Bacteriofago M13

Prévia do material em texto

Bacteriófago M13 – Plano de Trabalho
Sensores são dispositivos eletrônicos, mecânicos, químico ou biológico que reponde a um estímulo específico e transmite um impulso quantitativo como medida ou operação de um controle1. Umas das aplicações do AFM é a funcionalização de cantiléveres para síntese de sensores nanoestruturados através de um sistema de automontagem bottom-up (de baixo para cima). 
Mesmo com aumento significativo de métodos de automontagem na última década, a síntese de estruturas altamente complexas ainda é um desafio2. Os campos da Bionanotecnologia e da ciência dos materiais foram simultaneamente inspirados nos processos de automontagem (PA), sendo esses uma alternativa promissora para criação de bionanomaterias. Fica evidente que ainda é um processo de difícil controle devido as interações complexas entre genes e proteínas dentro do contexto organizacional, mas para superar este obstáculo a engenharia genética de vírus é uma nova oportunidade para integrar materiais em nanoescala levando em consideração a pequena quantidade de proteínas e genes em comparação com células eucarióticas e procarióticas3.
Os bacteriófagos (fago) são vírus que se replicam e propagam sua informação genética infectando células bacterianas3,4. Existem várias estruturas de bacteriófagos, desde formas lineares, esféricas e até refinadas estruturas cabeça-cauda3,4. Entre essas formas os fagos com estruturas filamentosas apresentam diversas vantagens para construção por automontagem de novos materiais, sendo o fago M13 um exemplo clássico5,6,7, no qual, tem alta reprodutibilidade biológica devido a sua estrutura filamentosa nanométricas anisotrópicas4, fácil manipulação superficial por modificação genética e química que permite a introdução de novos peptídeos específicos4 e pôr fim a utilização da técnica phage display7,9, que é um processo de rastreio combinatório de alto rendimento que identifica, selecionando a partir de bibliotecas de peptídeos aleatórios, peptídeos funcionais que são expressos como proteína de fusão na superfície do fago. Essas propriedades biominéticas permitem uma gama de aplicações como a funcionalização de cantiléveres.
Os fagos M13 não possuem uma ordem atribuída, são da família das Inoviridae, morfologicamente filamentosa com um diâmetro de 6,6 nm e comprimento de 880 nm, seguindo a classificação de Baltimore o fago M13 pertence ao grupo 1, com dupla fita de DNA circular2,10. Tendo como capsídeo viral 2700 cópias de proteínas de revestimento principal helicoidalmente organizada (pVIII) e 5-7 cópias de proteínas de revestimento menor (pIII, pVI, pIX e pVII)2. Onde as proteínas de revestimento principal compõem as paredes da bainha, enquanto que os complexos de revestimento menor estão localizados nas extremidades (Figura1).
Figura 1: Esquema Bacteriófago M13. Fonte: Adaptado de Kim, W.-G. et al. Virus based Full Colour Pixels using a Microheater. Sci. Rep. 5, 13757; doi: 10.1038/srep13757 (2015) e Sung, H. Yang et al. Assembly of Bacteriophage into Functional Materials. The Chemical Record, Vol. 13, 43–59 (2013)
Os fagos M13 podem ser facilmente amplificados de uma maneira altamente regular através da infecção de células hospedeiras bacterianas. Sua replicação ocorre em Escherichia Coli (E.coli) contendo um F-pilus. O fago M13 é um vírus não lítico, ou seja, não causa lise celular durante a replicação. Com essa alta facilidade de replicação e junto com os avanços da engenharia genética é possível expressar proteínas especificas na região de revestimento principal, proteínas na qual podem ser selecionadas através de uma biblioteca utilizando a técnica de phage display, sendo possível/viável sintetizar o fago que interage especificamente com um alvo de interesse. Assim, com os avanços da biotecnologia há o crescente aumento de sistemas híbridos com bacteriófagos.
As modificações de proteína de fago M13 foram feitas primeiramente por George P. Smith8,11. Após o pontapé inicial um grande banco de dado foi criado expondo diferentes estruturas superficiais especificas. Na posse dessas bibliotecas e inspirados em processos naturais de seleção evolutiva é possível fazer uma busca combinatória nessas bibliotecas usando um método de biopanning e encontrar um fago específica que mostre melhor afinidade de ligação a um alvo de interesse9.
O processo de biopanning é constituído por quatro etapas, onde a primeira etapa é selecionar a biblioteca de exibição de fagos8,9. A segunda é a captura que envolve a conjugação da biblioteca de fagos ao alvo desejado, este procedimento é denominado panning, onde utiliza a interação de ligação, de modo que apenas os peptídeos específicos apresentados pelo bacteriófago estão ligados ao alvo. Após a fase de captura vem a etapa de lavagem que consiste em lavar os fagos da superfície sólida, ficando apenas fagos ligados fortemente, o passo final é um processo de eluição. Após essas quatros etapas o resultado final será bacteriófagos produzindo peptídeos específicos na sua superfície.
Com o intuito de seguir o trabalho do grupo e fazer sensores para compostos orgânicos12, temos a proposta de modificar a proteína PVIII do fago M13 através do método de biopanning para interagir com maconha e/ou cocaína. Trabalho no qual, terá uma aplicação direta na sociedade, sendo que há uma crescente preocupação com o uso de drogas entre as várias faixas sociais e uma deficiência muito grande no estudo de metodologias que forneçam parâmetros seguros para a polícia13.
Para a funcionalização de cantiléveres, será necessário a síntese de uma solução de bacteriófago altamente concentrado. Onde será necessário a compra do bacteriófagos e meio de cultura. Valores encontrados nos Links:
https://www.dsmz.de/catalogues/details/culture/DSM-13976.html
https://www.atcc.org/products/all/15669-B1.aspx#generalinformation
Com essas culturas, será possível fazer analises nanomecânicas por AFM entre os bacteriófagos com e sem as modificações, para que futuramente seja feito experimentos em que analise a interação dos bacteriófagos com o analito.