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Brasília-DF. Bactéria e MicoBactéria Elaboração Amanda Piovesan Ucci Produção Equipe Técnica de Avaliação, Revisão Linguística e Editoração Sumário APRESENTAÇÃO ................................................................................................................................. 4 ORGANIZAÇÃO DO CADERNO DE ESTUDOS E PESQUISA .................................................................... 5 INTRODUÇÃO.................................................................................................................................... 7 UNIDADE I ESTRUTURA E FISIOLOGIA BACTERIANA ................................................................................................. 11 CAPÍTULO 1 DIFERENÇAS ENTRE CÉLULAS PROCARIÓTICAS E EUCARIÓTICAS ............................................. 11 CAPÍTULO 2 MORFOLOGIA BACTERIANA ................................................................................................... 14 CAPÍTULO 3 GENÉTICA BACTERIANA .......................................................................................................... 17 CAPÍTULO 4 BACTÉRIAS GRAM POSITIVAS E GRAM NEGATIVAS ................................................................... 21 CAPÍTULO 5 FATORES DE VIRULÊNCIA ........................................................................................................ 24 CAPÍTULO 6 FATORES NECESSÁRIOS AO CRESCIMENTO BACTERIANO: FÍSICOS, QUÍMICOS ........................ 27 CAPÍTULO 7 REPRODUÇÃO BACTERIANA ................................................................................................... 31 CAPÍTULO 8 CURVA DE CRESCIMENTO BACTERIANO ................................................................................. 34 CAPÍTULO 9 METABOLISMO BACTERIANO ................................................................................................... 37 UNIDADE II BACTÉRIAS DE INTERESSE CLÍNICO E DIAGNÓSTICO ............................................................................. 40 CAPÍTULO 1 ENTEROBACTERIACEAE........................................................................................................... 40 CAPÍTULO 2 ESTAFILOCOCOS ................................................................................................................... 43 CAPÍTULO 3 ESTREPTOCOCOS................................................................................................................... 46 UNIDADE III CARACTERÍSTICAS ESTRUTURAIS DA MICOBACTERIUM ........................................................................... 49 CAPÍTULO 1 ESTRUTURA E MORFOLOGIA ................................................................................................... 49 CAPÍTULO 2 PANORAMA HISTÓRICO .......................................................................................................... 52 CAPÍTULO 3 CLASSIFICAÇÃO DAS MICOBACTÉRIAS ................................................................................... 55 UNIDADE IV DIAGNÓSTICO LABORATORIAL ............................................................................................................. 58 CAPÍTULO 1 COLETA DO MATERIAL BIOLÓGICO ........................................................................................ 58 CAPÍTULO 2 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS ......................................................................................... 61 CAPÍTULO 3 BACILOSCOPIA, CULTURA DO MATERIAL BIOLÓGICO E TESTES BIOQUÍMICOS PARA IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA ................................................................................................. 64 UNIDADE V PRINCIPAIS MICOBACTÉRIAS DE INTERESSE CLÍNICO............................................................................. 67 CAPÍTULO 1 MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ........................................................................................... 67 CAPÍTULO 2 MYCOBACTERIUM LEPRAE ...................................................................................................... 72 CAPÍTULO 3 MICOBACTÉRIAS ATÍPICAS ...................................................................................................... 75 PARA (NÃO) FINALIZAR ..................................................................................................................... 78 REFERÊNCIAS .................................................................................................................................. 80 5 Apresentação Caro aluno A proposta editorial deste Caderno de Estudos e Pesquisa reúne elementos que se entendem necessários para o desenvolvimento do estudo com segurança e qualidade. Caracteriza-se pela atualidade, dinâmica e pertinência de seu conteúdo, bem como pela interatividade e modernidade de sua estrutura formal, adequadas à metodologia da Educação a Distância – EaD. Pretende-se, com este material, levá-lo à reflexão e à compreensão da pluralidade dos conhecimentos a serem oferecidos, possibilitando-lhe ampliar conceitos específicos da área e atuar de forma competente e conscienciosa, como convém ao profissional que busca a formação continuada para vencer os desafios que a evolução científico-tecnológica impõe ao mundo contemporâneo. Elaborou-se a presente publicação com a intenção de torná-la subsídio valioso, de modo a facilitar sua caminhada na trajetória a ser percorrida tanto na vida pessoal quanto na profissional. Utilize-a como instrumento para seu sucesso na carreira. Conselho Editorial 6 Organização do Caderno de Estudos e Pesquisa Para facilitar seu estudo, os conteúdos são organizados em unidades, subdivididas em capítulos, de forma didática, objetiva e coerente. Eles serão abordados por meio de textos básicos, com questões para reflexão, entre outros recursos editoriais que visam a tornar sua leitura mais agradável. Ao final, serão indicadas, também, fontes de consulta, para aprofundar os estudos com leituras e pesquisas complementares. A seguir, uma breve descrição dos ícones utilizados na organização dos Cadernos de Estudos e Pesquisa. Provocação Textos que buscam instigar o aluno a refletir sobre determinado assunto antes mesmo de iniciar sua leitura ou após algum trecho pertinente para o autor conteudista. Para refletir Questões inseridas no decorrer do estudo a fim de que o aluno faça uma pausa e reflita sobre o conteúdo estudado ou temas que o ajudem em seu raciocínio. É importante que ele verifique seus conhecimentos, suas experiências e seus sentimentos. As reflexões são o ponto de partida para a construção de suas conclusões. Sugestão de estudo complementar Sugestões de leituras adicionais, filmes e sites para aprofundamento do estudo, discussões em fóruns ou encontros presenciais quando for o caso. Praticando Sugestão de atividades, no decorrer das leituras, com o objetivo didático de fortalecer o processo de aprendizagem do aluno. 7 Atenção Chamadas para alertar detalhes/tópicos importantes que contribuam para a síntese/conclusão do assunto abordado. Saiba mais Informações complementares para elucidar a construção das sínteses/conclusões sobre o assunto abordado. Sintetizando Trecho que busca resumir informações relevantes do conteúdo, facilitando o entendimento pelo aluno sobre trechos mais complexos. Para (não) finalizar Texto integrador, ao final do módulo, que motiva o aluno a continuar a aprendizagem ou estimula ponderações complementares sobre o módulo estudado. 8 Introdução Você sabia que bacteriologia é a ciência que estuda todos os aspectos relacionados às bactérias? Quando nos referimos a um organismo, utilizamos um sistema de nomenclatura científica que foi estabelecido em 1735,─ por Carolus Linnaeus.Assim, os nomes científicos além de serem escritos em latim, cada organismo recebe dois nomes: o primeiro nome é referente ao gênero, iniciado em letra maiúscula e, o segundo é referente ao nome de espécie, escrito sempre em letra minúscula. O organismo, portanto, é designado por ambos os nomes, os quais são escritos em itálico ou sublinhados. Esses nomes podem homenagear alguém (um pesquisador, por exemplo), podem estar relacionados com hábitos ou fenótipos dos organismos, entre outros. Os organismos são classificados em categorias de acordo com o grau de similaridade entre eles. Acima do nível de reino, existe uma classificação denominada domínio ─ baseada no tipo celular do organismo de acordo com a sequência de nucleotídeos encontrada no RNA ribossômico (rRNA). Além destas diferenças, os domínios se diferem na estrutura lipídica da membrana celular, moléculas de RNA de transferência e na sensibilidade aos antibióticos (TORTORA et al, 2012). Deste modo, os domínios são: » Eukarya: inclui o reino dos animais, plantas, fungos e protistas; » Bacteria: inclui os procariotos patogênicos e não patogênicos; » Archaea: inclui os procariotos sem peptideoglicana na parede celular. Frequentemente vivem em ambientes extremos e realizam processos metabólicos incomuns (grupo dos metanógenos, halofitos extremos e hipertermófilos) As bactérias são organismos que possuem uma grande diversidade. Sem as bactérias, a maior parte da vida (como a conhecemos hoje) não seria possível. Elas possuem grande importância no campo da medicina, por exemplo, e apenas algumas espécies são causadoras de doenças. Justamente por serem encontradas por toda parte (ar, água, solo e animais) existem muitas espécies que não são maléficas e desempenham papéis importantes na vida. 9 As bactérias úteis ao ser humano são utilizadas durante a preparação de iogurtes, queijos, bebidas fermentadas, molhos etc. No caso de seres humanos, a maioria das bactérias patogênicas podem ser combatidas com o uso de antibióticos, quando usados conforme orientação médica. Caso contrário elas podem aumentar rapidamente e serem transferidas de pessoas a pessoas. Até 300 anos atrás, ninguém sabia da existência deste tipo de vida. Foi um holandês chamado Leeuwenhoek que as observou pela primeira vez. Em 1865, Louis Pasteur, por meio de seus estudos e observações, descobriu como elas se multiplicam e causam doenças. Contudo, os estudos desta forma de vida só foram mais precisos depois que Roberto Koch, em 1870, mencionou a descoberta de bacilos e conseguiu cultiva-lo fora do corpo humano. Estes fatos permitiram um conhecimento mais completo e aprofundado deste tipo de vida. Principais doenças causadas por bactérias: » Tuberculose: causada pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis. » Hanseníase (lepra): transmitida pelo bacilo de Hansen (Mycobacterium leprae). » Difteria: provocada pelo bacilo diftérico. » Coqueluche: causada pela bactéria Bordetella pertussis. » Pneumonia bacteriana: provocada pela bactéria Streptococcus pneumoniae. » Escarlatina: provocada pelo Streptococcus pyogenes. » Tétano: causado pelo bacilo do tétano (Clostridium tetani). » Leptospirose: causada pela Leptospira interrogans. » Tracoma: provocada pela Chlamydia trachomatis. » Gonorreia ou blenorragia: causada por uma bactéria, o gonococo (Neisseria gonorrhoeae). » Sífilis: provocada pela bactéria Treponema pallidum. 10 » Meningite meningocócica: causada por uma bactéria chamada de meningococo. » Cólera: doença causada pela bactéria Vibrio cholerae, o vibrião colérico. » Febre tifoide: causada pela Salmonella typhi. Você sabe como o desodorante elimina o odor da transpiração? Impedindo que as bactérias se alimentem das substâncias orgânicas geradas pela transpiração. A maioria dos desodorantes possuem antimicrobianos que impedem o desenvolvimento de bactérias, eliminando o cheiro de suor. Objetivos » Conhecer os princípios da microbiologia clinica. » Entender os principais grupos de bactérias e micobactérias. » Conhecer as estruturas morfológicas dos principais grupos de bactérias e micobactérias de importância clínica. » Analisar amostras biológicas. 11 UNIDADE IESTRUTURA E FISIOLOGIA BACTERIANA CAPÍTULO 1 Diferenças entre células procarióticas e eucarióticas As células procarióticas não possuem organelas envolvidas por membrana. Todas as bactérias possuem citoplasmas, ribossomos, uma membrana plasmática e um nucleoide. A maioria das bactérias possui paredes celulares. O universo biológico consiste em dois tipos de células: procarióticas e eucarióticas. Como citado anteriormente, os eucariotos compreendem o reino dos animais, plantas, fungos e dos protistas. Os seres procariotos incluem Archaea e Bacteria (que são, por sua vez, divididos em filos). Os procariotos e os eucariotos são quimicamente similares. Ambas possuem ácidos nucleicos, proteínas, lipídeos e carboidratos e usam os mesmos tipos de reações químicas para metabolizar o alimento, formar proteínas e armazenar energia (TORTORA et al, 2012). No entanto, elas diferem em vários aspectos. As principais diferenças entre células procarióticas e células eucarióticas são: Células procarióticas As células procarióticas bacterianas são envolvidas por uma parede celular composta praticamente por um complexo de carboidrato e proteína chamado de peptideoglicano. Este é um composto que confere forma e proteção à célula. Intervenções provocadas na atividade da célula bacteriana, como a morte de bactérias causada pela ação de um antibiótico (bactericidas) ou apenas a inibição de seu crescimento (bacteriostáticos) podem ocorrer no nível da parede celular (TRABULSI, 2000). Assim como as bactérias, as arquibactérias são células procarióticas, porém, quando possuem parede celular, estas não são formadas por peptideoglicano. As células procarióticas, por não possuírem um núcleo definido, seu material genético fica 12 UNIDADE I │ ESTRUTURA E FISIOLOGIA BACTERIANA disperso no interior celular. Seu DNA não está associado com histonas (proteínas cromossômicas encontradas em eucariotos). Também não possuem organelas citoplasmáticas, no entanto, possuem ribossomos para a síntese proteica. Muitas das proteínas estão precisamente localizadas em seu interior, o citosol – este é um indício de uma organização celular interna mais simples quando comparada com a de eucariotos. Normalmente, dividem-se por fissão binária, processo que envolve menos estruturas e processos que a divisão das células eucarióticas. Células eucarióticas Ao contrario das procarióticas, células eucarióticas possuem núcleo definido, o qual contém o material genético (DNA) – o qual, por sua vez, é envolto/protegido pela membrana nuclear. Existe um sistema de membranas no citoplasma (região celular localizada entre a membrana plasmática e o núcleo) e a presença de organelas celulares. Dentre as organelas presentes em uma célula eucariótica típica podem-se destacar os ribossomos, mitocôndrias, retículo endoplasmático granuloso e não granuloso, complexo de Golgi, lisossomos, peroxissomos, centríolos, dentre outras. No caso das organelas, as mitocôndrias são praticamente universais nas células eucarióticas enquanto os cloroplastos são encontrados somente em células fototróficas. Além disso, as células eucarióticas podem apresentar uma parede celular (estrutura que envolve a célula), como no caso de células vegetais, algas e fungos. No entanto, podem também não possuírem tal estrutura, como no caso das células animais e nos protozoários. Além da parede celular as células vegetais possuem estruturas únicas, como por exemplo, os plastos e os vacúolo (BROCK et al, 2008). A divisão celular geralmente envolve mitose. Figura 1. Características comuns das célulasprocarióticas e eucarióticas. Figura adaptada e disponível em: <http://www.phschool.com/science/biology_place/biocoach/cells/common.html>. 13 ESTRUTURA E FISIOLOGIA BACTERIANA │ UNIDADE I Para resumir, o quadro a seguir mostra as principais diferenças entre células procarióticas e eucarióticas: Quadro 1. Comparação entre células procarióticas e eucarióticas. Célula procariótica Célula eucariótica DNA Um circular, algumas vezes dois circulares, alguns lineares Linear Histonas Em arquibactérias Sim Primeiro aminoácido na síntese proteica Formilmetionina (bactéria) Metionina (arquibactéria) Metionina Ribossomos 70S 80S Crescimento Fissão binária Mitose Fonte: adaptada de Tortora et al, 2012 » As bactérias são organismos unicelulares. Por não terem um núcleo, as células são descritas como procarióticas. » As três principais formas de bactérias são bacilos, cocos e espirilos. » A maioria das bactérias possuem uma parede celular de peptideoglicano; elas dividem-se por fissão binária, e muitas possuem flagelos. » As bactérias podem usar uma ampla variedade de compostos químicos para a sua nutrição. » As arquibactérias são células procarióticas, com peptideoglicano em suas paredes celulares. » As arquibactérias incluem as metanogênicas, as halofílicas extremas e as termofílicas extremas. 14 CAPÍTULO 2 Morfologia bacteriana Bactérias são organismos que possuem uma única célula – são seres chamados de unicelulares. Como visto no Capítulo 1, o material genético das bactérias não é envolto por uma membrana celular, constituindo o grupo dos organismos chamados procariontes. Pela ausência de compartimento dentro das células os metabólitos permanecem dispersos no citoplasma. As bactérias são morfologicamente caracterizadas pelo seu tamanho, forma e arranjo. Quanto ao tamanho, as bactérias podem variar entre 0,3/0,8 μm até 10/25 μm. Possuem variadas formas, sendo que as básicas são: » bacilos – forma de bastão/ bastonete; » cocos – forma esférica ou ovoide; » espirilos – forma espiral. Além destas que são consideradas as mais comuns, existem algumas bactérias com outras formas: retangular, vibrião e estrela. Vibrio cholerae é uma bactéria em forma de vibrião (ou vírgula). Com suas formas, as bactérias podem formar rearranjos. Os cocos podem permanecer aos pares, cadeias ou grupos, conferindo um gênero ou espécie em particular. Estes arranjos podem ser: diplococo (cocos que permanecem aos pares), estreptococo (cocos que permanecem em forma de cadeia), tétrade (permanecem em grupos de quatro), sarcina (permanecem em grupo de oito bactérias unidos em forma de cubo), estafilococo (agrupamentos tipo cacho de uva). Como exemplo de diplococos pode-se citar a Neisseria (meningococo), exemplo de sarcinas encontra-se a Sarcina, no arranjo estreptococos pode-se citar Streptococcus e, no grupo dos estafilococos são encontrados Staphylococcus. Os bacilos, além de apresentarem a forma de bastonete simples, também podem formar rearranjos como diplobacilos (bacilos aos pares) e estreptobacilos (bacilos em cadeias). Alguns apresentam a forma de “canudo”, outros são ovais (cocobacilos) ou até mesmo em formato de charuto (com as extremidades ovaladas). A figura 1, mostra a ilustração das formas bacterianas e seus rearranjos. 15 ESTRUTURA E FISIOLOGIA BACTERIANA │ UNIDADE I Além da morfologia variada, algumas bactérias apresentam estruturas denominadas flagelos. Estes são apêndices filamentosos que podem ser distribuídos ao longo da célula (peritríqueos), em um ou nos dois polos celulares (polar). Com sua estrutura helicoidal, o flagelo procarioto possui um movimento de rotação (dependente de geração de energia celular) capaz de mover a célula. Tanto a velocidade quanto a direção de rotação do flagelo podem ser regulados pela célula bacteriana. A vantagem dessa movimentação, chamada de taxia, é o direcionamento da bactéria à um ambiente favorável ou o afastamento de um ambiente desfavorável (TORTORA et al, 2012). Os filamentos axiais (estruturas semelhantes à dos flagelos) também promovem mobilidade à um grupo de bactérias específicas, as espiroquetas – causadora da sífilis (Treponema pallidum). É um movimento similar a um saca-rolhas, o que permite a movimentação em fluidos corporais. Outros apêndices que podem ser utilizados para a movimentação, mas que são mais utilizados para a fixação e transferência de DNA são as fímbrias e pili. Normalmente são menores e mais finos que os flagelos. As fímbrias podem estar distribuídas na superfície da célula ou em seus polos. Pela sua capacidade de adesão entre si e também às superfícies, as fímbrias estão envolvidas na formação de biofilmes. Os pili estão envolvidos na mobilidade celular (translocação e deslizamento) e na transferência de DNA (conjugação), havendo apenas um ou dois por célula. Quando há o contato celular físico e uma célula transfere seu DNA (a célula F+) para a outra célula, este material genético pode conferir diferentes comportamentos à célula receptora, como por exemplo, a resistência a um antibiótico. Essa transferência de DNA durante a conjugação pode ocorrer entre bactérias da mesma espécie ou entre bactérias de espécies diferentes. Figura 2. Formas bacterianas e seus rearranjos. Fonte disponível em: <http://www.cientic.com/portal/> 16 UNIDADE I │ ESTRUTURA E FISIOLOGIA BACTERIANA Figura 3. Flagelo e pili bacteriano. Fonte disponível em: <http://apps.cmsfq.edu.ec/biologyexploringlife/text/chapter16/concept16.2.html> Para a visualização da dinâmica flagelar, acesse o link: <https://www.youtube. com/watch?v=5RmS_n_bq04> Resumidamente, a maioria das bactérias varia de 0,2 a 2,0 μm de diâmetro e de 2 a 8μm de comprimento e possuem formas básicas como cocos, bacilos e espiral. 17 CAPÍTULO 3 Genética bacteriana Normalmente, as bactérias possuem um único cromossomo circular. O DNA circular está associado com proteínas e aderido a um ou a vários pontos da membrana plasmática. O DNA possibilita o fluxo de informação genética entre gerações. Para que isso ocorra, o DNA é replicado, a célula realiza a divisão celular e então cada célula-filha recebe um cromossomo idêntico ao da linhagem parental. DNA e replicação Varias enzimas estão envolvidas na replicação do DNA, que acontece de maneira semi-conservativa. No início da replicação, a enzima topoisomerase ou girase é responsável por relaxar o DNA que está superenovelado. As fitas de DNA são desenroladas pela enzima helicase e separadas uma da outra em um pequeno fragmento. Quando um nucleotídeo que está presente no citoplasma é alinhado com sua base complementar, a enzima DNA-polimerase o adiciona para a formação da nova fita de DNA. Assim, o DNA parental vai se desenrolando pouco a pouco para a adição de mais nucleotídeos. O local em que ocorre a replicação é chamado de forquilha de replicação. Em determinadas bactérias, como em E. coli, por exemplo, a replicação ocorre de maneira bidirecional. Assim, duas forquilhas de replicação movem-se em direções opostas e eventualmente se encontram – a replicação está completa. A enzima DNA-polimerase adiciona nucleotídeos somente à extremidade 3’ da fita de DNA e possui a capacidade de correção da incorporação de nucleotídeos (proofreading), aumentando a precisão da replicação do DNA. RNA e síntese proteica A síntese de uma fita complementar de RNA a partir de uma fita molde de DNA é um processo denominado de “transcrição”. Ha três tipos de RNA em uma célula bacteriana: » RNA ribossômico: forma o ribossomo. » RNA de transferência (tRNA): reconhece códons específicos e transporta os aminoácidos requeridos. 18 UNIDADE I │ ESTRUTURA E FISIOLOGIA BACTERIANA » RNA mensageiro (mRNA): transporta a informação codificadapara a produção de proteínas, a informação genética no DNA é transferida ao mRNA. O início da transcrição ocorre quando a enzima RNA-polimerase liga-se à região promotora do DNA. Assim como o DNA, o RNA também é sintetizado no sentido 5’ à 3’ até a região de terminação do DNA. O processo de tradução está relacionado com a síntese proteica e envolve a decodificação dos ácidos nucleicos. A linguagem do mRNA está na forma de códons cuja sequência determina a sequência de aminoácidos, os quais formarão a proteína que será sintetizada. Como existem 64 códons e apenas 20 aminoácidos, pode-se dizer que o código genético é degenerado, ou seja, um mesmo aminoácido pode ser representado por mais de uma trinca de nucleotídeos. Dentre os códons existentes há o códon de iniciação. Este é representado pela sequência AUG – metionina – e indica o início da síntese proteica. Os códons de terminação, ou códons de parada, são representados pelas sequências UAA, UAG e UGA. As moléculas de tRNA possuem um anticódon, sequência complementar ao códon. Assim, durante o processo de tradução, uma molécula de tRNA transporta o aminoácido que é codificado pelo códon e reconhecido pelo tRNA. Os ribossomos ordenam a ligação do tRNA ao códon para a montagem dos aminoácidos em cadeia e formação da proteína. Deste modo os aminoácidos vão sendo ligados por ligações peptídicas resultando em uma cadeia. A tradução finaliza quando o códon de terminação é detectado no mRNA. Neste momento, o ribossomo é separado em suas duas subunidades e a cadeia polipeptídica pode ser liberada. Por fim, tanto o ribossomo quanto o mRNA e tRNAs tornam-se disponíveis para serem utilizados novamente. O ribossomo se move na direção 5’ à 3’ do mRNA e pode haver vários ribossomos em um mesmo mRNA, em estágios diferentes da síntese proteica. Diferentemente de células eucarióticas, em células procarióticas a tradução do mRNA pode ocorrer antes do término da transcrição. Regulação da expressão gênica Como visto, a síntese proteica é dirigida pela transcrição gênica e tradução. Alguns genes possuem seus produtos constantemente produzidos, ou seja, são constitutivos (geralmente eles são essenciais); outros são regulados por determinados fatores. Assim, a fim de controlar a expressão gênica, existem mecanismos de controle genético conhecidos como mecanismos de expressão e mecanismos de indução. 19 ESTRUTURA E FISIOLOGIA BACTERIANA │ UNIDADE I O mecanismo de repressão é responsável pela diminuição ou inibição da expressão gênica. Tal mecanismo é mediado por proteínas chamadas de repressoras, as quais bloqueiam a ação da RNA-polimerase inibindo a transcrição de genes que, naquele momento, estão reprimidos. Já o mecanismo de indução ativa a transcrição de um gene. Transformação em bactérias Na natureza, algumas bactérias liberam seu DNA no ambiente após a lise celular. Dependendo da espécie e das condições de crescimento em outra espécie é capaz de captar os fragmentos de DNA que foram liberados e integrar em seu próprio DNA. Isso só é possível devido ao processo de recombinação realizado por uma proteína chamada de RecA. Essa célula com nova constituição do material genético é capaz de transferir aos seus descendentes o DNA recombinado, surgindo novas variações gênicas. Em alguns organismos como Bacillus, Hemophilus, Actinobacter entre outros, a transformação ocorre naturalmente. Quando uma célula receptora consegue captar o DNA do doador (por meio da parede e membrana celular), ela é descrita como competente. Essa competência nada mais é que alterações na parede celular que a tornam permeáveis a moléculas de DNA. Figura 4. Transformação bacteriana. Fonte disponível em: <https://djalmasantos.wordpress.com/2014/03/10/transformacao-bacteriana/> Conjugação A conjugação é realizada com um DNA circular denominado plasmídeo. Os plasmídeos replicam-se de maneira independente do cromossomo da célula e geralmente possuem genes de resistência aos antibióticos. Para que ocorra a conjugação, a célula doadora e a célula receptora devem estar em contato direto. Em Escherichia coli, o fator F (fator de fertilidade) foi o primeiro plasmídeo observado durante o processo 20 UNIDADE I │ ESTRUTURA E FISIOLOGIA BACTERIANA de conjugação. Assim, células doadoras são denominadas F+ e as células receptoras tornam-se a célula F-. Transdução Outro mecanismo de transferência de material genético em bactéria é a transdução. Neste caso, a transferência de DNA bacteriano é realizada dentro de um bacteriófago ou fago – vírus que infecta bactéria. Figura 5. Conjugação bacteriana. Fonte: adaptada de Tortota et al, 2012 Figura 6. Transdução bacteriana. Figura disponível em: <http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Reinos/biomonera3.php> 21 CAPÍTULO 4 Bactérias Gram positivas e Gram negativas Qual é a diferença na parede celular de células Gram-positivas e células Gram-negativas? A parede celular bacteriana é comporta por macromoléculas chamadas de peptideoglicana, um dissacarídeo repetitivo ligado por polipeptídeos, formando uma rede que circunda e protege a célula. Em bactérias gram-positivas existem muitas camadas de peptideoglicana (mureína), formando uma estrutura espessa e rígida. Além disso, as paredes celulares de bactérias gram-positivas são compostas de ácidos teicóicos e fosfato (TORTORA et al, 2014). Figura 7. Parece celular de bactérias gram-negativas e gram-positivas. Fonte disponível em: <https://www.pinterest.com/pin/162411130285574315/> Bactérias Gram-negativas Em bactérias Gram-negativas a parede celular é composta por uma ou poucas camadas de pepideoglicana, a qual está ligada na membrana externa por lipoproteínas. Ela está situada no periplasma, região entre a membrana externa e a membrana plasmática, 22 UNIDADE I │ ESTRUTURA E FISIOLOGIA BACTERIANA local onde são encontradas várias enzimas de degradação e proteínas de transporte. A parede celular de bactérias gram-negativas não contém ácido teicóico e, por possuírem pouca quantidade de peptideoglicana, são mais suscetíveis ao rompimento mecânico. A membrana externa destas bactérias é composta por lipopolissacarídeos (LPS), lipoproteínas e fosfolipídeos. A membrana externa pode funcionar como uma barreira para alguns antibióticos, detergentes, entre outros. Bactérias Gram-positivas As bactérias Gram-positivas estão entre os microrganismos mais encontrados em amostras biológicas humanas que são analisadas em laboratório. Dentre as bactérias detectadas, os estafilococos são amplamente encontrados na pele e mucosa do homem. Algumas espécies de estafilococos são específicas de determinadas partes do corpo humano, como por exemplo, S. auricularis, a qual é encontrada no conduto auditivo. Em meio sólido estafilococos mostram a presença de pigmento e hemólise em ágar sangue de carneiro, características que ajudam na identificação do microrganismo. Por serem produtores da catalase é muito comum os teste da catalase para diferenciar os estafilococos (catalase positiva) dos estreptococos (catalase negativa). A catalase constitui um mecanismo de defesa de S. aureus contra células fagocitárias, apesar de não ser essencial (Anvisa – <www.anvisa.gov.br>). Mais informações sobre o teste da catalase estão disponíveis na Unidade II deste caderno. Coloração de Gram A coloração de Gram é um dos procedimentos de coloração mais utilizados para a classificação de bactérias gram-positivas e gram-negativas. Para a realização desta técnica, primeiramente é necessário obter um esfregaço fixado pelo calor e então recobri-lo com um corante púrpura (geralmente é utilizado cristal violeta), que penetra no citoplasma celular. A seguir, o corante deve ser lavado e o esfregaço recoberto com iodo. O iodo forma cristais com o corante impedindo que ele escapepela parede celular, devido ao seu tamanho. Assim, após a lavagem do iodo, tanto as bactérias gram-positivas quanto as gram-negativas aparecem na mesma cor – púrpura. Posteriormente, a lâmina é lavada com álcool ou álcool-acetona, uma solução descolorante que remove a púrpura de algumas espécies somente. Essa reação acontece devido ao álcool desidratar a camada de peptideoglicano das células gram-positivas tornando-as mais impermeáveis ao corante. Nas células gram-negativas a membrana externa é dissolvida pelo álcool, formando pequenos buracos na camada de peptideoglicana e permitindo a difusão do cristal violeta-iodo. Por fim, o álcool é lavado e a lâmina é corada com safranina, um corante básico vermelho. No final da técnica, as bactérias gram-positivas retêm o 23 ESTRUTURA E FISIOLOGIA BACTERIANA │ UNIDADE I corante e adquirem a cor púrpura, enquanto as gram-negativas não retêm o corante e permanecem incolores até serem coradas com safranina e adquirirem a cor rosa. Figura 8. Procedimento para coloração de Gram. Fonte: adaptada de Tortora et al., 2012 Figura 8. Coloração de Gram. Fonte: adaptada de Tortora et al., 2012 Durante o procedimento para coloração de Gram existe uma etapa que mesmo sendo omitida permite a diferenciação entre células gram-positivas e gram- negativas. Qual é essa etapa? 24 CAPÍTULO 5 Fatores de virulência Antes de iniciar o capítulo, é importante recordar alguns conceitos: » Patógeno: microrganismo capaz de causar a doença. » Patogenicidade: capacidade de um microrganismo de causar a doença. » Colonização: presença de um microrganismo no tecido do hospedeiro sem qualquer expressão clinica ou reação imune detectada. » Infecção: invasão ou colonização de um microrganismo patogênico no hospedeiro. » Doença: ocorre quando uma infecção resulta em qualquer mudança do estado de saúde do hospedeiro. Em microbiologia médica, a virulência do organismo demonstra o grau que um patógeno pode causar doença suplantando as defesas do hospedeiro. Algumas estruturas bacterianas contribuem para a virulência, possuem um papel na identificação destas bactérias e geralmente são alvos para antimicrobianos. Para que a doença se manifeste o patógeno deve ter acesso ao hospedeiro. Alguns microrganismos não causam doenças pelo dano ao tecido hospedeiro, e sim ao acúmulo de excretas microbianas produzidas. O hospedeiro pode ser infectado por um patógeno por meio de várias vias. Estas são denominadas portas de entrada. As portas de entrada incluem as membranas mucosas, pele e via parenteral. A descrição de cada uma delas pode ser vista a seguir: Membranas mucosas As membranas mucosas são portas de entrada para muitos vírus e bactérias. As membranas são: mucosas que revestem os tratos respiratório, gastrintestinal, geniturinário e a conjuntiva (membrana que recobre o globo ocular e reveste as pálpebras). 25 ESTRUTURA E FISIOLOGIA BACTERIANA │ UNIDADE I A porta de entrada mais fácil é o trato respiratório. Por serem inalados, os microrganismos a utilizam com bastante frequência. As doenças comumente adquiridas pelo trato respiratório são o resfriado, a gripe, a pneumonia, a tuberculose, o sarampo e a varíola. Em relação ao trato gastrintestinal, os organismos têm acesso por meio da água, alimentos ou mãos contaminadas. Na maioria das vezes, o ácido clorídrico (HCl) e enzimas produzidos pelo estômago e a bile e enzimas do intestino delgado são capazes de destruí-los. No entanto, aqueles que sobrevivem podem causar doenças. As doenças comumente adquiridas pelo trato gastrintestinal são: poliomielite, hepatite A, febre tifoide, disenteria amebiana, giardíase, shigelose e cólera. Quando esses patógenos são eliminados pelas fezes podem ser transmitidos a outros hospedeiros. O trato geniturinário é porta de entrada de patógenos que são transmitidos sexualmente. Os microrganismos causadores das doenças sexualmente transmissíveis (DSTs) podem infectar o hospedeiro através de cortes ou abrasões nas membranas mucosas ou até mesmo através de membranas mucosas íntegras. As DSTs comumente adquiridas são: verrugas genitais, infecção por HIV, clamídia, herpes, gonorreia e sífilis. Pele A pele íntegra, na maioria das vezes, é impenetrável para a grande parte dos microrganismos. Portanto, aberturas na pele, folículos pilosos e ductos sudoríparos podem ser considerados porta de entrada aos microrganismos. Porém, larvas de ancilóstomo podem perfurar a pele intacta e alguns fungos podem crescer na queratina da pele. Via parenteral O acesso de patógenos pela via parenteral ocorre quando o micróbio é depositado diretamente no corpo através de perfurações, injeções, mordidas, cortes, ferimentos, cirurgias etc. Virulência A quantidade de microrganismos é extremamente importante para o desenvolvimento da doença. Se apenas alguns micróbios penetram no hospedeiro é grande a chance de serem eliminados por mecanismos de defesa. Portanto, se uma grande quantidade de microrganismos atingir o hospedeiro, a chance de ocorrer a doença aumenta. 26 UNIDADE I │ ESTRUTURA E FISIOLOGIA BACTERIANA A virulência é expressa como DI50 (dose infectante para 50% de uma amostra da população). Esse número varia não somente de acordo com o microrganismo, mas também com a porta de entrada. Outro fator a ser considerado é a potência da toxina, expressa como DL50 (dose letal para 50% de uma amostra da população). A aderência ou adesão ao tecido do hospedeiro é uma etapa necessária para a patogenicidade. Essa aderência é obtida por moléculas denominadas adesinas ou ligantes, que se ligam especificamente aos receptores da célula hospedeira. A maioria das adesinas é constituída por glicoproteínas ou lipoproteínas e os receptores por açúcares (como a manose, por exemplo). Alguns microrganismos podem se agrupar em grandes quantidades e aderir a superfície. Essa comunidade formada é chamada de biofilme. Os biofilmes são resistentes aos desinfetantes e antibióticos. Essa é uma característica importante, pois os microrganismos formadores de biofilme podem colonizar cateteres médicos, endopróteses, válvulas cardíacas, lentes de contato etc. Em algumas espécies de bactérias patogênicas, as cápsulas são consideradas importantes para a virulência, pois estas protegem as bactérias da fagocitose. Como exemplo pode-se citar as bactérias B. anthracis, S. pneumoniae (causa pneumonia somente quando as células estão protegidas pela cápsula – as células não encapsuladas não são capazes de causar a doença e são rapidamente fagocitadas), e Klebsiella pneumoniae. A parede celular de algumas bactérias pode conter substâncias químicas que contribuem para a virulência. A proteína M do S. pyogenes, proteínas Opa de N. gonorrhoeae, ácido micólico de M. tuberculosis são alguns exemplos. Há também as exotoxinas, que são produzidas no interior de algumas bactérias gram-positivas ou gram-negativas (parte do crescimento e metabolismo bacteriano). Normalmente, os genes que codificam a maioria das exotoxinas estão presentes nos plasmídeos e agem destruindo determinadas partes da célula do hospedeiro ou inibindo sua ação. Já as endotoxinas são liberadas quando bactérias Gram-negativas morrem, através da lise celular. Figura 9. Exotocina e endotoxina. Fonte: disponível em: Tortora et al, 2012 27 CAPÍTULO 6 Fatores necessários ao crescimento bacteriano: físicos, químicos Os fatores necessários ao crescimento bacteriano podem ser divididos em fatores químicos ou físicos. Fatores físicos Temperatura Os microrganismos possuem temperaturas ideais de crescimento. A maioria cresce em uma faixa limitada de temperatura, crescem pouco nas temperaturas extremas em relação a esta faixa considerada ideal. Assim, existe temperatura mínima de crescimento,temperatura ótima de crescimento e temperatura máxima de crescimento. Alguns microrganismos crescem bem na temperatura considerada ideal para os seres humanos, porém outros necessitam de temperaturas mais altas, mais baixas ou até mesmo em temperaturas extremas. Em relação à temperatura, os microrganismos podem ser divididos em psicrófilos, mesófilos e termófilos. Organismos psicrófilos podem crescem a 0°C. Estes podem ser encontrados nas profundezas dos oceanos, regiões polares ou temperaturas utilizadas em refrigeradores. A refrigeração é um método bastante comum para a preservação de alimentos, pois temperaturas baixas reduzem a velocidade da reprodução bacteriana impedindo o crescimento de bactérias patogênicas. No entanto, microrganismos psicotróficos crescem melhor em temperaturas baixas quando comparado com os demais. Com o seu crescimento e ao longo do tempo estes microrganismos podem ser capazes de deteriorar alimentos, sendo considerados como deteriorantes. A temperatura ótima de crescimento de organismos mesófilos é de 25°C a 40°C. Estes se adaptaram a viver dentro de corpos de animais. Neste grupo estão incluídos a maioria dos organismos patogênicos e deteriorantes. Os organismos termófilos podem crescer a temperaturas altas, sendo de 50°C a 60°C a temperatura ótima de crescimento. Geralmente, essas temperaturas são comuns em solo exposto e águas termais. Normalmente, tais microrganismos dificilmente conseguem crescem a temperaturas inferiores a 45°C. Os endosporos formados são resistentes à temperatura e também podem causar a deterioração de alimentos. 28 UNIDADE I │ ESTRUTURA E FISIOLOGIA BACTERIANA Existem ainda, organismos considerados hipermófilos ou termófilos extremos. Estes conseguem viver em fontes de águas quentes associadas à atividade vulcânica. Neste caso, o enxofre é importante para a atividade metabólica de destes organismos. Por fim, a temperatura mais alta detectada para crescimento bacteriano é em torno de 121°C (TORTORA, 2014). Figura 10. Classificação dos microrganismos em relação à temperatura. Fonte disponível em: <http://tapeda.blogs.uv.es/files/2008/12/image4.png> pH Os organismos devem manter um equilíbrio ideal e constante entre ácidos e bases para seu desenvolvimento adequado. Concentrações muitas altas ou muito baixas podem comprometer a atividade enzimática e alterar o metabolismo celular. A maioria das bactérias crescem em pH neutro, ou seja, pH entre 6,5 e 7,5. Por isso vários alimentos (queijos, picles etc.), acabam sendo protegidos da deterioração resultante da fermentação bacteriana. No entanto, existem bactérias que crescem em pH ácido, as chamadas acidófilas. Há um tipo de bactéria encontrada em águas de drenagem de minas de carvão. Estas são resistentes a pH extremamente ácido, em torno de pH 1. O crescimento de fungos e leveduras ocorre em faixa de pH um pouco menor que o bacteriano. Bactérias que são cultivadas em laboratório geralmente produzem ácidos que podem interferir em seu próprio crescimento. Assim, para neutralizar os ácidos e manter o pH do meio apropriado, alguns tampões químicos, sais de fosfato, peptona e aminoácidos podem ser adicionados ao meio (de acordo com o tipo de micro-organismo cultivado). A bactéria causadora da acne, Propionibacterium acnes, por crescer na pele humana – levemente ácido – possui pH ótimo de 4 (TORTORA, 2014). 29 ESTRUTURA E FISIOLOGIA BACTERIANA │ UNIDADE I Pressão osmótica A água é muito importante para o crescimento os microrganismos, pois é dela que eles retiram grande parte de seus nutrientes. Como um microrganismo é composto de 80 a 90% de água, altas pressões osmóticas podem remover a água (plasmólise) necessária para a sobrevivência da célula, pois esta pode passar pela membrana celular. Devido à plasmólise, a adição de sais ou açúcares em alimentos é utilizada para a sua preservação (peixe salgado, mel, leite condensado), impedindo o crescimento bacteriano. No entanto, existem microrganismos considerados halófitos extremos que são capazes de crescerem em concentrações elevadas de sais. Por exemplo, aqueles encontrados em águas bastante salinas, como as águas do Mar Morto. Estes microrganismos requerem aproximadamente 30% de sal, porém, existem os halófitos facultativos que são capazes de crescer em até 2% de sal (o que já é suficiente para a inibição do crescimento de vários organismos). Fatores químicos Em um meio de cultura para bactérias, preparado em laboratório, foi adicionado enxofre radioativo (32S). Neste caso, em quais moléculas este 32S pode ser encontrado nas células? Carbono Assim como a água, o carbono é um nutriente indispensável para as células bacterianas. O carbono é importante para o crescimento bacteriano, pois esse elemento compõe o esqueleto estrutural para qualquer composto orgânico que constitui uma célula viva. Assim, pode-se dizer que metade do peso seco de uma bactéria é composto por carbono. A fonte de carbono bacteriana pode ser obtida por proteínas, carboidratos e lipídeos, no caso de microrganismos heterotróficos, ou por meio de dióxido de carbono, no caso dos quimioautotróficos (TORTORA, 2014). Nitrogênio, enxofre e fósforo Não só o carbono é importante para a síntese de material celular. Outros elementos como o nitrogênio, enxofre e fósforo também são necessários para o metabolismo bacteriano. O nitrogênio é requerido na síntese de DNA, RNA e ATP, por exemplo. Como o nitrogênio também participa na formação de um grupo amino dos aminoácidos, muitas bactérias 30 UNIDADE I │ ESTRUTURA E FISIOLOGIA BACTERIANA conseguem adquirir tais compostos mediante a decomposição de material que contém proteína, pois desse modo os aminoácidos são incorporados para nova síntese proteica. Assim como o nitrogênio, o enxofre também participa da síntese de DNA e RNA. Além disso, ele é utilizado na síntese de aminoácidos que contém enxofre e algumas vitaminas, como a tiamina e a biotina. O fósforo é um elemento essencial para a síntese de ácidos nucleicos e fosfolipídeos, componente da membrana nuclear. Oxigênio O oxigênio pode tanto ser necessário à vida quanto prejudicial a ela. Apesar das formas mais comuns de vida precisarem do oxigênio, existem outras que não necessitam. Portanto, podemos distinguir os microrganismos que dependem de oxigênio para viver daqueles que não dependem: os aeróbicos e os anaeróbicos, respectivamente. Como o oxigênio é pouco solúvel na água, algumas bactérias tem desenvolvido a habilidade de crescerem na ausência desse elemento. São denominadas de anaeróbicas facultativas, ou seja, quando o oxigênio está disponível no ambiente em que se encontram elas utilizam; porém, na sua ausência podem manter seu crescimento através da respiração anaeróbica ou fermentação. No entanto, no caso de ausência de oxigênio, a quantidade de energia produzida é menos eficiente. Algumas leveduras e bactérias do trato intestinal humano (E. coli) são exemplos de organismos anaeróbicos facultativos. Outras bactérias como algumas do gênero Clostridium, causadoras do tétano e botulismo, podem ser consideradas anaeróbicas obrigatórias, as quais podem ser danificadas na presença do oxigênio – pela sua toxicidade às células. Por fim, os organismos aeróbicos obrigatórios não sobrevivem na ausência de oxigênio. Elementos traços Os elementos traços são pequenas quantidades de minerais requeridas pelos microrganismos. Estes podem ser o ferro, cobre, molibdênio e zinco. A maioria deles atua como cofatores de enzimas, o que os tornam essenciais para determinada função enzimática. 31 CAPÍTULO 7 Reprodução bacteriana A divisão celular geralmente envolve mitose, na qual os cromossomos são duplicados e um conjunto idêntico é distribuído para cada um dos dois núcleos. Esse processo é controladopelo fuso mitótico, um feixe de microtúbulos. A divisão do citoplasma e de outras organelas segue esse processo, de modo que haverá produção de duas células idênticas. As bactérias normalmente se dividem por divisão em duas células iguais (células filha). O processo de divisão celular é denominado fissão ou divisão binária, o qual é precedido da duplicação do material genético para que a célula filha possa receber uma cópia do DNA da célula mãe. Além da divisão binária algumas bactérias são capazes de se reproduzirem por brotamento. Neste caso, o broto se alonga até atingir um tamanho semelhante ao tamanho da célula mãe e, posteriormente, separa-se da célula parental. Algumas bactérias filamentosas (denominadas actinomicetes) podem se reproduzir por conidiósporos. Tempo de geração Existe um tempo necessário para que uma célula possa se dividir, ou seja, duplicar. Esse tempo é chamado de tempo de geração. O tempo de geração está relacionado com as condições ambientais e é bastante variável entre os organismos. Por isso, para a determinação do tempo de geração das bactérias é considerada apenas a reprodução por divisão binária, pois é o método mais comum. Como já estudado, a divisão de uma célula produz duas células, as quais também se dividem e formam quatro células. Essas quatro células, por sua vez, também se dividem e foram oito células; e assim por diante. Portanto, o número de células por geração é representado na potência de 2 (número de duplicações ocorridas). Geralmente, a grande parte das bactérias têm um tempo de geração que varia entre 1 e 3 horas. No entanto, outras requerem mais de 24 horas para apenas uma geração. No caso da bactéria E. coli, por exemplo, em condições favoráveis a divisão ocorre a cada 20 minutos. Assim, em cerca de 10 horas a população pode ser de aproximadamente um bilhão de bactérias. Por essa razão, a escala logarítmica é bastante utilizada na representação gráfica do crescimento bacteriano. 32 UNIDADE I │ ESTRUTURA E FISIOLOGIA BACTERIANA Figura 11. Divisão celular. Fonte: disponível em: Tortota et al., 2012 A principal forma de reprodução das bactérias é por divisão binária, como visto. No entanto, além dessa forma de reprodução (a fim de garantir a variabilidade genética) as bactérias realizam outros processos: » Conjugação: contato de duas bactérias para a transferência de DNA de uma célula para outra. » Transdução: há participação de vírus (bacteriófagos) que, ao se reproduzirem nas bactérias, incorporam o DNA bacteriano. Ao infectarem outra célula ocorre a transferência do DNA. » Transformação: absorção de DNA extracelular por uma bactéria. Para revisar os detalhes de cada um dos processos acima, revisar o Capítulo 3 (Genética Bacteriana). Figura 12. Conjugação Bacteriana. Fonte disponível em: <http://circulatingnow.nlm.nih.gov/2014/05/08/bacterial-sex-a-building-block-for-biotech/> 33 ESTRUTURA E FISIOLOGIA BACTERIANA │ UNIDADE I Algumas bactérias (principalmente as do gênero Clostridium e Bacillus), quando em condições desfavoráveis, desidratam-se formando estruturas muito resistentes chamadas de endósporos. Essas estruturas são capazes de resistir a altas temperaturas, à falta de água e até à ação de substâncias que, na maioria das vezes, matam microrganismos. Quando encontram condições ambientais favoráveis, os endósporos se reidratam e a bactéria se reconstitui, voltando a se reproduzir por divisão binária. O combate aos endósporos bacterianos é um grande desafio para a indústria de alimentos e para a medicina, pois eles são extremamente difíceis de serem exterminados. Após a leitura deste capítulo assista ao vídeo sobre a reprodução celular bacteriana em células de E. coli. Disponível em: <https://www.youtube.com/watch?v=DY9DNWcqxI4> 34 CAPÍTULO 8 Curva de crescimento bacteriano O termo “crescimento bacteriano” refere-se ao aumento do número de células e não ao seu tamanho. Deste modo, quando os microrganismos estão crescendo, deve-se pensar em aumento do número e formação de colônias. Colônias são grupos de células que, por estarem acumuladas, podem ser vistas a olho nu, sem a utilização de um microscópio. O crescimento dos microrganismos é dependente de determinadas condições. Como visto no Capítulo 6, algumas condições químicas (como a água, macronutrientes, micronutrientes e fatores de crescimento) e físicas (como temperatura, pH, pressão osmótica, O2) são necessárias ao crescimento microbiano. Em laboratório, quando um microrganismo é cultivado em meio de cultura e condições apropriadas, o seu crescimento segue uma curva a qual é definida com as seguintes fases: » Fase Lag: pouca divisão celular, adaptação dos microrganismos ao meio de cultura. Nesse período, as células aumentam de tamanho, mas não em número. » Fase exponencial (Log): Passado a fase lag, as células iniciam o processo de divisão celular – que é o crescimento exponencial do seu número. Neste estágio o tempo de geração atinge valores constantes. É também neste estágio o período de maior atividade metabólica. Na Fase Log a colônia é extremamente sensível a variações ambientais podendo comprometer fases importantes do desenvolvimento bacteriano. » Fase estacionaria: decréscimo na taxa de divisão celular. Momento em que a velocidade de crescimento é igual à velocidade de morte celular. » Fase de declínio ou morte: as condições são impróprias para crescimento, o meio está deficiente em nutrientes e rico em toxinas, as células mortas excedem o número de células vivas. Assim, a taxa de crescimento é a variação de massa e/ou número de indivíduos por uma unidade de tempo. O Tempo de Geração é o intervalo de tempo necessário para que a célula consiga se duplicar. Este pode ser variável, de acordo com cada espécie. 35 ESTRUTURA E FISIOLOGIA BACTERIANA │ UNIDADE I A contagem em placas é um método utilizado para medir populações bacterianas. Nesta contagem é considerada que cada bactéria viva cresce e se divide, formando uma única colônia. Como nem sempre uma única bactéria produz uma única colônia ─ pois as bactérias crescem em agregados ou cadeias ─ as vezes uma colônia não é resultante de uma única bactéria, e sim de uma cadeia ou agregado bacteriano. Portanto, usa-se o termo unidades formadoras de colônias (UFC). Figura 13. Curva de Crescimento Bacteriano. Fonte: disponível em: Tortora et al., 2012 No entanto, para a contagem de células microbianas nem sempre é necessário contar seu número. Este pode ser determinados por turbidimetria. Por meio desse método é possível monitorar o crescimento bacteriano em meio líquido, o qual vai se tornando turvo com a presença de células. A turbidimetria pode ser avaliada em equipamento chamado espectrofotômetro. Nesse instrumento, um feixe de luz passa através da suspensão bacteriana até um detector fotossensível. Deste modo, quanto maior o número de bactérias, menos luz atinge o detector. A alteração de luz é registrada em expressão logarítmica chamada absorvância (também referida como densidade ótica, DO). Os valores de absorvância são utilizados para representar graficamente o crescimento bacteriano. Outra maneira de estimar o número de bactérias de bactérias é por meio da medida da atividade metabólica da população. Nesse método, a quantidade de um produto metabólico é diretamente proporcional ao número de bactérias presentes no meio de cultura. Por fim, no caso de bactérias e fungos filamentosos, uma maneira de medir o crescimento do organismo é por meio do peso seco, uma vez que a contagem em placas não pode medir o aumento da massa micelial. Para contagem em placas de actinomicetes, por 36 UNIDADE I │ ESTRUTURA E FISIOLOGIA BACTERIANA exemplo, o fungo é removido do meio, filtrado, seco em dissecadore então pesado. No caso de bactérias este mesmo procedimento pode ser seguido. Figura 14. Turbidimetria. Fonte: disponível em <http://pt-br.aia1317.wikia.com/wiki/Arquivo:Turbidimetria.jpg> As populações bacterianas seguem uma série de fases de crescimento: as fases lag, log, estacionária e de morte celular. 37 CAPÍTULO 9 Metabolismo bacteriano A molécula de ATP (trifosfato de adenosina), composta por uma ribose, uma adenina e três grupos fosfato armazena energia resultante das reações de catabolismo e posteriormente a liberam a fim de realizar reações anabólicas ou outras reações celulares. Metabolismo está relacionado com as reações químicas em um organismo vivo. Tais reações químicas podem tanto liberar quanto requerer energia. As reações químicas que são reguladas por enzimas que liberam energia por meio da quebra de compostos orgânicos complexos em compostos mais simples são chamadas de catabolismo. Essas reações são chamadas de reações catabólicas e são exergônicas, ou seja, produzem mais energia do que consomem. Um exemplo dessas reações é a quebra de moléculas de açúcares em dióxido de carbono e água. Já as reações que são reguladas por enzimas que requerem energia por meio da construção de moléculas orgânicas complexas a partir de moléculas simples são chamadas de anabolismo. Essas reações são chamadas de reações anabólicas ou biossintéticas e são endergônicas, ou seja, consomem mais energia do que produzem. Um exemplo dessas reações é a formação de proteína a partir de aminoácidos. Existem substâncias que conseguem acelerar uma reação química sem altera-la – tais substâncias são chamadas de catalizadores. As enzimas são catalizadores biológicos e atuam especificamente com seu substrato, como por exemplo, a sacarose atuando como substrato da enzima sacarase (catalisa a hidrolise da sacarose para glicose e frutose). O complexo enzima-substrato diminui a energia de ativação da reação acelerando a reação e atingindo a energia de ativação necessária para que haja a reação. Assim, a função crucial das enzimas é acelerar as reações bioquímicas a uma temperatura adequada ao bom funcionamento da célula. As enzimas são proteínas especializadas em catalisar reações biológicas, ou seja, aumentam a velocidade de uma reação química sem interferir no processo. 38 UNIDADE I │ ESTRUTURA E FISIOLOGIA BACTERIANA Fatores que influenciam a atividade enzimática O sítio ativo da enzima é a região que interage com a substância específica. No entanto, alguns fatores como temperatura, pH, concentração de substrato e presença de inibidores são muito importantes. Temperatura Na maioria das reações, a velocidade aumenta com o aumento da temperatura. Isso acontece porque em baixas temperaturas as moléculas movem-se mais vagarosamente e desse modo, podem não ter energia suficiente para uma reação química. No entanto, o aumento da temperatura acima da temperatura ótima pode causar a desnaturação das enzimas levando a perda da estrutura tridimensional. pH Assim como a temperatura as enzimas também possuem um pH ótimo. Acima ou abaixo desse pH a velocidade da reação é diminuída, pois mudanças no pH podem causar a desnaturação. Concentração de substrato Em condições normais as enzimas não estão saturadas com o(s) substrato(s). Porém, a velocidade máxima de uma reação é atingida somente quando a concentração de substrato também está extremamente alta. Quando existe muito substrato no meio a enzima torna-se saturada, pois seu sítio ativo permanece sempre ocupado pelas moléculas de substrato. No entanto, um aumento na concentração de substrato não aumentará a velocidade da reação nessa determinada condição. Inibidores Os inibidores enzimáticos podem ser competitivos ou não competitivos. Os inibidores competitivos ocupam o sítio ativo de uma enzima e competem com o substrato por esse sítio ativo. Isso acontece porque a estrutura química do competidor é semelhante à do substrato. As ligações dos inibidores competitivos podem ser reversíveis ou irreversíveis (impedindo interações adicionais). Quando a ligação é reversível, o aumento da concentração de substrato torna o sítio ativo mais disponível para as moléculas de substrato. 39 ESTRUTURA E FISIOLOGIA BACTERIANA │ UNIDADE I Os inibidores não competitivos não competem pelo sítio ativo da enzima. Eles interagem com outra parte da enzima, chamado de sítio alostérico, causando a inibição alostérica. Essa ligação causa uma modificação conformacional do sítio ativo, o que o torna não funcional e diminui a velocidade da reação. Essa ligação também pode ser reversível ou irreversível. Alguns inibidores irreversíveis são os venenos, como no caso dos inseticidas, do cianeto (pode ligar o ferro nas enzimas contendo ferro) e do fluoreto (pode ligar cálcio ou magnésio). A figura baixo ilustra a ligação normal de um substrato no sítio ativo de uma enzima e a ação de inibidores enzimáticos: inibidor competitivo e inibidor não competitivo. Figura 15. Inibidores enzimáticos. Fonte: disponível em: Tortora et al, 2012 Lembre-se! Todas as enzimas são proteínas, mas nem todas as proteínas são enzimas. Para assistir a uma animação sobre o mecanismo de ação enzimático acesse o link abaixo: <https://www.youtube.com/watch?v=tM8Fte3JBy8> 40 UNIDADE II BACTÉRIAS DE INTERESSE CLÍNICO E DIAGNÓSTICO CAPÍTULO 1 Enterobacteriaceae Quais os principais agentes bacterianos causadores de diarreia que devem ser pesquisados em exame de fezes? Os membros da família Enterobacteriaceae são pertencentes ao grupo das proteobactérias. São todos oxidase-negativos e, entre eles, estão os membros dos gêneros Escherichia, Enterobacter, Shigella, Citrobacter e Salmonela. Escherichia, Enterobacter e Citrobacter podem fermentar a lactose para produzir ácido e gás, enquanto que Shigella e Salmonela não podem. A seguir, algumas características dessas bactérias são destacadas: E. coli E. coli é uma bactéria que vive habitualmente dentro do intestino dos mamíferos. A maioria das cepas de E. coli costuma ser inofensiva. No entanto, se a bactéria coloniza outros órgãos do corpo humano como bexiga, rins etc., pode acarretar em uma doença. A maioria das infecções urinárias é causada pela infecção por E. coli devido a proximidade da uretra feminina com o ânus, assim, as bactérias passam do trato digestivo para o urinário. Existem varias cepas de E. coli que podem causar diarreia com diferentes graus de gravidade. Dentre elas, algumas serão destacadas a seguir: » EPEC – E coli enteropatogênica: essa cepa é capaz de se aderir à parede do intestino, causar inflamações, alterar a capacidade do órgão em absorver água dos alimentos ingeridos (resultando em diarreia aquosa). É bastante comum em bebês e crianças. 41 BACTÉRIAS DE INTERESSE CLÍNICO E DIAGNÓSTICO │ UNIDADE II » ETEC – E. coli enterotoxinogênica: essa cepa produz uma toxina semelhante à da bactéria da cólera – causa diarreia aquosa profusa. » EIEC – E. coli enteroinvasiva: cepa com virulência parecida com o da bactéria Shigella, causadora da disenteria – profusa diarreia geralmente com sangue, forte dor abdominal e febre alta. » EHEC – E. coli enterohemorrágica: esta cepa também se comporta de maneira semelhante à bactéria Shigella. Produz uma toxina bem agressiva, podendo levar à colite hemorrágica. A infecção pode acarretar em uma síndrome hemolítica urêmica com complicação grave de anemia e queda de plaquetas e insuficiência renal aguda. Enterobacter O gênero Enterobacter é constituído pelas espécies E. aerogenes, E. sakazakii, E. cloace, E. agglomemns, e E. gergoviae. Esses microrganismos são resistentes a vários antibióticos, incluindo as cefalosporinas. As doenças mais comuns causadas por essesmicrorganismos incluem bacteremia, osteomielite, pneumonia e septicemia. A espécie E. aerogenes é a mais prevalente entre bebês, crianças e idosos. E. aerogenes é resistente à maioria dos antibióticos, incluindo cloranfenicol, quinolona e tetraciclina. Shigella Bactérias Shigella causam a doença infecciosa chamada Shigelose. É caracterizada por dor abdominal, cólica, diarreia com sangue, pus ou muco, febre e vômitos. A infecção grave pode vir associada com convulsões em crianças com menos de 2 anos. Algumas cepas são responsáveis pela taxa de letalidade de 10 a 15% e produzem a enterotoxina tipo Shiga, que pode causar a síndrome hemolítico-urêmica (SHU), a doença de Reiter e artrite reativa (Informe _ NET DTA, Vigilância Epidemiológica, 2013). Citrobacter C. freundii é um tipo de bactéria que pode ser encontrada na água, fezes e intestino humano. No entanto, quando a bactéria atinge o sistema urinário, pode causar infecção. Os sintomas da infecção por C. freundii incluem a sensação de queimação ao urinar, aumento da sensação de vontade de urinar, urina com presença de sangue, escura e com odor diferente. 42 UNIDADE II │ BACTÉRIAS DE INTERESSE CLÍNICO E DIAGNÓSTICO Salmonela A salmonelose é uma infecção transmitida por várias espécies de salmonelas. Os tipos mais comuns, entre eles a Salmonella enteriditis, causam a gastrenterite (inflamação da mucosa intestinal) e a enterocolite aguda. Os principais sintomas são febre, dor de cabeça, náuseas, vômitos, falta de apetite, cólicas e diarreias. Outras doenças de grande importância causadas por salmonelas são: » Febre tifoide: causada por S. typhi. Nesta infecção os sintomas incluem septicemia, febre alta, diarreia e vômitos. A febre tifoide pode evoluir para o óbito. » Febre entérica: causada por S. paratyphi A, B e C. Os sintomas clínicos são mais brandos em relação à febre tifoide, porém podem evoluir para a septicemia e desenvolver um quadro de gastroenterite, febre e vômitos. Além de todos serem oxidases negativos, outros testes bioquímicos podem diferenciar os gêneros, conforme a figura a seguir: Figura 16. Características metabólicas para a identificação de bactérias entéricas. Fonte disponível em: Tortora et al., 2012 Entérica é o nome comum dado a uma bactéria pertencente à família Enterobacteriaceae. 43 CAPÍTULO 2 Estafilococos Estafilococos são bactérias Gram-positivas com morfologia de cocos. Podem se dividir em múltiplos planos e formar agrupamentos tipo cacho de uva (ver morfologia bacteriana no capítulo 2 deste caderno). Essa é uma característica bastante utilizada na identificação dessas bactérias. Seu tamanho pode variar entre 0,5 a 1 micrômetros de diâmetro e são produtores de catalase. Figura 17. Estafilococos. Fonte disponível em: <http://www.lifestyles.com.br/index.htm/2012/05/estafilococos/> As características de identificação de Estafilococos são bastante variadas. Além das características fenotípicas como coloração das colônias, outras características na identificação desses microrganismos é a presença de hemólise em meio ágar sangue de carneiro. A habilidade de coagular o plasma é um dos critérios mais aceitos para a identificação dos estafilococos patogênicos associados com infecções agudas em geral. Por produzirem catalase, o teste da catalase também é bastante utilizado na diferenciação de estafilococos (catalase positiva) dos estreptococos (catalase negativa). Métodos de reação de cadeia em polimerase (PCR), apesar de não estar disponível em todos os laboratórios, é um método eficaz de identificação destas bactérias. A catalase é uma enzima capaz de decompor o peroxido de hidrogênio (H2O2) e constitui um mecanismo de defesa para a bactéria contra células fagocitárias. Os estafilococos são bastante encontrados na pele e em mucosas tanto do homem quanto de outros animais. Das 37 espécies existentes no gênero Staphylococcus, 17 podem 44 UNIDADE II │ BACTÉRIAS DE INTERESSE CLÍNICO E DIAGNÓSTICO ser isoladas de amostra biológicas humanas. Um exemplo é a espécie S. auricularis, encontrado na microbiota do conduto auditivo humano. A espécie S. hyicus causa a dermatite infecciosa em suínos. Quadro 2. Espécie de Staphylococcus de origem humama. Espécie Importância Clínica S. aureus É o patógeno humano mais importante entre os estafilococos. Coloniza de 20 a 40% dos adultos, sendo encontrado principalmente em narinas anteriores. S. epidermitis Relacionado com infecções associadas ao uso de cateteres endovenosos e endocardites, entre outras. S. saprophyticus Causa infecções urinárias agudas, sobretudo em mulheres jovens, saudáveis e sexualmente ativas. S. haemolyticus Presente na microbiota humana normal da pele. Relatos de resistência aos glicopeptídeos. S. warneri Presente na microbiota humana normal da pele. S. hominis É encontrado na pele humana e relacionado à bacteremia em pacientes imunodeprimidos. S. simulans Encontrado na pele e uretra de mulheres sadias. S. lugdunensis Associados a casos de endocardite. S. schleiferi Relacionado a varias infecções em humanos. S. pasteuri Não relacionados à infecções em humanos. S. auricularis Raras vezes implicada em infecções em humanos. S. cohnii Presente na microbiota humana normal da pele. S. xylosus Raras vezes implicado em infecções em humanos. S. saccharolyticus Raras vezes implicado em infecções em humanos. S. caprae Originalmente isoladas de caprinos e recentemente encontrada na pele humana. S. pulvereri Raras vezes implicado em infecções em humanos. Tabela adaptada e disponível em: <http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/boas_praticas/modulo4/ intr_sta3.htm> Figura 18. Infecções por estafilococos. Fonte: adaptada e disponível em: <http://www.saudebemestar.org/2013/06/infecoes-por-estafilococos.html> A espécie mais importante de estafilococos é Staphylococcus aureus, a qual possui essa denominação devido à pigmentação amarelada das suas colônias. S. aureus pode crescer em alguns alimentos com alta pressão osmótica ou baixa umidade. Além disso, acredita-se que o pigmento amarelo confere alguma proteção aos efeitos antimicrobianos do sol. Além de produzir várias toxinas, S. aureus possuem a 45 BACTÉRIAS DE INTERESSE CLÍNICO E DIAGNÓSTICO │ UNIDADE II capacidade de desenvolver resistência a antibióticos, como a penicilina por exemplo. Esta bactéria também possui a toxina responsável pela síndrome do choque toxico, uma infecção que causa a febre alta, vômitos e, em alguns casos, a morte (TORTORA et al, 2012). As bactérias mais prováveis de causarem as infecções são os estafilococos, que normalmente habitam a epiderme, os folículos pilosos e as glândulas sudoríparas e sebáceas da pele. 46 CAPÍTULO 3 Estreptococos Estreptococos são bactérias Gram-positivas com morfologia de cocos que se dividem e, diferentemente dos estafilococos, permanecem ligados uns aos outros em forma de cadeia. São microrganismos Gram-positivos, anaeróbios facultativos e não produtores de catalase. A presença da catalase permite separar os estreptococos de outros cocos gram-positivos produtores de catalase, como os estafilococos, por exemplo. Figura 19. Teste da catalase. Fonte: adaptada e disponível em: <http://blogdafarmaceutica.blogspot.com.br/2012/06/catalase-e-coagulase.html> Os estreptococos são responsáveis por uma variedade de doenças em seres humanos, como dor de garganta, septicemia, meningite e bacteremia: » A faringite é causada pelo S. pyogenes. Essa espécie pertence ao grupo A de Lancefield, são β-hemolíticas e possuem vários fatores de virulência. O estreptococo do grupo A é responsável por 20% a 30% das faringites nas crianças e por 5% a 15% dos casos em adultos (VARELLA, 2011). Além da faringite, essa espécie pode acarretar em complicações infecciosasrespiratória, endocardites, meningites e artrites. Se negligenciada, a faringite pode evoluir causando sequelas como glomerulonefrite (compromete a função renal) e febre reumática no paciente. » Dentre as doenças causadas por estreptococos, a pneumonia é bastante frequente e grave. Acomete o homem podendo atingir todas as faixas etárias. O S. pneumoniae, causador da pneumonia, é uma bactéria sensível ao calor, frio e baixa umidade. Portanto, sua transmissão via aérea é feita por gotículas de saliva de portadores, por meio da tosse ou espirro de pessoas doentes. O homem é tanto o reservatório quanto o hospedeiro exclusivo do S. pneumoniae, o qual vive no sistema respiratório. Além 47 BACTÉRIAS DE INTERESSE CLÍNICO E DIAGNÓSTICO │ UNIDADE II disso, o S. pneumoniae não produz a enzima β-lactamase; sua resistência ao antibiótico penicilina é devido a algumas alterações químicas em determinados sítios da parede celular que se ligam os beta-lactâmicos. A reação hemolítica em placas de ágar sangue de carneiro a 5% e a ausência de catalase são outras características de crescimento de um pneumococo. Por fim, a identificação de estreptococos também pode ser feita por sorologia. A identificação sorológica permite identificar os sorotipos de pneumococo, no entanto, sua importância é epidemiológica e não clínica. A bacteremia pneumocócica pode ocorrer junto a uma faringite. É bastante comum em crianças e pode evoluir para a meningite. Já na maioria dos adultos com bacteremia há associação com pneumonia. A meningite pneumocócica é uma complicação decorrente da sinusite, mastoidite, otite ou pneumonia. » A espécie S. agalactiae é β-hemolítica, pertencente ao grupo B de Lancefield. Podem causar infecções graves em neonatologia (sepse e meningite). O Estreptococos do grupo B, também chamado de Streptococcus agalactiae, é uma bactéria extremamente comum, que costuma colonizar as regiões: vaginal, intestinal e retal das mulheres. Está presente na região genital de 1 em cada 3 mulheres grávidas. O Estreptococos B não costuma provocar doenças em pessoas sadias, mas pode causar complicações em mulheres grávidas e ser transmitido para o bebê durante o parto. Porém, a infecção pode ocorrer ainda dentro do útero, por invasão do líquido amniótico (bolsa d’água), causando dor abdominal, febre e sangramento uterino. Assim, para impedir a infecção neonatal pelo estreptococo do grupo B é importante que a bactéria seja identificada e tratada antes dos trabalho de parto. Entre a 35a e a 37a semanas de gestação os obstetras fazem o exame do cotonete para a obtenção de amostras de material vaginal e anal para analisar a presença da bactéria. Caso o exame seja positivo será necessário o uso de antibiótico. Além do teste da catalase, o teste PYR também pode ser utilizado para a identificação de estreptococos. Esse teste determina a atividade da enzima pyrrolidonil arilamidase, produzida pelo S. pyogenes, mas não pelo os demais estreptococos β-hemolíticos. O teste PYR positivo apresenta o desenvolvimento da cor vermelha e o aparecimento de coloração amarela ou alaranjada indica resultado negativo. Tanto S. pyogenes quanto Enterococcus spp. são positivos. 48 UNIDADE II │ BACTÉRIAS DE INTERESSE CLÍNICO E DIAGNÓSTICO O termo pneumonia se aplica a muitas infeções pulmonares, a maioria das quais causada por bactérias. A pneumonia causada por Streptococcus pneumoniae é a mais comum, cerca de dois terços dos casos, sendo assim referida como pneumonia típica. Pneumonias causadas por outros microrganismos, que podem incluir fungos, protozoários, vírus, bem como outras bactérias, só denominadas pneumonias atípicas. Figura 20. Teste PYR. Fonte adaptada e disponível em: <http://www.medical-labs.net/pyrase-test-1300/pyr-test-results-left-circle-shows-pyr-ve-right- circle-shows-pyr-ve/> Penicilinas extraídas de culturas do bolor Penicillium existem sob diversas formas muito relacionadas. Elas são chamadas de penicilinas naturais. O composto prototípico de todas as penicilinas é a penicilina G. Ela possui um espectro de atividade bastante restrito, porém muito útil, sendo com frequência a droga de escolha no tratamento contra estreptococos. 49 UNIDADE III CARACTERÍSTICAS ESTRUTURAIS DA MICOBACTERIUM CAPÍTULO 1 Estrutura e morfologia As micobactérias pertencem a ordem Actinomycetales, família Mycobacteriaceae. Possuem um único gênero denominado Mycobacterium, nome que foi proposto em 1896 por Lehmann e Neumann. Esse nome foi proposto devido a uma película formada por Mycobacterium tuberculosis na superfície de meio líquidos que era similar a produzida por alguns fungos. As micobactérias possuem forma de bastonetes retos ou levemente curvados, são aeróbicos (apesar de algumas espécies crescerem em atmosfera com O2 reduzido) e não formam esporos. Medem aproximadamente de 1 a 10 μm de comprimento e 0,2 a 0,6 μm de largura. O nome myco significa parecido com fungos – devido a ocasionalidade de crescimento filamentoso. A morfologia da colônia pode ou não ser pigmentada. Quando há pigmento, este pode ser amarelo, laranja ou raramente róseo. Normalmente o crescimento das micobactérias é lento, com colônias tornando-se visíveis de 2 a 60 dias quando crescidos em temperatura ótima. O gênero Mycobacterium inclui: 1. o complexo M. tuberculosis; 2. o complexo M. avium; 3. outras micobactérias e numerosas espécies saprófitas no solo e na água. O complexo M. tuberculosis inclui M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. canettii, M. microti e M. pinnipedii. O complexo M. avium inclui duas espécies: M. avium e M. intracellulare. Outras micobactérias de importância clínica são: M. chelonae, M. fortuitum, M. kansasii, M. leprae, M. marinum, M. ulcerans e o M. sucrofulaceum. Estas outras 50 UNIDADE III │ CARACTERÍSTICAS ESTRUTURAIS DA MICOBACTERIUM micobactérias possuem graus variáveis de patogenicidade. Tais micobactérias, consideradas “atípicas” foram inicialmente agrupadas de acordo com a velocidade de seu crescimento a diferentes temperaturas e a produção de pigmentos. A parede celular das micobactérias é rica em lipídeos, incluindo ácidos micólicos (ácidos graxos de cadeia longa de C78 a C90), ceras e fosfatídeos. Os lipídeos são ligados, em grande parte, a proteínas e polissacarídeos. As micobactérias contém uma variedade de polissacarídeos, no entanto, seu papel na patogênese da doença permanece incerto. Figura 21. Parede celular das micobactérias. Fonte: disponível em <http://www.ff.ul.pt/tuberculose/files/2014/03/Parede-celular1.png> Micróbios do gênero Mycobacterium podem ser corados utilizando o procedimento de coloração álcool resistente (coloração diferencial). Nesta metodologia, a carbolfucsina (um corante vermelho) é aplicado a um esfregaço fixado e a lâmina é levemente aquecida. Posteriormente, a lâmina é lavada e o esfregaço é tratado com álcool-ácido, que atua como descolorante. O álcool-ácido remove o corante vermelho daquelas bactérias que não são consideradas álcool-resistentes. Assim, somente os microrganismos álcool- resistentes mantêm a cor vermelha (a carbolfucsina é mais solúvel nos lipídeos da parede celular). As bactérias que não são álcool-resistentes ficam inicialmente incolores (pois a carbolfucsina foi removida) e posteriormente são coradas com o contracorante azul de metileno ─ adicionado ao esfregaço no final do procedimento ─ tornando-se azuis. A figura 22 ilustra uma lâmina corada com álcool-ácido, contendo um tecido infectado com M. leprae. As bactérias álcool-resistentes (BAAR) estão coradas de vermelho e as que não são álcool-resistentes estão coradas de azul. Esta propriedade está relacionada à presença de componentes lipídicos de superfícies, como os ácidos micólicos. 51CARACTERÍSTICAS ESTRUTURAIS DA MICOBACTERIUM │ UNIDADE III Muitas das características das micobactérias, como a coloração álcool resistente, a resistência a drogas e patogenicidade, e são relacionadas com a parede celular distinta, que é estruturalmente similar à das bactérias gram-negativas. Contudo, como sua parede externa possui ácido micólico (que forma uma camada serosa resistente à água), este protege as bactérias contra o ressecamento. No entanto, os nutrientes entram na célula mais lentamente (por meio da membrana), contribuindo para o crescimento lento que é característico de micobactérias. Figura 22. Bactérias álcool-resistentes. Fonte: adaptada de Tortora et al., 2012 O desenvolvimento de lesões causadas por Mycobacterium, cicatrização ou progressão da doença depende do número de bactérias no inóculo, multiplicação e tipo de hospedeiro. Os bacilos da tuberculose propagam-se no hospedeiro por meio dos canais linfáticos, corrente sanguínea, brônquios e trato gastrintestinal. Quando instaladas no tecido, as micobactérias residem principalmente no interior dos monócitos, células reticuloendoteliais e das células gigantes. As micobactérias exibem uma resistência maior que o normal aos biocidas químicos. Assim, as instruções nos rótulos de desinfetantes frequentemente especificam se o produto é tuberculocida, indicando se é eficiente contra as micobactérias. 52 CAPÍTULO 2 Panorama histórico Como a tuberculose pode ser eliminada? A tuberculose é uma das doenças mais antigas do mundo. Em 24 de março de 1882, o médico e microbiologista alemão Robert Koch anunciou ao Instituto de Fisiologia de Berlim o bacilo da tuberculose. Robert Koch iniciou sua trajetória profissional em 1862, quando estudou medicina na Universidade de Göttinen. Depois de formado, Koch foi para Berlim estudar química. Em 1967, após ter se estabelecido como clínico geral, serviu na guerra Franco-Prussiana e de 1872 a 1880 foi médico em Wollstein, que conduziu suas pesquisas. Em 1876, Robert Koch demonstrou o ciclo de vida do bacilo de antraz, o primeiro agente microbiano cujos efeitos patogênicos foram comprovados pela bacteriologia. Evidências da tuberculose foram encontradas em ossos de humanos, com registros datados de 8.000 antes de Cristo (AC). Quando a doença foi anunciada por Robert Koch tratava-se de um experimento que mostrava a capacidade contagiosa do que era considerado o “mal do século”. Assim, durante uma palestra no Instituto de Fisiologia de Berlim, Koch anunciou: Em função das minhas inúmeras observações, considero provado que em todos os casos de tuberculose, em pessoas e animais, são encontrados o que chamei de bacilo da tuberculose. Um microrganismo que, por meio de suas características peculiares, diferencia-se de todas as outras bactérias conhecidas. Além de cultivar o bacilo da tuberculose fora do organismo humano, o estudioso alemão conseguiu provar a doença em animais com o produto cultivado. A partir disso, ele postulou algumas exigências que julgava necessárias para demonstrar a etiologia bacteriana de qualquer doença: primeiramente era necessário isolar o microrganismo em culturas puras, posteriormente inoculá-lo em animais de experiência para a produção da doença cujos sintomas e lesões fossem idênticas ou equivalentes as da doença no homem. 53 CARACTERÍSTICAS ESTRUTURAIS DA MICOBACTERIUM │ UNIDADE III ’ Inicialmente, como sua causa era desconhecida na época, a tuberculose era conhecida como um castigo. No entanto, em XXX AC ela foi desmistificada por Hipócrates, na Grécia. Posteriormente, nos séculos XVII e XVIII (com o surgimento do estudo da anatomia), a tuberculose passou a ser mais compreendida. Nessa época, a doença inicialmente denominada Tísica passou a ser chamada pelo seu nome atual. No final do século XVIII a doença passou a ser associada a uma doença romântica, que acometia os poetas e intelectuais. Porém, outra associação foi em criada no final do século XIX, vinculando-a a um mal social e a qual permaneceu durante o século XX. Em 1885, Koch foi nomeado diretor do Instituto de Higiene da Universidade de Berlim e, seis anos depois, tornou-se professor da faculdade de Medicina de Berlim. Durante esse tempo ele anunciou o teste da tuberculina, amplamente usado hoje em dia. Na década de 1930, surgiram avanços no combate a doença com a invenção da vacina BCG, a baciloscopia, pneumotórax e outras cirurgias torácicas. A vacina extensamente utilizada contra com bacilo da tuberculose contém bactérias atenuadas. Normalmente, os micróbios atenuados são derivados de mutações acumuladas durante cultivos artificiais de longa duração. No entanto, em 1926 em Lübeck na Alemanha, devido a um erro, foram inoculadas bactérias virulentas da tuberculose em vez de vacinas com linhagens atenuadas. Dos 249 bebês que receberam a vacina com a bactéria virulenta, 76 morreram e os demais ficaram seriamente doentes. O dia mundial da tuberculose foi criado em 1982 pela Organização Mundial da Saúde (OMS) em homenagem aos 100 anos do anúncio do seu descobrimento. A estimativa é que cerca de 30% da população mundial estejam infectadas pela bactéria M. tuberculosis. Isso significa 1,7 bilhão de pessoas infectadas, porém, nem todas desenvolvem a doença. Com o aparecimento da AIDS houve um novo surto de tuberculose. Essa relação ocorre, pois quando o bacilo é inalado, as células do sistema imunológico o englobam para tentar destruí-lo. Como o bacilo é capaz de sobreviver dentro dos macrófagos, ele permanece quiescente até a imunidade da pessoa cair e fornecer condições de crescimento favoráveis à bactéria e formação de colônias – provocando manifestações clínicas da doença. Como a AIDS debilita as pessoas e compromete a fagocitose, a pessoa que está imunodeprimida é capaz de desenvolver um granuloma e então o bacilo se espalha. Assim, a doença transformou-se em uma epidemia atingindo vários países. A Organização Mundial da Saúde (OMS) realizou uma estimativa da incidência de tuberculose no ano de 2013, cujos dados estão ilustrados na figura a seguir. 54 UNIDADE III │ CARACTERÍSTICAS ESTRUTURAIS DA MICOBACTERIUM Figura 23. Taxa de incidência de tuberculose em 2013. Fonte disponível em: <http://gamapserver.who.int/mapLibrary/Files/Maps/Global_TBincidence_2013.png> Em 2014, o Sistema Único de Saúde (SUS) anunciou que no Brasil, a cada ano são notificados aproximadamente 70 mil novos casos de tuberculose, além de 4,6 mil mortes em decorrência da doença. O país ocupa o 17o lugar entre as 22 nações responsáveis por 80% do total de casos de tuberculose no mundo. 55 CAPÍTULO 3 Classificação das micobactérias Como visto, as micobactérias são do grupo de bactérias não formadoras de endosporos e que exibem uma resistência maior que o normal aos biocidas químicos. Esse grupo inclui o M. tuberculosis (também conhecido como Bacilo de Kock), o patógeno que causador da tuberculose. A parede celular desse organismo, e também de outros membros desse gênero, possui um componente céreo rico em lipídeos. Possuem resistência a diversos antibióticos e o período de tratamento costuma ser longo. Em 1980, conheciam-se 41 espécies pertencentes ao gênero Mycobacterium. Em 1985, esse número se elevou a 54 e, atualmente, o gênero conta com mais de 60 espécies conhecidas. Em 1959, Timple e Runyon formularam uma classificação para as micobactérias. Essa classificação foi baseada de acordo com a velocidade de crescimento e a capacidade em produzir pigmentos em meio de cultura de organismos considerados atípicos. Assim, as micobactérias não tuberculosas ou atípicas (MNT) patogênicas para o homem foram divididas em quatro grupos: Grupo I Estão incluídas as micobactérias de crescimento lento, as quais produzem colônias com pigmentação decor amarelada quando expostas à luz. Por esse motivo elas são chamadas fotocromógenas. Neste grupo também são incluídos M. kansasii e M. marinum. Grupo II As bactérias também possuem crescimento longo e produzem colônias com pigmentação amarelada. No entanto, a diferença com o grupo II é que a produção de colônias com pigmento é independente da exposição à luz. São denominadas de escotocromógenas. Os representantes desse grupo são: M. scrofulaceum, M. gordonae, M. flavescens lavescens e M. xenopi. Grupo III Compreende bactérias de crescimento lento e que podem produzir pouca ou nenhuma pigmentação, mesmo no caso de intensa exposição à luz. São denominadas acromógenas. 56 UNIDADE III │ CARACTERÍSTICAS ESTRUTURAIS DA MICOBACTERIUM Os representantes desse grupo são o complexo M. avium intracellulare, M. terrae, M. triviale e M. gastri. Grupo IV Compreende bactérias de crescimento rápido ─ cerca de 3-7 dias ─ e podem ou não apresentar a pigmentação. O complexo M. fortuitum chelonae é representante desse grupo. Quadro 3. Classificação das micobactérias não tuberculosas ou atípicas (MNT). Grupos Espécies de crescimento Apresentação clínica comum Tempo Fotocromogênicas Grupo I M. kansasii Pulmonar e ganglionar Lento M. marinum Lesões cutâneas Rápido M. simiae Pulmonar Lento M. asiaticum Pulmonar Lento Escotocromogênicas Grupo II M. scrofulaceum Pulmonar e ganglionar Lento M. xenopi Pulmonar Lento M. szulgai Pulmonar Lento M. gordonae *Não Patogênica M. flavencens *Não Patogênica Não cromogênicas Grupo III Complexo M. avium (inclui M. intracellulare) Pulmonar, ganglionar ou disseminada Lento M. malmoense Pulmonar Lento M. hemophilum Cutânea e de tecidos moles Lento M. terrae *Não patogênica Lento M. ulcerans Ulceras cutâneas Lento M. noncromogenicum Ulceras cutâneas Lento De crescimento rápido-complexo Grupo IV M. fortuitum (inclui M. chelonae), M. abcessus Pulmonar, tecidos moles, óssea Rápido M. thermoresistible *Não patogênica Rápido M. neoaurum *Não patogênica Rápido *Usualmente saprófitas, porém há registros de doenças provocadas por elas. Fonte: adaptada de Runyon (ATS Statement, 1997) In: Ministério da Saúde, 2007. Existe a classificação clínica das bactérias, a qual segue o quadro abaixo: 57 CARACTERÍSTICAS ESTRUTURAIS DA MICOBACTERIUM │ UNIDADE III Quadro 4. Classificação clínica das bactérias. Grupos Exemplos 1. Patógeno obrigatório M. tuberculosis, M. bovis, M. leprae, M. avium subsp. paratubereculosis (doença de Crohn). 2. Patógeno cutâneo M. marinum, M. ulcerans. 3. Patógeno oportunista M. kansasii, M. avium intracellulare, M. xenopi. 4. Não ou raramente patógeno M. gordonae, M. smegmatis. 5. Patógeno animal M. lepraemuriu, M. caprae, M. pennipedi. Fonte adaptada e disponível em: <http://www.ibb.unesp.br/Home/Departamentos/MicrobiologiaeImunologia/aula_ mycobacterium.pdf> Para finalizar a classificação das micobactérias, bactérias que não formam esporos, o quadro abaixo resume a ação dos principais antimicrobianos químicos contra as micobactérias e os endosporos. Quadro 5. Antimicrobianos contra micobactérias e endósporos. Eficiência dos antimicrobianos químicos contra endósporos e bactérias Agentes químicos Endosporos Micobactérias Mercúrio Sem atividade Sem atividade Fenólicos Baixa Boa Bifenois Sem atividade Sem atividade Compostos quartenários de amônio Sem atividade Sem atividade Cloro e derivados Leve Leve Iodo Baixa Boa Álcoois Baixa Boa Glutaraldeído Leve Boa Clorexidina Sem atividade Leve Fonte: adaptada de Tortora et al 2012. 58 UNIDADE IVDIAGNÓSTICO LABORATORIAL CAPÍTULO 1 Coleta do material biológico “Coleta é a obtenção de amostras de animais silvestres, nativos ou exóticos – animal, vegetal, fúngico ou microbiano – seja pela remoção do indivíduo do seu habitat natural, seja pela colheita de amostras biológicas” (IN no157/2007/ IBAMA). Durante a coleta do material biológico, o profissional da recepção deve estar atento à identificação correta do paciente e à especificação dos exames solicitados a fim de evitar erros que possam interferir nos exames e seu diagnóstico. As amostras devem ser identificadas em relação aos seguintes aspectos: » nome e registro do paciente; » leito ou ambulatório e especialidade; » material colhido; » data e hora da coleta. Antes de iniciar a coleta, o profissional deve organizar o material a ser utilizado e portar os Equipamentos de Proteção Individual (EPI) necessários assim como possuir os Equipamentos de Proteção Coletiva (EPC) à disposição. A maioria das amostras como escarros, lavados, aspirados, entre outras, são coletadas diretamente no frasco disponível no laboratório, o qual é fornecido aos pacientes durante a coleta. A seguir, o fluxograma mostra as principais etapas antes e após a coleta de amostras biológicas para analises de microrganismos: 59 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL │ UNIDADE IV Figura 24. Fluxograma das principais etapas durante a coleta de material biológico. Preparo do paciente Coleta Acondicionamento Transporte Análise Fonte: elaborada por Ucci, A.P. Existem algumas considerações gerais que são de extrema importância durante a coleta de amostra microbiológica. Seguem algumas: » instruir o paciente sobre o procedimento; » observar a antissepsia durante a coleta dos materiais; » a coleta deve ser feita em local que o microrganismo suspeito tenha maior probabilidade de ser isolado; » coletar quantidade suficiente para permitir a analise microbiológica completa; » sempre que possível, colher a amostra biológica antes da antibioticoterapia. Antes de determinar os procedimentos analíticos dos testes é essencial conhecer o tipo de amostra necessária para cada tipo de análise a ser realizada. O quadro abaixo aborda os principais tipos de análise de acordo com o tipo de amostra. 60 UNIDADE IV │ DIAGNÓSTICO LABORATORIAL Quadro 6. Tipos de análises e amostras. Tipo de Análise Tipo de Amostra Bioquímica e Sorológica Soro ou plasma Hematológica Sangue total com EDTA Glicêmica Plasma com fluoreto de sódio Coagulação Plasma com citrato de sódio Urinálise em Amostra Isolada Urina recente (jato médio 1a urina a manhã) Urinálise em Amostra de 24h Urina feita no período de 24 horas Parasitológica Fezes recente (sem conservantes) Fonte disponível em: <http://www.acispes.com.br/Downloads/Manual_Coleta_Material_Biologico.pdf> Cada tipo de amostra deve ser coletada em um recipiente específico para cada tipo de análise, sendo de extrema importância conhecer estes recipientes para a realização de uma coleta de material biológico. Por fim, além dos cuidados durante a coleta, o transporte do material biológico é um ponto extremamente crítico para garantir a qualidade e a segurança dos produtos e do futuro diagnóstico. Falhas durante o transporte como mudanças na temperatura adequada e aumento do tempo de transporte, por exemplo, podem acarretar em erros na análise laboratorial. A Gerência Geral de Sangue, Outros Tecidos e Órgãos (GGSTO) juntamente com a Anvisa (Agência Nacional de Vigilância Sanitária), Agências Reguladoras de Transporte, Empresas Transportadoras, entre outros, propuseram em conjunto alguns requisitos para a qualidade e segurança dos produtos e serviços relacionados ao transporte de material biológico. Deste modo, foi proposto o Regulamento Sanitário para o transporte de material biológico humano, a RDC Anvisa no 20 de 10 de abril de 2014, que dispõe sobre o regulamento sanitário para o transporte desse tipo de material. 61 CAPÍTULO 2 Processamento das amostras Segundo as Recomendações da Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/Medicina Laboratorial: Boas Práticasem Microbiologia Clínica (2015), os testes laboratoriais devem ter precisão e reprodutibilidade. Existem diversos fatores que podem ser avaliados para determinar a proficiência desses testes e dos profissionais envolvidos. O processo de validação após a introdução de um novo teste, método ou equipamento no laboratório é de extrema importância. Tanto a validação quanto a verificação devem ser avaliadas na presença de um novo procedimento. » Verificação: processo que determina ou confirma o desempenho esperado do teste antes da implementação da rotina clínica. » Validação: processo de monitoração desse teste, procedimento ou método. Garante a continuidade do desempenho esperado. A realização de testes de sensibilidade antimicrobianos em um laboratório de microbiologia é um dos resultados a ser considerado para o tratamento dos pacientes. Por isso, os profissionais devem realizar de maneira rigorosa a metodologia de teste de sensibilidade. Exame microscópio e coloração As amostras clínicas, exceto sangue e medula óssea, devem ser examinadas por algum método de coloração a fim de detectar ou não a presença de bacilos álcool-ácido resistentes. O esfregaço deve ser preparado com no máximo 1-2 cm de diâmetro. Coloração Ziehl-Neelsen Corantes Fucsina » Dissolver 3g de fucsina em 10 mL de etanol 90%-95%. » Adicionar 90 mL de uma solução aquosa de fenol a 5%. 62 UNIDADE IV │ DIAGNÓSTICO LABORATORIAL Álcool-ácido » Adicionar 3 mL de HCl concentrado em 97 mL de etanol a 90%-95%. Azul de Metileno » Dissolver 0,3 g de cloreto de azul de metileno em 100 mL de água destilada. Procedimento » Fixar o esfregaço na lâmina na chama do bico de Bunsen. » Cobrir o esfregaço com a fucsina. » Aquecer sem deixar ferver de 3 a 4 vezes durante 5 min. » Lavar com água. » Descorar com o álcool-ácido até remover todo o corante – 2 min. » Cobrir o esfregaço com azul de metileno – 2 min. » Lavar com água. » Deixar a lâmina secar. Resultado Positivo: Bacilos coram em rosa forte, outras bactérias e células coram em azul. Negativo: Não são observados bacilos em 300 campos examinados. A interpretação segue descrita no quadro abaixo: Quadro 7. Interpretação de resultados de pesquisa de bacilos álcool-ácido resistentes. Resultado Número de micro-organismos objetiva 100X Negativo 0 Duvidoso, repetir a coloração 1-2/300 campos + (raros) 1-9/100 campos ++ (alguns) 1-9/10 campos +++ (frequentes) 1-9/ campo ++++ (numerosos) > 9/ campo Fonte: adaptada de <http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/microbiologia/mod_6_2004.pdf> 63 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL │ UNIDADE IV Métodos para tratamento das amostras para cultura Algumas amostras podem apresentar flora mista de bactérias e devem ser tratadas para minimizar o crescimento destes microrganismos contaminantes, que crescem rápido, impossibilitando o crescimento das micobactérias (Anvisa). Quadro 8. Materiais que devem ou não ser tratados antes de serem semeados nos meios apropriados. Material Processado Não processado Escarro X Lavado bronco-alveolar X Líquor X Sangue X Pele X Biópsias X Lavado gástrico X Urina X Fezes X Medula óssea X Fdonte: adaptada de <http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/microbiologia/mod_6_2004.pdf> Culturas para isolamento de micobactérias Existem alguns meios de cultura que são mais frequentemente usados no cultivo de micobactérias: » Meios sólidos: Lowenstein-Jensen: › Middlebrook 7H10,7H11. » Meios líquidos: Middlebrook 7H9; › Bacted 12B; › Bactec 13A, MGIT; › ESP Myco, MB/BACT; › Bactec Myco Lytic. 64 CAPÍTULO 3 Baciloscopia, cultura do material biológico e testes bioquímicos para identificação bacteriana Baciloscopia A baciloscopia é um exame microscópico para o diagnóstico da tuberculose. É um exame de fácil execução e baixo custo o qual acompanha a eficácia do tratamento por meio da redução da carga bacilar no paciente. Apesar do baixo custo e fácil execução, a baciloscopia possui baixa sensibilidade (25% a 65%) se comparado com a cultura, pois o número de bacilos para que se tenha um resultado positivo de baciloscopia varia de 5.000 a 10.000 bacilos/mL da amostra. Existem algumas técnicas para esse exame, porém, a mais utilizada no Brasil para a observação de micobactérias é a técnica de Ziehl-Neelsen. Como visto, as micobatérias apresentam-se como bastonetes delgados, ligeiramente curvos, isolados, aos pares ou em grupos e corados em vermelho (devido a ação da fucsina) sobre um fundo azul. Na coloração pelo método de Ziehl-Neelsen o resultado é apresentado sob a forma de índice baciloscópico – IB – numa escala que varia de 0 a 6+. Figura 25. Baciloscopia. Fonte disponível em: <http://es.slideshare.net/normagarciiadeleon/tincin-de-ziehl-neelsen> 65 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL │ UNIDADE IV A baciloscopia possui grande importância no diagnóstico, distinguindo os doentes em dois grupos: » Paucibacilares: nenhum bacilo é encontrado. Esse resultado é correspondente às formas indeterminadas do tuberculoide. » Multibacilares: é encontrado um ou mais bacilos. Às vezes é encontrado aglomerados de bacilos – correspondem as formas dimorfas e virchowiana. Cultura de material biológico e testes bioquímicos para identificação bacteriana Existem vários tipos de cultura de material biológico. A determinação de cada uma delas depende da amostra a ser analisada e do exame requerido para o diagnóstico. A semeadura adequada é uma etapa importante na rotina microbiológica. Também é importante a seleção correta do meio de cultura e metodologia para cada procedimento. Existem duas técnicas básica de semeadura: » Semeadura quantitativa: com uma alça calibrada flambada, fazer o inóculo inicial traçando uma linha reta central. Em seguida, traçar estrias verticais a essa linha central e em zig-zag na superfície do meio. » Semeadura por esgotamento: descarregar o material em uma determinada área e fazer estrias (segunda área) a partir dessa primeira área. A partir dessa segunda área, fazer novas estrias de forma ampla a fim de obter isolamento bacteriano. Figura 26. Semeadura quantitativa. Fonte adaptada e disponível em: <http://prokariotae.tripod.com/manual_modulo_3.pdf> 66 UNIDADE IV │ DIAGNÓSTICO LABORATORIAL Figura 27. Semeadura qualitativa. Fonte adaptada e disponível em: <http://prokariotae.tripod.com/manual_modulo_3.pdf> Os métodos bioquímicos para a identificação de micobactérias são baseados em características fenotípicas, como o estudo dos ácidos micólicos presentes na parede celular. Estafilococos e estreptococos O gênero Staphylococcus apresenta 32 espécies e 14 subespécies, no entanto, somente 15 espécies são encontradas em amostras humanas. Para a identificação, os estafilococos são divididos em coagulase positivos e coagulase negativos, de acordo com a resposta ao teste da plasmo coagulase. Um dos testes mais importantes na identificação da família Staphylococcaceae é a prova da catalse, mas também são utilizados testes de motilidade e oxidase. A identificação de S. aureaus é basicamente feito pela prova da coagulase (em tubo ou lâmina). Os estreptococos podem ser diferenciados com sua aparência na placa de ágar sangue após incubação a 35°C em presença de 5% de CO2, podendo apresentar hemólise total (beta), parcial (alfa, de cor esverdeada) ou nenhuma (gama). O teste da DNAse consiste na inoculação de colônias em meio contendo DNA (DNA-se teste Ágar). 67 UNIDADE V PRINCIPAIS MICOBACTÉRIAS DE INTERESSE CLÍNICO CAPÍTULO 1 Mycobacterium tuberculosis No Brasil, a tuberculose é um sério problema de saúde pública, com profundezas sociais. A cada ano, são notificados aproximadamente 70 mil casos novos e ocorrem4,6 mil mortes em decorrência da doença. O Brasil ocupa o 17o lugar entre os 22 países responsáveis por 80% do total de casos de tuberculose no mundo (Portal da Saúde – SUS). Como visto, o grupo das micobactérias inclui o Mycobacterium tuberculosis, patógeno que causa a tuberculose. M. tuberculosis é um bastonete delgado, aeróbico obrigatório. Os bastonetes crescem lentamente (20 horas ou mais de tempo de geração), algumas vezes formam filamentos e tendem a crescer em cachos. Na superfície de um meio líquido ser crescimento parece ter a forma de um bolor, o que sugeriu o nome do gênero Mycobacterium (myco = fungo). A Tuberculose (TB) ou bacilo de Koch é uma doença infecciosa e transmissível que geralmente acomete os pulmões, no entanto, pode atingir qualquer região do corpo, como por exemplo, os rins e o sistema nervoso central (SNC). Existe tratamento para a doença, mas quando não tratada pode ser fatal. Essas bactérias podem sobreviver por semanas em escarro seco e são muito resistentes aos antimicrobianos químicos usados como antissépticos e desinfetantes. Diversos testes que têm sido introduzidos são capazes de detectar M. tuberculosis diretamente de escarro ou outros tipos de amostras. Um deles é a reação de polimerase em cadeia (PCR). 68 UNIDADE V │ PRINCIPAIS MICOBACTÉRIAS DE INTERESSE CLÍNICO Figura 28. Morfologia Mycobacterium tuberculosis. Fonte: adaptada de Tortora et al, 2012 HIV e TB são quase inseparáveis. TB é a doença que lidera diretamente as causas de morte na maioria da população mundial infectada pelo HIV. Patogênese da tuberculose Um fator importante na patogênese da micobactéria é o fato de que o ácido micólico da parede celular estimula bastante a resposta inflamatória dos hospedeiros. Entretanto, pessoas mais saudáveis irão bloquear uma infecção potencial com macrófagos ativados, especialmente se a dose infectante for baixa. Segundo Tortora et al (2012), durante a patogênese da tuberculose deve-se legar em consideração os seguintes fatos: » Se a infecção progredir, o hospedeiro isola os patógenos em uma lesão fechada, denominada tubérculo (protusão ou massa), uma característica que dá à doença seu nome. » Quando a doença é interrompida neste ponto, as lesões cicatrizam lentamente, tornando-se calcificadas. Elas são mostradas claramente nos raios X e são denominadas complexos de Ghon (a tomografia computadorizada (TC) é mais sensível que os raios X para detectar lesões por tuberculose). » Se as defesas do corpo falham nesse estagio, o tubérculo se rompe e libera bacilos virulentos nas via aéreas do pulmão, e então nos sistemas cardiovascular e linfático. 69 PRINCIPAIS MICOBACTÉRIAS DE INTERESSE CLÍNICO │ UNIDADE V Figura 29. Patogênese da Tuberculose. Capilar sanguíneo Interior do alvéolo Paredes alveolares Bacilo no interior do tuberculo Macrófago alveolar Bronquíolo Macrófagos in�ltrantes (não ativado) Tubérculo inicial Tubérculo bacilar Centro caseoso Macrófagos ativados Linfócitos Camada externa do tubérculo maduro Cavidade tuberculosa Bacilos do tubérculo Ruptura da parede do bronquíolo Fonte: adaptada de Tortora et al., 2012 Diagnóstico da tuberculose O teste cutâneo da tuberculina é um teste de triagem para a detecção da infecção. Assim, um teste considerado positivo não significa, necessariamente, que a doença esteja ativa. 70 UNIDADE V │ PRINCIPAIS MICOBACTÉRIAS DE INTERESSE CLÍNICO Como pessoas com tuberculose respondem com imunidade mediada por células contra a bactéria (o patógeno está localizado principalmente dentro dos macrófagos). Essa imunidade que envolve células T sensibilizadas é a base para o teste de tuberculina. Durante esse teste, uma proteína da bactéria da tuberculose é injetada cutaneamente na pessoa. Se a pessoa foi infectada, as células T sensibilizadas reagem com as proteínas injetadas e ocorre uma hipersensibilidade em cerca de 48 horas. Essa reação surge com um endurecimento e avermelhamento no local em torno da injeção. Figura 30. Teste positivo da Tuberculina. Fonte: adaptada de Tortora et al., 2012 Tratamento da tuberculose A isoniazida (INH) é uma droga antimicrobiana sintética altamente eficiente conta M. tuberculosis. O efeito principal da INH é a inibição da síntese de ácido micólico, o componente celular encontrado apenas em micobactérias. Assim, esta droga tem pouco efeito sobre bactérias de outros gêneros. Quando utilizada no tratamento da tuberculose, a INH em geral é administrada juntamente com outras drogas, como a rifampicina ou etambutol. Devido ao fato de que o bacilo da tuberculose normalmente é encontrado apenas no interior de macrófagos ou profundamente inserido em tecidos, qualquer droga antimicobacteriana precisa ser capaz de penetrar esses sítios. O etambutol é uma droga efetiva apenas contra micobactérias. Aparentemente, a droga inibe a incorporação de ácido fenólico à parede celular. Por ser uma droga antimicobacteriana relativamente fraca, seu principal uso é como droga secundária para evitar problemas de resistência. O tratamento é demorado, pois o bacilo cresce muito lentamente ou pode estar em estado dormente (muitos antibióticos são efetivos somente quando as células estão em 71 PRINCIPAIS MICOBACTÉRIAS DE INTERESSE CLÍNICO │ UNIDADE V crescimento. O tratamento recomendado pela Organização Mundial da Saúde (OMS), requer a adesão dos pacientes a um mínimo de seis meses de antibioticoterapia. Porém, como muitos pacientes perdem a confiança em seguir um regime tão prolongado, há um aumento da emergência de resistência (TORTORA et al., 2012). Mycobacterium bovis causa tuberculose bovina e pode ser transmitido aos seres humanos pelo leite não pasteurizado. 72 CAPÍTULO 2 Mycobacterium leprae M. leprae é o bacilo causador da lepra. Esse organismo foi isolado e identificado em torno de 1870 por Gerhard A. Hansen. Desse modo, a doença ficou conhecida como hanseníase ou, mais formalmente, como lepra. O microrganismo causador da lepra geralmente é crescido em tatus, pois têm uma temperatura corporal relativamente baixa. A temperatura ótima de crescimento é de 30°C, mostrando preferência por partes frias e mais externas do corpo. M. leprae consegue sobreviver à ingestão por macrófagos e invadem as células da bainha de mielina do SNP, causando danos aos nervos a partir de uma resposta imune celular. O tempo de geração deste é microrganismo é extremamente lento, levando cerca de 12 dias. Assim, como o M. tuberculosisis, M. leprae também é identificado por meio da coloração álcool-ácido resistente, pois estão intimamente relacionados. A doença pode apresentar quatro formas clínicas: indeterminada, bordeline ou dimorfa, tuberculoide e virchowiana. No entanto, em termos terapêuticos somente dois tipos são considerados: a forma tuberculinoide (neural) e a forma lepromatosa (progressiva). A forma tuberculinoide é caracterizada por áreas da pele que perderam a sensibilidade e são rodeadas por uma borda de nódulos e ocorre em pessoas com reações imunes eficazes – a recuperação pode ocorrer de forma espontânea. Já a forma lepromatosa, as células são infectadas há a formação de nódulos pelo corpo. As membranas mucosas do nariz são afetadas e a ocorre a deformação das mãos com possibilidade de necrose. Pessoas com esse tipo de lepra têm pouca resposta imune eficaz. Figura 31. Lepra tuberculoide (neural). Fonte: adaptada de Tortora et al., 2012 73 PRINCIPAIS MICOBACTÉRIAS DE INTERESSE CLÍNICO │ UNIDADE V Figura 32. Lepra Lepromatosa (progressiva). Fonte: adaptada de Tortora et al., 2012 Sintomas » Manchas na pele de cor parda, esbranquiçadas ou eritematosas, às vezes pouco visíveis e com limites imprecisos; » alteração da temperatura no local afetado pelas manchas;» comprometimento dos nervos periféricos; » dormência em algumas regiões do corpo causada pelo comprometimento da enervação. A perda da sensibilidade local pode levar a feridas e à perda dos dedos ou de outras partes do organismo; » aparecimento de caroços ou inchaço nas partes mais frias do corpo, como orelhas, mãos e cotovelos; » alteração da musculatura esquelética principalmente a das mãos (“mãos de garra”); » infiltrações na face que caracterizam a face leonina característica da forma virchowiana da doença. Tratamento Ambos os tipos (paucibacilar e multibacilar) são tratados com o antibiótico rifampicina, durante seis meses no tipo paucibacilar e um ano no tipo multibacilar. A medicação é fornecida gratuitamente pelo Ministério da Saúde e administrada em doses vigiadas 74 UNIDADE V │ PRINCIPAIS MICOBACTÉRIAS DE INTERESSE CLÍNICO nas Unidades Básicas de Saúde sob a supervisão de médicos ou enfermeiros de acordo com normas da OMS (VARELLA, D.). A rifampicina elimina 90% dos bacilos. Por isso, é necessário complementar o tratamento com outra droga (DDS), que pode ser tomada em casa diariamente, até o final do tratamento. Nos casos multibacilares, esse tratamento é acrescido de uma dose diária e de outra vigiada de clofazimina (VARELLA, D.). O teste lepromínico: teste na pele que determina a presença de anticorpos contra Mycobacterium leprae, agente causador da lepra. Mycobacterium leprae causa lepra, ou hanseníase. O M. leprae nunca foi cultivado em meio artificial, podendo ser cultivado em tatus e nas patas de camundongos. A forma tuberculoide da doença é caracterizada pela perda de sensação na pele circundada por nódulos. Na forma lepromatosa, ocorrem nódulos disseminados e necrose tecidual. A lepra não é altamente contagiosa, sendo transmitida pelo contato prolongado com exsudatos. Pessoas não tratadas geralmente morrem de complicações bacterianas secundárias como a tuberculose. O diagnóstico laboratorial tem como base a observação de bacilos ácido-resistentes em uma biópsia de pele Pacientes com lepra são tratados com drogas sulfonas. 75 CAPÍTULO 3 Micobactérias atípicas As micobactérias atípicas foram isoladas de fontes humanas. Elas possuem variáveis graus de patogenicidade, sendo que a maioria ocorre no meio ambiente (patógenos oportunistas e não facilmente transmitidos de uma pessoa para outra). O gênero Mycobacterium é constituído por espécies do complexo M. tuberculosis (CMTB) (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis-BCG, M. africanum, M. microti), M. lepare e outras que atualmente são denominadas micobactérias não tuberculosas (MNT) ou micobactérias atípicas, as quais possuem diferentes características fenotípicas, genéticas e patogênicas. Até o momento mais de cem MNT foram descritas. Essas espécies, geralmente oportunistas, são classificadas, conforme sua capacidade de causar doença no homem, como potencialmente patogênicas e não patogênicas. As MNT potencialmente patogênicas podem causar diversas formas de doença, inclusive a forma disseminada, acometendo pulmões, gânglios, pele, articulações. Essas infecções, caso não sejam adequada da maneira correta, podem ser fatais ou causar sequelas. Das espécies potencialmente patogênicas, aquelas pertencentes ao complexo M. avium e M. Kansasii são as mais frequentemente isoladas. A identificação das MNT pode ser baseada em testes fenotípicos (como tempo de crescimento, produção ou não de pigmentos, provas bioquímicas, crescimento ou não na presença de inibidores químicos) e testes moleculares (como PCR, análises de restrição, sondas genéticas) (TORTOLI, 2003). De acordo com as características fenotípicas as MNT podem ser classificadas em quatro grupos divididos em duas características, de acordo com Runyon (1959): 1. produção de pigmentos (acromógenas, fotocromógenas e escotocromógenas); 2. tempo de crescimento em meio de cultura (rápido quando ocorre crescimento em meio sólido antes de sete dias e lento se ocorrer em sete dias ou mais). A classificação atual ainda é fundamentada em Runyon (1959) e também baseada em características morfológicas, fisiológicas e bioquímicas das micobactérias juntamente com evidências antigênicas e informações genômicas obtidas por meio de técnicas 76 UNIDADE V │ PRINCIPAIS MICOBACTÉRIAS DE INTERESSE CLÍNICO de biologia molecular. As MNT também podem ser classificadas de acordo com sua capacidade de causar doença no homem, sendo consideradas patogênicas e não patogênicas. As MNT classificadas como potencialmente patogênicas podem causar várias doenças nos homens e animais, diferindo na severidade e importância em saúde pública. O quadro abaixo mostra a classificação das espécies de MNT de acordo com a patogenicidade. Quadro 9. Classificação das espécies de MNT de acordo com a patogenicidade. MNT Potencialmente Patogênicas MNT Raramente Patogênicas M. abscessus M. agri M. asiaticum A. aurum A. avium M. branderi A. avium subsp. paratuberculosis M. chitae M. celatum M. duvalli M. chelonae M. fallax M. fortuitum M. flavescens M. genavense M. gastri M. haemophilum M. gordonae M. immunogenum M. hassiacum M. intracellulare M. mageritense M. kansasii M. neoaurum M. lentiflavum M. nonchromogenicum M. malmoense M. phlei M. marinum M. porcinum M. mucogenicum M. pulveris M. peregrinum M. smegmatis M. scrofulaceum M. terrae M. shimoidei M. triviale M. simiae M. vaccae M. szulgai M. ulcerans M. xenopi Fonte: Tabela adaptada de Leão et al., 2004 Complexo Mycobacterium avium O complexo Mycobacterium avium (MAC), juntamente com outras espécies micobacterianas atípicas denominadas de micobactéerias não tuberculosas (MNT). Esse complexo é constituído consiste pelas espécies: M. avium, M. intracellulare, M. colombiense e M. chimaera. São microrganismos que possuem crescimento lento, são 77 PRINCIPAIS MICOBACTÉRIAS DE INTERESSE CLÍNICO │ UNIDADE V naturalmente encontradas no meio ambiente, possuem colônias lisas e não pigmentadas. São capazes de causar infecções em diversas espécies de seres vivos, incluindo aves, suínos e humanos – podendo se apresentar como assintomáticas. O MAC representa um importante grupo de micobactérias associadas em pacientes com Aids, ou seja é um patógeno pulmonar que afeta indivíduos imunocomprometidos. MAC é a causa mais comum de infecção por micobactéria não tuberculosa em pacientes com AIDS e/ou linfoma cujo CD4 está abaixo de 50 células/μL. Apesar do MAC causar a uma infecção bacteriana que pode causar sintomas graves em pessoas que tem o sistema imunológico comprometido, pessoas que possuem o sistema imunológico saudável também podem ser infectadas. No entanto, normalmente os sintomas que se desenvolvem envolvendo os pulmões, não oferecem risco de vida. Geralmente, pessoas com doenças relacionadas ao HIV em estagio avançado, o MAC não envolve os pulmões. Ao invés disso, ele causa doenças em outros órgãos, incluindo fígado, baço e a medula óssea, sendo considerada uma doença disseminada. As fontes de MAC são solo, aves, água, poeira. O complexo é transmitido via inalatória para o trato respiratório e gastrintestinal. Os sintomas da doença se assemelham aos da tuberculose e o tratamento é feito com 2 ou 3 antibióticos. Mycobacterium kansasii Na antiga classificação de Runyon (1954), o Mycobacterium Kansasii é classificado como fotocromogênico patogênico, associado a doenças pulmonares. São microrganismos capazes de produzir pigmento amarelo ou laranja quando expostos à luz. Assim como em outras espécies, infecções por M. kansasii caracterizada por nódulos sub cutâneos ou abscessos. Normalmente o teste de sensibilidade não é necessário com esta espécie, pois o M. kansasii responde bem ao tratamento com isoniazida,rifampicina e etambutol. 78 Para (não) Finalizar A vacinação é um dos métodos desenvolvidos de extrema importância para a prevenção de doenças infecciosas. As vacinas estimulam o sistema imunológico a produzir anticorpos contra vírus e bactérias, protegendo o indivíduo de determinadas doenças. Quando esses microrganismos, normalmente presentes no meio ambiente, entram em contato com o organismo de uma pessoa vacinada, encontram o sistema de defesa pronto para combatê-los. Porém, para que isso aconteça de forma adequada, as vacinas devem ser aplicadas em determinadas idades, de acordo com o calendário de vacinação. Existem diferentes tipos de vacinas, como por exemplo, as vacinas vivas atenuadas e as vacinas mortas ou inativadas. Vacinas vivas atenuadas O microrganismo é obtido a partir de um indivíduo ou animal infectado e é atenuado por passagens sucessivas em meios de cultura ou culturas celulares. Essa atenuação diminui o poder infeccioso do microrganismo. Assim, o microrganismo em questão mantém a capacidade de se multiplicar em um indivíduo vacinado, porém sem causar a doença. A desvantagem das vacinas vivas atenuadas é o risco de poder induzir sintomas ligeiros da doença que se pretende evitar e o risco de infecção do feto quando administrada em mulheres grávidas. Exemplos de vacinas vivas atenuada são: » BCG – vacina contra a tuberculose. » Vacina contra o rotavírus. » Vacina contra a varicela. » VASPR – vacina contra o sarampo, papeira e rubéola. » Vacina contra a febre amarela. 79 PARA (NÃO) FINALIZAR A vacina BCG para a tuberculose consiste em uma cultura viva avirulenta de M. bovis. Vacinas mortas ou inativadas Nas vacinas mortas ou atenuadas os microrganismos são mortos por agentes químicos. A vantagem desse tipo de vacina é a ausência do poder infeccioso do agente devido a incapacidade de multiplicação do organismo no indivíduo vacinado, não provocando a doença. Porém, como as características imunológicas são mantidas, existe a proteção contra essa doença. A desvantagem dessa vacina é a indução de uma resposta imunitária que nem sempre é ótima. Dentre as vacinas inativadas pode-se encontrar: 1. Inteiras As vacinas inteiras são de vírus ou bactérias intactas. Alguns exemplos são: vacina contra a hepatite A, vacina contra a encefalite japonesa, vacina contra a cólera, vacina contra a raiva. 2. Fragmentadas Contém pequenas frações ou porções de vírus ou bactérias. Alguns exemplos são: vacina contra a cólera, vacina antigripal, vacina contra o tétano, vacina contra a difteria, vacina antipneumocócica de 23 serotipos, vacina contra o Haemophilus influenzae tipo b. Por fim, existem vacinas desenvolvidas por meio da recombinação genética. Estas vacinas são produzidas através de técnicas de biologia molecular e engenharia genética – o antígeno é expresso por outros micro-organismos. Alguns exemplos são: vacina contra a hepatite B e vacina contra o papilovírus humano (HPV). 80 Referências DILTOR, Vladimir Araujo; OPROMOLLA, Ida Maria; FOSCHIANI, Dias Baptista. Micobactérias. Disponível em: <http://hansen.bvs.ilsl.br/textoc/livros/ OPROMOLLA_DILTOR_nocoes/PDF/micro.pdf>. Acesso em: 15 mar. 2016. AUGUSTO, C. Célula: a unidade da vida. CNEC - Campanha Nacional de Escolas da Comunidade Colégio Cenecista Capitão Lemos Cunha. Disponível em: <http://www. novarevelacao.org/pesquisando/org/eng/celula.pdf>. Acesso em: 15 mar. 2016. BOMBARDA, S., et al. Recomendações para o diagnóstico e tratamento das micobacterioses não tuberculosas no estado de São Paulo. Disponível em: <http://www.cve.saude.sp.gov.br/htm/TB/mat_tec/TB11_3MNTSB.pdf>. CERQUEIRA, A. Apostila de Aulas Práticas. Universidade Federal Fluminense. 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