa
visual) quanto à automação (como a leitura
quantitativa).
Ainda no que se refere às técnicas imunoenzimáticas, é
importante destacar que estas podem ser divididas em
dois subgrupos:
Homogêneas: não há necessidade de separação
(lavagem) dos imunocomplexos formados e dos não
formados, pois é a interação Ag-Ac que modula a
atividade da enzima.
Heterogêneas: há a necessidade de separação
(lavagem) dos imunocomplexos formados e dos não
formados, pois a atividade da enzima não é alterada
pela interação Ag-Ac.
Western BlotWestern Blot
O método Western Blot, também denominado
como Immunoblotting ou Western Blotting, é
utilizado, basicamente, para a pesquisa de
proteínas e glicoproteínas, diferente do Southern
e Northern Blotting, que se referem, 
 respectivamente, � identiFIcação de DNA e 
 RNA (ácidos nucleicos).
É realizada uma eletroforese em gel de poliacrilamida
do material a ser pesquisado, isto é, da amostra das
proteínas e glicoproteínas;
Obs.: cabe lembrar que para a realização da
eletroforese de proteínas é necessária a utilização de
um tampão. No caso do método Western Blot, deve-se
utilizar um tampão de sDs, que possui a 
 característica de carregar as moléculas de forma 
 negativa. Nesse sentido, as proteínas e 
 glicoproteínas ficarão carregadas negativamente e,
posteriormente, migrarão do polo negativo para o polo
positivo.
Havendo enzimas solúveis na reação
estaremos diante de uma vertente em que
se enquadra o método ELISA. Por outro
lado, o método Western Blot faz uso de
enzimas insolúveis, de modo que perante a
utilização desse tipo de técnica não haverá
apresentação de uma solução corada após
a conclusão da reação, e sim de uma banda
corada
Vale destacar que o polo positivo para o
qual as moléculas negativamente
carregadas (ânions) desejam se deslocar
também é denominado como “anodo”. Por
sua vez, o polo negativo também é
chamado de “cátodo”.
A mistura de antígenos proteicos, ou seja, a amostra a
ser analisada, é aplicada no polo negativo do tampão;
A mistura migrará em direção ao polo positivo, se
separando por peso molecular. Assim, quanto maior o
peso molecular ou o tamanho da molécula, menor será
sua migração, mantendo-se próxima ao ponto de
aplicação;
A etapa de transferência do gel para uma membrana
de nitrocelulose é realizada;
Realizada a transferência, a membrana de
nitrocelulose é imersa em solução que contenha os
anticorpos (Ac) específicos para as frações;
A reação antígeno-anticorpo acontece;
Uma solução contendo anti-imunoglobutina marcada
com enzima é adicionada, bem como o substrato;
Ocorre a oxidação do cromógeno pela reação entre a
enzima e o substrato;
Como resultado é apresentado um precipitado
(INsolúvel) colorido
É importante destacar que por meio do método Western
Blot é possível que tanto proteínas individuais como
misturas complexas de proteínas que se separam e se
transformam em proteínas individuais sejam detectadas
e analisadas. Além disso, cabe ressaltar que o Western
Blot é, via de regra, um método qualitativo: o
aparecimento de uma banda em um blot indica a
presença de um antígeno na mistura que foi submetida
à eletroforese ou de um anticorpo na amostra ensaiada
na membrana.
Lembre-se que o imunoensaio é 
 considerado uma técnica específica 
 devido ao fato de apresentar a
especificidade própria de uma reação entre
antígeno e anticorpo. Quanto � sua
sensibilidade, esta dependerá de 
 algumas características específicas, como 
o uso de reagentes marcados ou não
marcados, o que tornará a técnica mais ou
menos sensível.
Perceba que a técnica Western Blot permite
que duas espécies de pesquisa sejam
realizadas: a de antígenos (Ag),
submetendo-se o antígeno da amostra à
eletroforese de proteínas; e a de anticorpos
(Ac), submetendo-se a mistura de
antígenos conhecidos à eletroforese de
proteínas e, no passo de imersão da
membrana de nitrocelulose na solução com
os anticorpos, devendo-se utilizar os
anticorpos presentes na amostra em
questão. Em suma, são duas as formas
existentes para se trabalhar com o Western
Blot: a amostra pode se referir àquela que
foi submetida à separação de proteínasou
à solução contendo os anticorpos a serem
pesquisados na qual a membrana de
nitrocelulose será imersa.
Assim como ocorre em relação ao ELISA, a peroxidase é
a enzima mais utilizada no método Western Blot,
podendo esta ser substituída pela fosfatase alcalina
quando a amostra apresentar natureza/ação de 
 peroxidase. Ademais, podem ser utilizadas também 
 a β-galactosidase e a glicose oxidase.
Uma das principais vantagens em relação ao Western
Blot refere-se ao fato de este ser um método que
mescla a seletividade da Eletroforese de proteína, que
permite uma separação efetiva das bandas das
proteínas presentes em determinado material, com a 
 especificidade do imunoensaio.
Por fim, cabe apontar que o Western Blot é um método
muito utilizado para o diagnóstico confirmatório do HIV,
sendo realizado após o resultado positivo em um ELISA.
Basicamente, a confirmação é realizada da seguinte 
 maneira: as proteínas e glicoproteínas do vírus HIV
são adicionadas à membrana de nitrocelulose,
submetendo-se esse material à eletroforese. Como
resultado haverá a formação de uma amostra
padronizada/controle, representada pela segunda tira
da ilustração apresentada abaixo:
Em seguida é inserida a amostra do paciente a fim de
se verificar se esta possui anticorpos contra as
proteínas ou glicoproteínas presentes na amostra-
controle.
O resultado do teste será positivo quando o paciente
apresentar a produção de anticorpos para as
glicoproteínas GP160 ou GP120, para a GP14 e para a
proteína P4.
Obs.: conforme indica a imagem, o número
apresentado após a sigla que indica o material como
proteína (P) ou glicoproteína (GP), refere-se ao seu
peso molecular.
Vale destacar, ainda, que com os conjugados
enzimáticos podem-se empregar vários sistemas de
amplificação do sinal da reação, como a avidina-
biotina. Quanto � detecção da amostra, além dos
substratos que dão produtos coloridos, podem-se
utilizar outros sistemas, com substratos fluorescentes
ou luminescentes, que permitem a quantificação das
bandas.
Devido ao fato de poder ser empregado na pesquisa de
Ag ou de Ac, o Western Blot vem sendo um importante
auxiliar no diagnóstico de doenças infecciosas.
Abaixo, é apresentada uma figura que esquematiza o
funcionamento do Western Blot:
Conforme o esquema, cada banda presente na
membrana de nitrocelulose em que foi realizada a
eletroforese das proteínas pode ser considerada uma
proteína-alvo. Ao se realizar a pesquisa de anticorpos
no soro do paciente, por exemplo, a membrana de
nitrocelulose contendo os antígenos e proteínas será
imersa no soro do paciente, que fará as vias do
anticorpo primário, ligando-se à proteína-alvo.
Posteriormente, será inserido o anticorpo secundário,
marcado com o conjugado (enzima + substrato), a
partir do qual será obtido um sinal colorimétrico ou
quiminulescente, a depender do tipo de ensaio.