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Universidade Federal do Rio de Janeiro Polo Xerém
 
 
 
 
 
  
 
 
 
  
 
CARACTERIZAÇÃO DE NANOCRISTAIS DE CELULOSE POR MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA
 
 
  
  
 
 
 
 
 
Autor: Wellington Silva Ferreira
Orientador: Prof. Dr. Gilberto Weissmuler; Prof. Dr. Gustavo Miranda Rocha; Profª. Dra. Maria Inês Bruno Tavares; e Me. Amanda Melo 
Grupo de Pesquisa: Laboratório 
Período do IPN: 2019.2
Duque de Caxias
2019
RESUMO
A celulose é considerada o biopolímero mais abundante na Terra, podendo ser extraído de diversas fontes e por diferentes rotas químicas e/ou mecânicas. A partir da hidrólise ácida, obtém-se nanocristais de celulose ou nanofibrilas de celulose. Materiais nanoestruturados apresentam propriedades distintas, assim a síntese e a caracterização topográfica e nanomecânicas de nanopartículas é de suma importância para o desenvolvimento de novos materiais. A Microscopia de Força Atômica (AFM), é uma ferramenta analítica muito eficaz uma vez que a amostra não necessita preparação prévia, além de possibilidades de observações em líquido e obtenção das características nanomecânicas da amostra através da interação sonda e amostra, alcançando dados de topografia, adesão, deformação, dissipação e elasticidade, ponto a ponto numa única imagem. O trabalho tem como objetivo a caracterização por AFM dos nanocristais de celulose, prospectando, estes, para futuras aplicações de embalagens biodegradáveis.
Palavras-chave: Nanomateriais, Nanocristais de Celulose, Hidrólise Ácida, Microscopia de Força Atômica, Nanotecnologia.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO
A celulose é um polímero natural que teve muitas aplicações industriais nos últimos 100 anos. Devido as suas propriedades (fácil extração, biopolímero mais abundante da terra, insolubilidade em água), desenvolveu diversas funcionalidades, aumentando a flexibilidade, o desempenho à resistência e peso mecânico, assim, aplicados em diversos produtos como os florestais (aplicações da celulose onde o produto final seja a madeira), papel e têxtil. Essa aplicabilidade dos últimos anos é definida como a primeira geração da celulose (MOON et al., 2011). 
Já a segunda geração necessita de materiais com propriedades, funcionalidades, durabilidade e uniformidade mais refinadas, características não alcançadas com materiais celulósicos tradicionais (MOON et al., 2011). Nos primórdios da nanotecnologia, o físico Richard Phillips Feynman discute, durante sua palestra “There is plenty a new field of physics” em 1959, a tecnologia e a engenharia na escala atômica (SCHULZ, 2017), levando assim, o estudo, a descoberta e o desenvolvimento da manipulação de sistemas na escala nano permitindo a descoberta de uma unidade de reforço fundamental da celulose conhecida como nanopartículas de celulose, que podem ser usadas para fortalecer todas as estruturas subsequentes dentro das plantas, algas e alguns animais marinhos (KALARIKKAL et al., 2018). Ao extrair a celulose em nanoescala através de rotas mecânicas, químicas ou enzimáticas é possível eliminar a maioria dos defeitos relacionados a estrutura hierárquica, assim, tendo um novo bloco de construção à base de celulose que pode ser aplicado na ciência das matérias (MARIANO et al., 2014).
Nanopartículas de celulose é um material ideal para nova indústria de compósitos biopoliméricos devido ao maior módulo de elasticidade, propriedades mecânicas dentro da faixa de outros materiais de reforço, alta razão de aspecto, baixa densidade e uma superfície reativa a grupos laterais -OH, que facilitam o enxerto de espécies químicas (MOON et al., 2011).
A nanotecnologia não trouxe só o desenvolvimento de novos materiais, ela também permitiu o desenvolvimento de novas técnicas para analises desses nanocompósitos (SANCHEZ e SOBOLEV, 2010). A microscopia de força atômica (AFM), pertencente à família da microscopia de varredura por sonda (SPM), é uma técnica mais do que conveniente para analises de estruturas em nanoescala, além de permitir o mapeamento topográfico da amostra é possível medir a interação entre a superfície do material e o ponta da sonda obtendo assim dados nanomecânicos (ALESSANDRINI, e FACCI, 2005) .
Esse trabalho tem como objetivo a caracterização morfológica e nanomecânica por AFM de Nanocristais de Celulose (NCC) obtidos através de rota química conhecida como hidrólise ácida para futuras aplicações em matérias biodegradáveis. 
1.1 ESTRUTURA DA CELULOSE
A celulose é considerada o biopolímero mais abundante na Terra, é caracterizada por uma cadeia linear de moléculas de glicose (C6H10O5)n ligados covalentemente a um oxigênio pelo carbono 1 e 4 de duas glicoses distintas, sendo a forma linear uma consequência da estabilização do grupo hidroxila do carbono 3 e o oxigênio da glicose anterior através de pontes de hidrogênio (figura 1) (SAMIR et al., 2005). Assim, formando regiões cristalinas e amorfas que permite a obtenção de nanocristais de celulose e nanofibrilas de celulose dependendo da região em que a partícula é extraída (NISHIYAMA, 2009).
Fig 1. (a) unidade de repetição de cadeia de celulose (b) microfibrila de celulose idealizada, mostrando uma das configurações sugeridas das regiões cristalinas e amorfa. Fonte: adaptado de MOON et al., (2011).
A abundância dela está relacionada diretamente as fontes de celulose, no qual, são provenientes majoritariamente de plantas, bactérias e poucos animais marinhos como por exemplo o Municato (Urochardata), sendo que cada fonte possui uma estrutura cristalina distinta (MOON et al., 2011). Nas regiões cristalinas existe um arranjo geométrico que se repete nos eixos principais da estrutura para formar o volume total do cristal. Em estrutura dos sólidos esse arranjo geométrico dá-se o nome de cela unitária (CALLISTER, 2008). A cela unitária tem dimensões bem definidas, no caso da celulose, a melhor estudada é a do tipo I (celulose nativa), na qual consiste em duas diferentes estruturas cristalinas, a monoclínica (Iα) e triclínica (Iβ). A proporção entre as frações entre uma e outra está diretamente relacionada com a origem. Dependendo do tratamento em que a celulose é exposta, há diferentes alterações nas dimensões da cela unitária, no que, pode resultar em outros cinco tipos de polimorfos diferentes, o II, III1, III2, IV1 e IV2 (SILVA; e ALMEIDA, 2009). Os nanocristais de celulose podem apresentar diferentes particularidades nas suas superfícies e, consequentemente, no seu desempenho como partícula de reforço em compósitos dependendo do seu polimorfo. 
1.2 SÍNTESE DE NANOCRISTAIS
Como comentado anteriormente, e possível obter nanocristais de celulose através do tratamento mecânico, químico e enzimático, independentemente do tipo de processo usado, existe uma pré-etapa de purificação e homogeneização do material de origem para que reaja de forma consistente no tratamento subsequente (MOON et al., 2011). A hidrolise ácida (tratamento químico), foi o tratamento subsequente utilizado no presente trabalho. 
O processo preferencialmente remove, hidrolisa, regiões amorfas dentro das microfibrilas de celulose quando expostas ao ácido. Após um determinado tempo, a solução é diluída para extinguir a reação, seguido de centrifugação ou filtração e consequente lavagem para remoção do ácido. A ultra-sonicação é um processo opcional, que facilita a dispersão da celulose cristalina em suspensão (SIQUEIRA et al., 2010).
Existe um leque de possibilidades de ácidos a serem utilizados no processo de hidrólise ácida, sendo os mais rotineiramente utilizados, os: ácido clorídrico (HCl), ácido sulfúrico (H3SO4) e ácido fosfórico (H3PO4). Há também, diversas condições de hidrolise que possibilitam, com a variação do tempo e temperatura, diferentes comprimentos de nanocristal de celulose, e grau cristalino. Os ácidos citados em certas concentrações podem causar inchamento e dissolução por entre os cristais de celulose, tal como no interior desses cristais. O mecanismo da reação envolve a protonação do oxigênio pertencente a
ligação 1,4-β glicosídica (Figura 1), prioritariamente essas reações ocorrem na fase amorfa da celulose, devido à maior acessibilidade do solvente a essas áreas, e em seguida ocorre nas regiões cristalinas por meio do inchamento (FAN et al., 2013; BORJESSON e WESTMAN, 2015). A partir da hidrólise foram realizadas modificações na celulose de forma que diminuísse as interações intermoleculares existentes, aumentasse a compatibilidade com a matriz polimérica.
1.3 MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA (AFM)
A varredura de amostras por sonda é uma técnica empregada desde o início dos anos 80 desenvolvidos pelos pesquisadores Gerd Binnnig e Henrich Roher, no entanto, a utilização da espectroscopia de força veio mais tarde com a microscopia de força atômica. O AFM é um microscópio de varredura por sonda, no qual, utiliza um sistema de fotodetectores e laser que mede as deflexões do cantiléver que interage com a superfície da amostra através de um tip. O AFM permite um conjunto de forma para obtenção de imagens, onde os mais conhecidos são os modos não contato, contato intermitente, e contato intermitente com curvas de força, sendo que só o último exemplo permite a espectroscopia de força (SOUZA, 2007).
1.3.1 ESPECTROSCOPIA DE FORÇA
Na física a força é um estudo da causa da aceleração que pode ser definida por termos coloquiais, como um empurrão ou puxão exercido sobre um objeto. A relação que existe entre uma força e a aceleração produzida por essa força foi descoberta por Isaac Newton. A força é uma grandeza vetorial cujo o módulo é definido em termos da aceleração que imprimiria a uma massa de um quilograma. Por definição uma força produz uma aceleração de em uma massa de um 1Kg, tendo um módulo de um 1N (HALLIDAY et al., 2012).
A partir da força é possível analisar propriedades das matérias como tensão, deformação e rigidez, extraídos a partir da equação de Young (fórmula 1). 
 (01)
Onde E é o módulo de Young, σ é a tensão e ε é a deformação plástica. Valores retirados da curva de força feita pelo microscópio (Figura 2).
Fig 2: Representação de curva de força com suas respectivas medidas. Fonte: SOUZA, 2007.
Durante o mapeamento da amostra o cantiléver ressoa numa frequência característica que permite que em cada vez que bate na amostra, ele de uma curva de força, podendo assim aferir valores como módulo, tensão, deformação, indentação (SOUZA, 2007). 
2. DESENVOLVIMENTO
A celulose microcristalina (MCC) foi comprada da Synth (densidade 0,26-0,32 g/cm3, grau de polimerização 350), a celulose nanocristalina foi comprada da Celluforce (densidade 0.7 g/cm3) (NCC_C), o ácido sulfúrico, hidróxido de sódio, álcool etílico e o acetato de zinco dihidratado foram obtidos da Sigma-Aldrich. Os reagentes foram utilizados sem nenhum tipo de tratamento prévio.
2.1 HIDRÓLISE ÁCIDA CELULOSE
Os nanocristais de celulose foram obtidos no Laboratório de Nanocompósitos Poliméricos e Alimentos (N&NPCA) a partir da celulose microcristalina, em que a hidrólise ácida foi preparada em duas etapas. Primeiramente, foi produzida uma suspensão de MCC (10 %m/v) com ácido sulfúrico a 32% v/v que foi homogeneizada em agitador mecânico por 30 min, a 17000 rpm. Em seguida, a concentração de ácido foi corrigida para 64% v/v, e a hidrólise prosseguiu por mais 2h em refluxo a 50 °C. No decorrer da adição do ácido sulfúrico, o sistema foi refrigerado com banho de gelo.
Concluído o tempo de reação, adicionou-se 300 mL de água gelada para parar a reação de hidrólise, em sequência a suspensão (identificada como NCC_H) foi levada ao agitador mecânico por mais 20 min a 17000 rpm. Por último foi realizado a diálise com intuito de neutralizar a suspensão ácida e a suspensão estocada em geladeira por aproximadamente 24h. 
2.2 MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA (AFM)
Para as análises topográficas e nanomecânicas das nanopartículas de celulose, utilizamos um equipamento Dimension Icon® (Bruker, Santa Barbara -CA) usando o modo de varredura PeakForce Tapping QNM, no Laboratório de Física Biólogica. 
O cantiléver utilizado para o experimento foi HQ-300-Au (Oxford Instruments®, UK), de silício revestido com titânio e ouro, sem nenhum tipo de revestimento no tip, com constante de mola nominal de 40 N/m, raio médio de 10 nm e frequência em torno de 300 kHz. Durante a aquisição de imagens, a temperatura ambiente foi mantida nas condições da CNTP (25 ± 1 °C) e umidade relativa a 40 ± 1%. 
As nanopartículas em suspensão passaram pelo procedimento de sonicação por 15 minutos, diluídas 100 vezes, e novamente sonicadas para uma melhor dispersão da amostra. Em seguida, uma alíquota de 100µL foi depositada sobre mica recém clivada por 5 minutos, para adesão da amostra sobre a mica, lavadas duas vezes em água ultra-pura, com posterior secagem da amostra por 3-5 minutos com um leve e constante jato de Nitrogênio. Regiões da amostra foram analisadas através de janelas de varredura entre 5 µm a 0.5 µm. Para processamento de imagens, o software utilizado foi o NanoScope Analysis (Versão 1.7), no qual apenas procedimentos como planificação em linha foram efetuados.
2.2.1 ESPECTROSCOPIA DE FORÇA
Para as analises nanomecânicas foi utilizado o Software NanoScope Analysis versão 1.7, onde a função force volume permite o ajuste de vários modelos de indentação nas curvas de força e consequentemente permite o cálculo do módulo e adesão da amostra. O modelo utilizado foi o Sneddon (conical indenter), modelo no qual, é utilizado para pontas com geometria cônica (Figura 3). 
Fig. 3: Contato entre um tip cônico e uma amostra (indentação), sendo α=BA Fonte: https://www.brukerafmprobes.com/showTipDetails.aspx?imagename=/images/Product/tip/fullsize/DNP-S.jpg/
Em todas as análises foram extraídas imagens de Height Sensor, Peak Force Error, DMT Modulus, Log DMT Modulus, Adhesion e Deformation em 2D e 3D. Consequentemente foi utilizado o comando seção, exibindo uma imagem da vista superior, no qual, é possível traçar linhas de referência com perfis de seção e transformações rápida de Fourrier (FFT) dos dados ao longo das linhas de referência.
As informações mais relevantes foram Horizontal Distance, RMS (Standard Deviation), Ra (Mean Roughness) e Height, onde são, respetivamente, a distância horizontal entre os cursores, desvio padrão dos valores de Z entre os marcadores de referência (cursores) calculados através da formula 2, o valor médio da curva de rugosidade em relação à linha central calculada através da formula 3 e por fim, o pico mais alto do nanocristal de celulose.
 (02)
Onde Zi é a diferença do Zmáx e Zmin antes do tratamento da imagem, Zave é a média dos valores de Z entre os marcadores de referência e N é o número de pontos entre os marcadores de referência (Figura 02).
 (03)
Onde L é o comprimento e f(x) é a curva de rugosidade à linha central (Figura 4).
Fig. 4: Gráfico curva de rugosidade, onde foram extraídas as informações Horizontal Distance, RMS (Standard Deviation), Ra (Mean Roughness) e Height. 
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Nanocristais e nanofibrilas de celulose foram produzidas em uma única etapa a partir da celulose microcristalina, combinando a hidrólise com ácido sulfúrico e a agitação mecânica com o Ultraturrax
Para fins de controle a celulose em escala micrométrica (MCC) foi caracterizada (Figura 5a-5b), linhas de 2000 nm foram traçadas sobre fibras de celulose e assim extraídos os dados de nanomecânicos. Nos experimentos utilizando NCC_C (Figura 5c-5d), um colchão formado a partir da rede de nanopartículas de celulose interconectada aleatoriamente devido alta concentração da amostra. Fazendo com que as informações possam variar muito dependendo da topologia e orientação,
por isso as linhas de seção foram feitas na direção do nanocristais. Quatro NCC_C foram selecionadas. Na micrografia de AFM (Figura 5e-5f) isolou-se dois nanocristais de celulose (NCC_H) de comprimento 100 nm e diâmetro 3 nm (medida realizada pela diferença de altura entre a mica e o topo da superfície de NCC_H), confirmando as condições experimentais de hidrólise, foi capaz de produzir nanocristais de celulose, sendo a morfologia, tamanho e diâmetro similar ao encontrada na literatura (SÈBE et al.; e TINGAUT, 2012). 
Fig. 5: (a) imagem 2D MCC (b) imagem 3D MCC (c) imagem 2D NCC_C (d) imagem 3D NCC_C (e) imagem 2D NCC_H (f) imagem 3D NCC_H5f)
5e)
5d)
5c)
5b)
5a)
O AFM permite a extração de imagens do módulo de Young, adesividade e deformação. No entanto, achamos pertinente apresentar esses dados através de gráficos (figura 6). Utilizando os RMS de altura, módulo, adesividade e deformação aplicamos o teste estatístico one-way ANOVA. Na figura 6a vemos que altura das MCC é extremamente maior em relação aos nanocristais, e observamos uma homogeneidade entre os nanocristais comerciais e sintetizados no laboratório. A figura 6b analisamos o modulo, quando fazemos isso, percebemos que as MCC_H são mais homogêneas dos que as comercias (NCC_C), sendo que podemos atribuir essa discrepância ao colchão formado. Já adesão e a deformação, figura 6c-6d possuem resultados muito parecidos quando comparados entre NCC_C e NCC_H. Podemos concluir que o módulo em nanoescala é maior que do que em microescala, enquanto adesão e a deformação são menores em nanoescala quando comparados na escala micro.6a)
6b)
6c)
6d)
Fig. 5: teste estático one-way ANOVA dos dados de altura, módulo, adesão, deformação (a) gráfico altura (b) gráfico DMT módulo (c) gráfico adesão (d) gráfico deformação
Essa comparação entre MCC, NCC_C e NCC_H possibilita afirmar que a metodologia aplicada para a formação de nanocristais de celulose homogêneos a partir das fibras de celulose comercial é viável, assim possibilitando a aplicação de novos materiais biodegradáveis corroborando com outros textos da literatura. 
4. REFERÊNCIAS
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SCHULZ, Peter A. Há mais história lá embaixo – um convite para rever uma palestra. Revista Brasileira de Ensino de Física, vol. 40, nº4, e4210 (2018).
KALARIKKAL, N.; MOHAN, S.; OLUWAFEMI, S. O.; THOMAS, S. APPLICATION OF NANOMATERIALS – Advances and Key Technologies. Woodhead Publishing, 29 de jun. de 2018. 415-454.
MARIANO, M.; KISSI, N.; DUFRESNE, A. Cellulose Nanocrystal and Related Nanocomposites: Review of some Properties and Challenges. JOURNAL OF POLYMER SCIENCE, PART B: POLYMER PHYSICS 2014, 52, 791–806
SANCHEZ, F.; SOBOLEV, K. Nanotechnology in concrete – A review. Construction and Building Materials 24 (2010) 2060–2071.
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SAMIR, M.A.S.A.; ALLOIN, F.; DUFRESNE, A. Revier of Recent Research into Cellulosic Whisker, Their Properties and Their Application in Nanocomposite Field. Biomacromolecules 2005, 6, 612-626.
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