08- Provas Bioquímicas

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Diagnóstico Microbiológico
Quando há suspeita de doença microbiana é retirada uma amostra (urina, vezes, escarro) que é analisada em um laboratório de microbiologia para ser processado e analisado de acordo com testes microbiológicos.
Hoje temos a presença da automação, o profissional deve saber como funciona a máquina e deve saber proceder também sem a máquina.
O diagnóstico visa atingir dois objetivos principais: identificar o agente causador da doença e saber como proceder para eliminar o microorganismo, testando antibióticos.
O diagnóstico começa na coleta do material a ser analisado e no seu transporte.
1- Métodos de Diagnóstico Microbiológico
O primeiro passo do diagnóstico é a coleta e transporte do material.
No laboratório, o primeiro passo é a coloração de gram.
Deve-se cultivar o material em meio de cultura apropriado (meio sintético, meio rico, seletivo, diferencial...) de acordo com o que deve se analisar.
Após, as colônias devem ser isoladas (diluição ou esgotamento) dependendo do que deve se analisar.
Com a obtenção de culturas puras, devem ser feitos os testes adequados e o teste de antibióticos (antibiograma).
1.1- Métodos Fenotípicos
Testes que evidenciam características de um determinado microorganismo.
 Pode se obervar degradação de carboidratos e estruturas morfológicas das bactérias.
Utilizado na maior parte dos laboratórios, por ser mais fácil e barato de realizar.
A maioria das máquinas faz a identificação fenotípica do microorganismo.
1.1.1- Coloração de Gram
Método fenotípico, pois por ele observamos o tipo de bactéria (coco, bacilo, gram positiva, gram negativa...).
É o primeiro teste a ser realizado, não podendo outro teste substituí-lo.
É muito importante porque identifica características importantes de um microorganismo, podendo em caso de diagnóstico médico de emergência direcioná-lo mais rapidamente a um tratamento até que se confirme a doença.
1.1.2- Provas bioquímicas
Classificação das bactérias de acordo com as características bioquímicas.
- Vias metabólicas para obtenção de energia
- Enzimas específicas utilizadas no metabolismo dos diferentes substratos contidos no meio de cultura
As máquinas auxiliam muito nessas provas, porque permite analisar muito mais amostras do que um profissional sozinho, então sua maior vantagem é a rapidez nos processos.
Mesmo assim, as máquinas não substituem o microbiologista, porque devem ser programadas e ter seus resultados analisados por um profissional.
Há vários testes para cada grupo microbiano.
São usadas de acordo com os resultados obtidos com as colorações e os cultivas.
Alguns se baseiam no metabolismo, outros em propriedades enzimáticas.
1.1.2.1- Testes por Tipos de Metabolismo
1.1.2.1.1- Teste de fermentação de carboidratos (TSI)
Utilizado em bactérias gram negativas entéricas, que provocam doenças gastrointestinais como diarréia.
Meio de cultura muito usado para observar o metabolismo de bactérias para carboidratos presentes no meio a ser cultivado.
É usado meio sólido preparado (é um pó comercializado que deve ser diluído em água) em um tubinho que solidificará o meio estando inclinado.
Este meio, quando não possui microorganismos, possui coloração avermelhada.
O meio é composto por três açúcares, glicose (1g), lactose (10g) e sacarose (10g), podendo ser observar as bactérias que fermentam todos ou apenas glicose e lactose.
Por possuir menos glicose, quando o meio é preparado, essa substância vai para o fundo do tubo, por essa razão são analisados separadamente, glicose na parte de baixo, lactose na parte de cima.
A bactéria deve ser inoculada tocando na colônia com a agulha e depositando no meio (tubo) furando o meio sem tocar na base e fazendo uma estria, espalhando o material na parte inclinada do meio.
Depois da inoculação o meio deve ser encubado em uma estufa. Bactérias de importância média são encubados em aproximadamente 37º, a temperatura aproximada do corpo humano.
Analisam-se os microorganismos que fermentam glicose e lactose por que se um microorganismo fermentar um desse ou os dois eles automaticamente fermentam a sacarose.
O meio TSI (triple sugar iron) também possui ferro (sulfato ferroso) e enxofre (tiosulfato de sódio).
Alguma bactérias podem produzir um gás H2S (gás sulfídrico) a partir do enxofre fazendo precipitar o ferro, há pigmento preto no meio. Esse pigmento preto só aparece em meio ácido então se ele aparece assumimos automaticamente que a bactéria fermenta glicose.
Quando o meio apresenta pigmento amarelo, isso indica que a bactéria fermenta, produzindo metabólitos que diminuem o pH do meio, mudando a cor.
Algumas bactérias produzem gás carbônico, fazendo que o meio se quebre e tenha alguns espaços.
Quando a bactéria não fermenta nenhum dos presentes, o meio não muda de cor.
- Bactéria fermenta glicose + sacarose: amarelo no fundo.
- Bactéria fermenta lactose + sacarose: amarelo no ápice.
- Bactéria produz H2S + fermentação da glicose: formação de pigmento preto.
- Não fermenta nada que está no meio: meio avermelhado (cor não se altera)
1.1.2.1.2- Teste de Utilização do Citrato
Teste importante para enterobactérias.
Também cultivado em tubos com a presença do citrato como única fonte de carbono.
Se a bactéria utiliza o citrato como fonte de carbono ela crescem muito bem no meio e produz aminas alcalinas que aumentam o pH mudam a cor do meio de verde para azul.
1.1.2.1.3- Ágar EMB
Meio seletivo e diferencial.
A E coli fermenta lactose. Ela cresce bem nesse meio, produz bastante ácido e suas colônias assumem um brilho metálico.
1.1.2.2- Testes por atividade enzimática
1.1.2.2.1- Teste da Catalase
Teste importante para cocos.
A catalase é uma enzima importante no metabolismo microbiano.
Ela diferencia dois grandes grupos de bactérias, separando estafilococos (catalase positivos) e estreptococos (catalase negativo).
Por sua importância, é o segundo teste a ser realizado, logo após a coloração de Gram.
A catalase converte peróxido de hidrogênio em oxigênio e água.
Para o teste em uma lâmina de microscopia é pingada algumas gotas de peróxido de hidrogênio. Toca-se na colônia com um palito e depois é esfregado no peróxido de hidrogênio. Se isso produzir bolhas, é que a bactéria possui catalase, é uma estafilococos.
O teste não deve ser feito direto no ágar sangue, nem ser utilizado material metálico.
1.1.2.2.2- Teste da Coagulase
Separa dentro do grupo dos estafilococos os estafilococos áureus (coagulase positiva), e demais estafilococos (coagulase negativa).
A coagulase é uma enzima importante para a bactéria escapar de situações no organismo humano, fazendo coágulos de fibrina para se proteger de antibióticos ou da fagocitose.
Converte fibrinogênio em fibrina que é o coágulo.
Pode ser feito em dois testes:
- Coagulase livre: É feito em tubos (mais eficientes). É colocado meio mL de plasma em dois tubos, inocula a bactéria e de 4 em 4 hrs observa o crescimento de coágulos ou não. Deve ser verificado em tempo específico porque os estafilococos também possuem substâncias que dissolvem os coágulos, podendo atrapalhar a análise caso se demore muito para observar.
- Coagulase ligada: É feito em lâmina. Pinga-se uma gota de plasma (é vendido comercialmente), toca na colônia, toca-se novamente no plasma. Se formar coágulos, temos estafilococos áureus (coagulase positiva).
1.1.3- Antibiograma
Teste que analisa a sensibilidade ou resistência de um microorganismo a uma droga para o tratamento correto da doença.
É feito depois que se sabe qual é a bactéria que se trata.
1.1.3.1- Difusão em Disco (Kirby e Bauer)
Método mais utilizado.
Método qualitativo.
Em uma placa (uma placa para cada bactéria), toca-se na colônia faz uma suspensão, com o swab semeia a suspensão, aplica nos discos e incuba a placa. Uma medição dará o resultado se é resistente ou não.
A partir deste teste não fica certo à qual quantidade de antibiótico a bactéria é resistenteou não.
No Brasil utilizamos os parâmetros Americanos de como preparar o antibiograma. É um manual de como fazer e interpretar o antibiograma.
Alguns laboratórios utilizam o meio europeu.
Utiliza-se para o antibiograma:
- Placa grande contendo o meio de cultura.
- Pinça
- Swab
- Suspensão bacteriana
- Discos de antimicrobiano
Os discos são esferas de papel de filtro embebidos no antibiótico. Ele se difunde assim que entra em contato com a placa. Em cada frasco há um tipo de antibiótico diferente em uma mesma quantidade.
1º Passo – Preparar a suspensão bacteriana: É necessário um parâmetro. É feito em solução salina fisiológica (NaCl em água, vendido comercialmente mas também pode ser preparado e autoclavado). É neccesário fazer um inóculo padrão, tendo a solução salina 10-8 UFC. Para isso é usada a escala McFarland (disponível a venda), que é uma suspensão clara de geralmente sulfato de bário em várias concentrações. É usado a 05 McFarland equivalendo a 10-8 para o antibiograma. 
2º Passo – Inoculação: É preparado então o inóculo comparando-o com o estado do tubo com McFarland, quanto turvo está. Depois de preparado o inóculo, toca-se na colônia e inoculando na suspensão.
3º Passo – Inoculação em meio de cultura: Mergulhar o swab no tubo para semear na placa. É usado uma placa grande em meio de cultura Mueller Hinton de 4mm (é usado por ser um meio de cultura onde grande parte das bactérias de importância médica se desenvolvem bem). Para semear o swab é esfregado na placa em três posições diferentes de modo a cobrir toda a superfície da placa. Deixar secar.
4º Passo – Discos de Antibiótico: São aplicados com uma pinça sobre a placa. Após isso, virar a placa ao contrário e colocar na estufa.
Observamos onde a bactéria parou de crescer quando em torno do disco de antibiótico ela não cresceu.
É necessário medir o halo com uma régua específica e a partir da medida consultar a tabela do CLSI para saber a sensibilidade ou resistência de acordo com o halo.
Antimicrobianos são substância químicas, podendo ser sintéticos, mas alguns como a penicilina, são produzidos por microorganismos, no caso fungos. Algumas penicilinas podem ser semi sintéticas para aumentar seu espectro de ação.
São capazes de matar (bactericidas) ou inibir o crescimento (bacteriostáticas), tratando as infecções.
Possuem diferentes classes e diferentes alvos.
1.2- Métodos Genotípicos
Trabalham com a base genética de um microorganismo, a biologia molecular.
Utilizado em laboratórios mais avançados.