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Aplicações Enzimáticas Maria Alice Zarur Coelho Priscilla Filomena Fonseca Amaral Programa de Pós-graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos Introdução Enzimas podem ser aplicadas em várias áreas: • Indústria de curtumes, • Indústria têxtil, • Indústria de papel e celulose, • Produção de detergentes, • Indústria de alimentos, • Óleos e gorduras, • Produção de álcool, • Indústria de Cosméticos, • Biossensores, • Em análises, • Em medicina Aplicações Enzimáticas - Panificação, - Cervejaria, - Sucos - Vinho - Laticínios - Modificação de Proteínas Introdução Aplicações Enzimáticas Indústria Consumo em % Detergentes 40 – 45 Processamento do amido 20 – 25 Laticínios 12 – 15 Cervejarias 2 – 4 Suco de frutas e vinho 3 – 5 Panificação 1 – 2 Têxtil e papel 4 – 6 Couro 1 – 2 Outras 6 – 10 Principais indústrias consumidoras de enzimas: Produção de detergentes • Aplicação mais conhecida das enzimas (desde os anos 60) • Detergentes industriais com enzimas: - Lavagem de roupas em domicílio – segmento mais importante - Lavagem de roupas industriais e institucionais - Lavagem de pratos e talheres em domicílios • Enzimas em detergentes atuam em condições drásticas de meio reacional - Presença de tensoativos, alcalinizantes, perfumes, pigmentos,... - elevado pH, - elevada temperatura • No Brasil: - Organon (1968) - Biopresto (Unilever) - Henkel – Viva (1978-1984) - Gessy lever: Omo (1989) – líder de mercado Aplicações Enzimáticas Produção de detergentes Tipos de enzimas usadas em detergentes • Proteases: - Mais utilizadas em detergentes - Removem manchas de ovo, sangue, suor, extratos vegetais,... - Detergentes sem enzimas: ineficiente para remover manchas de ptn - Proteases Alcalinas: Possuem pH ótimo alcalino e atuam em T elevada (Europa) - Microrganismo produtor: Bacillus sp. Fermentação submersa - Ex.: savinase, alcalase, subtilisin novo Aplicações Enzimáticas - Atuação sinergística: Hidrólise limitada: manchas mais acessíveis Proteínas agem como cola Produção de detergentes Tipos de enzimas usadas em detergentes • Lipases: - Lavagem de roupas em T baixa: difícil remoção de óleo e gorduras - Primeira lipase em detergente: produzida por Humicola lanuginosa - Engenharia genética: gen introduzido em Aspergillus oryzae - LIPOLASE (Novo Nordisk) - 1988 Remove manchas de batom, frituras, azeite, molhos, etc TG Ácidos graxos, mono, di- glicerídeos e glicerol - Estáveis em pH alcalino Aplicações Enzimáticas lipase Produção de detergentes Tipos de enzimas usadas em detergentes • Lipases: - LIPOLASE ULTRA (Novo Nordisk) - 1995 Desempenho melhor em baixas temperaturas (10ºC, ¼ da [lipolase] requerida) Engenharia de proteínas: Lipolase: enzima com 269 aminoácidos; Modificação de um aa próximo ao centro ativo Alteração da força iônica na zona de contato com o lipídeo Aplicações Enzimáticas Asparagina - Leucina neutra Posição 96: Molécula mais hidrofóbica Produção de detergentes Tipos de enzimas usadas em detergentes • Amilases: - Remoção de resíduos de alimentos que contém amido - Amido: atua como cola - Produção por: Bacilus licheniformis, B. amyloliquefaciens - Hidrolisam amido transformando em oligômeros de cadeia curta - Resistência a pH alcalino e T elevadas Aplicações Enzimáticas Produção de detergentes Tipos de enzimas usadas em detergentes • Celulases: - Produzida por Bacillus sp. ou Humicola sp. - pH ótimo = 7; resistente a pH mais elevado - Modificação das fibrilas celulósicas (algodão) Degradam o tecido das roupas de algodão: remoção das fibrilas de celulose - Efeitos: Intensificação da cor Amaciamento Remoção de partículas de sujeiras Aplicações Enzimáticas Produção de detergentes Tipos de detergentes industriais • Detergente em pó: - Década de 60: Enzima em pó adicionada Problema: formação de poeira – reações alérgicas - Aperfeiçoamento das técnicas T-granulado: enzima revestida com substância inerte altamente resistente a impacto e abrasão não forma poeira Tamanho do grânulo: similar às partículas do detergente para não segregar durante o transporte Partículas devem se dissolver rapidamente no líquido Aplicações Enzimáticas Produção de detergentes Tipos de detergentes industriais • Detergente líquido: - Mais difícil preservar a estabilidade da enzima Alta atividade da água pH alcalino Compostos iônicos desnaturantes - Europa: concentração 4-10 g/L com alvejante lavagem com aquecimento - EUA e Japão: concentrações mais baixas alvejante separado Aplicações Enzimáticas Condições favoráveis a autodigestão das proteases (exceto pH 7-8) Produção de detergentes Tipos de detergentes industriais • Detergente para máquinas de lavar louça (automática): - Formulação: metasilicato, fosfatos e cloro alvejante - Metassilicato substituído por disilicato (redução do pH) - Alvejante de cloro e fosfatos abandonados (razão ambiental) Prejuízo no desempenho da lavagem Adição de enzimas (remoção de amido e manchas de proteínas) Aplicações Enzimáticas Produção de detergentes Performance de Lavagem • Quantificação do efeito das enzimas: difícil - Lavagem teste: manchas artificiais (leite, sangue, cacau, etc) aplicação em tecidos de algodão ou poliester - EMPA 116: estudo de remoção de proteína roupa de algodão com leite, sangue e tinta (tinta “colada” pelas ptn´s) Hidrolise da proteína necessária para remoção da tinta Aplicações Enzimáticas enfraquecimento da cor indicador da contribuição da enzima Quantidade de tinta deixada após lavagem Indústria de Curtumes • Couros crus e peles contêm proteínas e gorduras entre as fibras de colágeno; • Cabelo - alfa-queratina: estrutura fibrosa resíduos de cisteína, conformação em alfa-hélice • Pele - colágeno, - alfa-queratina, - elastina - albumina, - globulina, - glicoproteínas • Uso de enzima: hidrólise seletiva dos constituintes não-colagenosos da pele Aplicações Enzimáticas Glicina, alanina, prolina, hidroxiprolina; tríplice hélice Indústria de Curtumes Aplicações Enzimáticas Salga Remolho Desengraxe Depilação Purga Curtimento Pele Couro cru Couro wet-blue Tripsina Lipases Proteases ProteasesÁgua Surfactantes CaI Na2S Cromo Tanino Indústria Têxtil • Fibras naturais: algodão, lã, seda; • Fibras sintéticas: polyester, nylon, lycra Aplicações Enzimáticas Limpeza Fiação Engomagem Tecelagem Chamuscagem Desemgomagem Purga Alvejamento Tingimento Fio Tecido Acabado FibraMatéria-prima Costura Lavagem Tecido Cru Roupa Roupa Acabada Indústria Têxtil • Limpeza: Remover sujeiras do algodão e tornar as fibras paralelas - Liberação de fibras celulósicas: destruição da parede secundária (substâncias pécticas) - Tradicional: soda cáustica sob pressão e temperatura elevada; Problema: segurança e poluição ambiental - Enzimático: uso de enzimas pectinolíticas Busca por microrganismos produtor de pectinase e com baixa atividade de celulases Penicilium Aplicações Enzimáticas Indústria Têxtil • Fibras naturais: algodão, lã, seda; • Fibras sintéticas: polyester, nylon, lycra Aplicações Enzimáticas Limpeza Fiação Engomagem Tecelagem Chamuscagem Desengomagem Purga Alvejamento Tingimento Fio Tecido Acabado FibraMatéria-prima Costura Lavagem Tecido Cru Roupa Roupa Acabada Indústria Têxtil • Desengomagem: Remover goma (fécula de mandioca ou goma sintética) aplicada ao tecido antes da tecelagem - Tradicional: produtos químicos fortes: ácidos, bases ou agentes oxidantes; Problema: segurança e poluição ambiental- Enzimático: uso de enzimas que hidrolisam amido Não causam estragos no tecido Mais utilizadas: alfa-amilases bacterianas termotolerantes Aplicações Enzimáticas Tipo de enzima temperatura de operação (ºC) pH inibidores ativadores Amilase de malte 55-65 4,5-5,5 íons metálicos, alcali, contaminantes do amido íons cálcio Amilase de pâncreas 40-55 6,5-7,0 íons metálicos, ácidos - Amilase fúngica 50-55 4,5-5,5 íons metálicos, alcali, sequestrantes íons cálcio Amilase bacteriana 60-75 5,5-7,0 sequestrantes, surfactantes aniônicos íons cálcio Amilase bacteriana termoestável 85-110 5,0-7,5 surfactantes aniônicos íons cálcio Indústria Têxtil • Desengomagem: Aplicações Enzimáticas Indústria Têxtil • Fibras naturais: algodão, lã, seda; • Fibras sintéticas: polyester, nylon, lycra Aplicações Enzimáticas Limpeza Fiação Engomagem Tecelagem Chamuscagem Desengomagem Purga Alvejamento Tingimento Fio Tecido Acabado FibraMatéria-prima Costura Lavagem Tecido Cru Roupa Roupa Acabada Indústria Têxtil • Alvejamento: Branqueamento do pano - Tradicional: Hipoclorito de sódio, peróxido de hidrogênio; Problema: resíduo pode interferir no processo de tingimento - Enzimático: Catalase para decompor o peróxido de hidrogênio em água e oxigênio. Aplicações Enzimáticas Indústria Têxtil • Fibras naturais: algodão, lã, seda; • Fibras sintéticas: polyester, nylon, lycra Aplicações Enzimáticas Limpeza Fiação Engomagem Tecelagem Chamuscagem Desengomagem Purga Alvejamento Tingimento Fio Tecido Acabado FibraMatéria-prima Costura Lavagem Tecido Cru Roupa Roupa Acabada Indústria Têxtil • Tingimento: - Biopolishing: Tratamento enzimático com celulases (em algodão) Confere uma aparência mais regular e lustrosa Remove o fuzz: filamentos minúsculos da fibra que se projetam para fora da superfície do fio Aplicações Enzimáticas Indústria Têxtil • Tingimento: - Lã: Composta de proteínas Facing up: franzimento da superfície de tecidos de lã Tratamento com proteases Aplicações Enzimáticas Indústria Têxtil • Acabamento do jeans: - Tradicionalmente: Feito pela abrasão com pedra-pomes - Bio-lavagem:Tratamento enzimático com celulase dissolução da tinta azul-índico do brim reduz a quantidade de pedra necessária menor dano às roupas e às máquinas - Celulases usadas: Produzidas por Trichoderma sp. Humicola sp. Aplicações Enzimáticas Indústrias de Papel e Celulose Aplicações Enzimáticas • Matéria-prima: madeira - Celulose Pequenas frações - Hemicelulose + de extrativos - Lignina Processo de remoção da celulose: desintegração da madeira e formação de suspensão de fibras Indústrias de Papel e Celulose Aplicações Enzimáticas Processo Kraft: Cavacos + NaOH + Na2SO4 pH = 8 – 11; T = 55-65oC Indústrias de Papel e Celulose Aplicações Enzimáticas • Descascamento: - Remoção das cascas - Enzimas pectinolíticas: poligalacturonase Indústrias de Papel e Celulose Aplicações Enzimáticas Processo Kraft: - Cavacos + NaOH + Na2SO4 T elevada - Dissolução da lignina - Liberação das fibras de celulose - Pasta de celulose marrom, pH = 8 – 11; T = 55-65oC Indústrias de Papel e Celulose Aplicações Enzimáticas Indústrias de Papel e Celulose Aplicações Enzimáticas • Branqueamento de polpa: - Cloro: mais barato, formação de substâncias cloradas = pressão para redução do uso - Hemicelulose: polímeros de xilana (polímero de xilose) – inibidor do branqueamento (re-precipita sobre as fibras) - Tratamento enzimático: Xilanases sobre a polpa KRAFT - Possibilita: Retirar mais lignina Celulose mais susceptível aos branqueadores químicos Reduz a necessidade de agentes químicos - Xilanase alcalina e termoestável Indústrias de Papel e Celulose Aplicações Enzimáticas Indústrias de Papel e Celulose Aplicações Enzimáticas • Redução do teor de resinas: - Pitch: resinas orgânicas e seus depósitos (ácidos graxos, resinas ácidas, ésteres de ácidos graxos, graxas e ceras) - Glóbulos de pitch: perfuração de máquinas, alteração na qualidade do papel, velocidade de produção, etc - Tratamento enzimático: Lipases - Possibilita: Reduzir os depósitos de pitch aumento na produtividade e qualidade Indústrias de Papel e Celulose Aplicações Enzimáticas Indústrias de Papel e Celulose Aplicações Enzimáticas • Reciclagem de papel: - Celulases e hemicelulases: processamento de fibras secundárias Atuam sobre a superfície das fibras (peeling) - Destingimento Remoção da tinta: solução altamente alcalina – escurecimento da celulose Tratamento enzimático: Celulases alcalinas Não agem sobre a tinta, Agem sobre a celulose que retêm as partículas de tinta do papel (microfibrilas) Indústria de Alimentos Panificação • Células dos grãos de cereais da farinha contém enzimas amilase proteases • Quantidades: nem sempre ideais adição necessária Aplicações Enzimáticas Trigo Fibras, proteFibras, proteíínas, nas, vitaminas e mineraisvitaminas e mineraisCascaCasca Fonte de enzimasFonte de enzimas •• AmidoAmido •• GlGlúútenten • Glutenina: tenacidade e elasticidade • Gliadina: extensibilidade e viscosidade Transformado em farinha no processo de moagem Triticum durum Gluten Triticum aestivum Amido GLGLÚÚTENTEN GLIADINAGLIADINA GLUTENINAGLUTENINA Indústria de Alimentos Aplicações Enzimáticas Panificação Ligação -1,6 Ligação -1,4 Indústria de Alimentos Aplicações Enzimáticas Panificação • O papel das amilases Grânulos de amido amilose amilopectina 15 a 30% 70-85% Amilose: polissacarídeo de cadeia linear - 500 unidades de glicose (ligações do tipo alfa-1,4); estrutura tridimensional: torções ou desdobramentos Amilopectina: Ramificações de 20 a 40 unidades de glicose ligadas entre si através de ligações alfa-1,4, ligada à cadeia principal por ligações alfa-1,6; Indústria de Alimentos Aplicações Enzimáticas Panificação • O papel das amilases • a-amilase: hidrolise do amido em dextrinas • ß-amilase: Obtenção de maltose Indústria de Alimentos Panificação • Fabricação do pão Aplicações Enzimáticas ÁÁguagua Farinha de trigoFarinha de trigo SalSal AAçúçúcarcar FermentoFermento FornoForno COCO22 Problemas:Problemas: • a-amilase pão mole demais e aberto • a-amilase pão “solado” SoluSoluçção:ão: Adição de a-amilase de origem fúngica ou de malte Indústria de Alimentos Panificação • Fabricação do pão Aplicações Enzimáticas ÁÁguagua Farinha de trigoFarinha de trigo SalSal AAçúçúcarcar FermentoFermento FornoForno COCO22 •• Cor da casca do pãoCor da casca do pão •• Massas refrigeradas e congeladasMassas refrigeradas e congeladas AmiloglicosidaseAmiloglicosidase aa--Amilase Amilase AmiloglicosidaseAmiloglicosidase Indústria de Alimentos Aplicações Enzimáticas Panificação •• Retardamento do processo Retardamento do processo de envelhecimentode envelhecimento •• Melhoramento da massaMelhoramento da massa •• BiscoitosBiscoitos Exoamilase Exoamilase maltogênica maltogênica bacterianabacteriana ProteasesProteases PentosanasePentosanase Indústria de Alimentos Aplicações Enzimáticas Panificação Indústria de Alimentos Aplicações Enzimáticas Cervejaria MALTEAÇÃO RECEBIMENTODE MALTE MOAGEM DOMALTE COZIMENTO DO MALTE FILTRAÇÃO DO MACERADO FERVURA DO MOSTO SEPARAÇÃO DO TRUB RESFRIAMENTODO MOSTO FERMENTAÇÃO / MATURAÇÃO FILTRAÇÃO DE CERVEJA ARMAZENAMENTO / ENVIO DE CERVEJA FILTRADA ENVASAMENTO ( -Glucana) (Amido) Cotilédone Casca Endosperma Radícula Epicotiledone Indústria de Alimentos Aplicações Enzimáticas Cervejaria • Maltagem: - Maceração: elevação da umidade - Germinação: ponto ótimo radícula da semente = 2/3 do grão produção enzimática é grande - Secagem: interrupção da germinação sem destruir as enzimas ( - e -amilases) Indústria de Alimentos Aplicações Enzimáticas Cervejaria Componentes Cevada Malte Massa do grão (mg) 32 – 36 29 – 33 Umidade (%) 10 – 14 4 – 6 Amido (%) 55 – 60 50 – 55 Açúcares (%) 0,5 – 1,0 8 – 10 Nitrogênio total (%) 1,8 – 2,3 1,8 – 2,3 Nitrogênio solúvel (% Ntot) 10 – 12 35 – 50 Poder diastasico, °%L 50 – 60 100 – 250 -Amilase (unidades de DE produzidas) Traços 30 – 60 Atividade Proteolítica Traços 15 – 30 Malteação Malte é moído para aquecido e filtrado Mosto tornar elementos constituintes acessíveis à ação enzimática Indústria de Alimentos Aplicações Enzimáticas Cervejaria Malte: único agente sacarificante permitido na fabricação da cerveja; Propostas atuais: substituição por enzimas puras ou substituição por cevada (processo de malteação é caro) Ação das enzimas do malte: a-amilase, ß-amilase e maltase - a-amilase: tem ação sobre as cadeias da amilopectina nas extremidades não- redutoras dando origem a dextrinas (ligações a-1,6), glicose e maltose Preparação do material para a ação da ß-amilase - ß-amilase: tem ação sobre as dextrinas, somente nas ligações a-1,4, gerando maltose, e dextrinas menores - maltase: atua sobre a maltose, gerando glicose. Dextrinas: dão “corpo” a cerveja, aroma e sabor Indústria de Alimentos Aplicações Enzimáticas Cervejaria Uso de enzimas: - Degradação do amido Enzimas específicas para as ligações (1-6): ENDO (1-6) GLUCANASES (pululanases e isoamilases) EXO (1-6) GLUCANASES (exopululanases) Enzimas específicas para as ligações (1-4) e (1-6): Glicoamilases - Aperfeiçoamento da filtração A filtragem lenta: presença de certos polissacarídeos, principalmente - glucanas e pentosanas, encontrados na cevada e no malte de cevada pobremente modificado Solução: adição de uma -glucanase à maceração ou no início da fermentação Indústria de Alimentos Aplicações Enzimáticas Cervejaria Uso de enzimas: Cerveja Light Sob condições normais na produção de cerveja, as enzimas naturais do malte não podem hidrolisar todo amido em açúcares fermentáveis. Cerca de 1/3 do amido é convertido em dextrinas não fermentáveis, que são repassadas à cerveja final. As dextrinas são carboidratos, o que significa calorias. A fim de hidrolisar as dextrinas em glicose, as enzimas também podem ser adicionadas durante a maceração ou fermentação. A glicose é quase completamente transformada em etanol e CO2 pelas leveduras. Se isto for levado em consideração na preparação do mosto, isto é, se o mosto for ajustado para um extrato mais baixo, torna-se possível produzir uma cerveja com teor normal de álcool, mas com 1/3 a menos de calorias. Esta cerveja com baixo teor de carboidratos é do interesse não somente dos diabéticos, que precisam limitar seu consumo de carboidratos, mas também a de todos os consumidores de cerveja que queiram manter a forma física. Indústria de Alimentos Aplicações Enzimáticas Indústria de Sucos celulose hemicelulose pectina Lamela média Parede primária Membrana plasmática Estrutura da parede celular vegetal Indústria de Alimentos Aplicações Enzimáticas Indústria de Sucos PectinesterasePectinesterase PoligalacturonasePoligalacturonase PectinaPectina liaseliase Indústria de Alimentos Aplicações Enzimáticas Indústria de Sucos •• MaceraMaceraçção e Liquefaão e Liquefaççãoão •• Digestão das PolpasDigestão das Polpas PoligalacturonasePoligalacturonase e e CelulasesCelulases PrensagemPrensagem, , viscosidadeviscosidade, , rendimentorendimento RetenRetençção parcial suco na polpa ão parcial suco na polpa gelatinizagelatinizaççãoão PectinasesPectinases HemicelulasesHemicelulasesPresenPresençça de a de arabanaarabana turvaturvaçção no concentradoão no concentrado Protopectina Pectina Indústria de Alimentos Aplicações Enzimáticas Indústria de Sucos •• ClarificaClarificaçção dos Sucosão dos Sucos FloculaFloculaçção e precipitaão e precipitaçção do ão do complexo materiais suspensos complexo materiais suspensos –– polifenpolifenóóisis FiltraFiltraççãoão Problema Protopectina e pectina Protopectina e pectina impedem e/ou diminuem a impedem e/ou diminuem a floculafloculaçção e a precipitaão e a precipitaçção ão do complexo do complexo SoluSoluçção:ão: PectinasesPectinases Gelatina Gelatina BentonitaBentonita ou Terra Diatomou Terra Diatomááceacea Características adequadas: • Baixa afinidade imunológica, com afinidade dirigida ao problema em questão. • Serem provenientes de organismos não patogênicos, que contenham pouca ou nenhuma toxina. • Alta atividade e estabilidade em pH fisiológico, com retenção da atividade e estabilidade em soro animal. Medicamentos e análises clínicas Aplicações Enzimáticas Características adequadas: • Alta afinidade pelo substrato (baixo KM) • Pouca inibição pelos produtos ou constituintes normais encontrados em fluidos corporais. • Não tenham necessidade de cofatores exógenos • Terem efetiva irreversibilidade da reação enzimática sob condições fisiológicas Medicamentos e análises clínicas Aplicações Enzimáticas Medicamentos e análises clínicas Aplicações Enzimáticas Enzimas em medicamentos Enzima Fonte Utilização Amilase Asparaginase Pâncreas bovino ou suíno Fúngica Microbiana Auxiliar digestivo Leucemia Bromelina Celulase Abacaxi Fúngica Auxiliar digestivo Auxiliar digestivo Debridamento de feridas Papaína Quimiotripsina Hialuronidase Lisozima Mamão Mamão Testículos de bovinos Clara de ovo Hérnia de disco Agente dispersante Infecções Pancreatina Pâncreas bovino ou suíno Insuficiência pancreática Uroquinase Urina humana Cultura de células Agente fibrinolítico Medicamentos e análises clínicas Aplicações Enzimáticas Enzimas em medicamentos Tratamento de leucemia: Degradação da L-asparagina (no plasma: essencial para sobrevida das células tumorais) Uso de L-asparaginase Tratamento de tromboembolias (inclusive infarto do miocardio) Streptoquinase e uroquinase: dissolução de coágulos por ativação da fibrinolisina Condições inflamatórias: tripsina e quimotripsina Medicamentos e análises clínicas Aplicações Enzimáticas Enzimas utilizadas em diagnósticos Enzima Fonte Substrato Medido Álcool desidrogenase Levedura Etanol, álcoois e aldeídos Colesterol oxidase Fúngica Colesterol Esterase Fígado suíno Triglicerídeos Glicose 6-fosfato desidrogenase Levedura Glicose Glicose oxidase Fúngica Glicose Glicerol desidrogenase Bacteriana Glicerol Hexoquinase Levedura ATP, glicose Nitrato redutase Fúngica Nitrato Ureato oxidase Bacteriana Ureatos Urease Feijão-de-porco (Jack bean) Uréia This document was created with Win2PDF available at http://www.win2pdf.com. 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