Phage display

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Phage display 
● É uma técnica para a identificação e seleção de peptídeos, proteínas ou anticorpos com elevada 
afinidade e especificidade para um alvo específico 
● A exibição de fagos permite a apresentação de grandes bibliotecas de peptídeos e proteínas na 
superfície do fago filamentoso, o que leva à seleção de peptídeos e proteínas, incluindo anticorpos, com 
alta afinidade e especificidade para quase qualquer alvo. 
● A tecnologia envolve a introdução de sequências peptídicas exógenas em um local no genoma das 
proteínas do fago capsídeo. Os peptídeos codificados são expressos ou "exibidos" na superfície do fago 
como um produto de fusão com uma das proteínas do revestimento do fago. 
● A força da tecnologia de fagos é sua capacidade de identificar regiões interativas de proteínas e outras 
moléculas sem noções pré-existentes sobre a natureza da interação 
Descoberta 
● A exibição de fagos foi descrita pela primeira vez por George P. Smith em 1985, quando ele demonstrou 
a exibição de peptídeos em fagos filamentosos , criando a fusão da proteína do capsídeo do vírus a 
uma biblioteca de sequências de peptídeos . Isso exibiu os peptídeos na superfície viral, onde aqueles 
com maior afinidade de ligação podiam ser selecionados. 
● Em 1988, Stephen Parmley e George Smith descreveram o biopanning para seleção por afinidade e 
demonstraram que rodadas recursivas de seleção poderiam enriquecer para clones presentes em 1 em 
um bilhão ou menos. 
● Em 1990, Jamie Scott e George Smith descreveram a criação de grandes bibliotecas de peptídeos 
aleatórios exibidas em fagos filamentosos. 
● Smith e Winter receberam metade do Prêmio Nobel de química em 2018 por sua contribuição ao 
desenvolvimento da exibição de fagos. 
Bacteriofagos 
● Bacteriófagos são vírus que infectam bactérias e são abundantes em vários ecossistemas 
● o material genético desses vírus podem variar: alguns contendo RNA e outros DNA e alguns de fitas 
simples e outros. De maneira geral o material genético do fago é envolvido por uma estrutura proteica 
chamada Capsídeo, quando vírus se encontra fora da célula Hospedeira. 
● a estrutura dos capsídeos dos bacteriófagos é variável alguns possuem duas partes bem definidas 
como cabeça e Cauda enquanto outros são filamentosos 
● A infecção da bactéria pelo vírus se inicia com a adsorção deste a receptores na superfície bacteriana 
estes receptores podem ser proteínas na própria parede celular mas também filhas flagelos e cápsulas 
proteínas 
● ao se ligarem aos receptores os bacteriófagos podem injetar o material genético para dentro da 
bactéria deixando o capsídeo vazio do lado de fora. os fagos filamentosos por sua vez atravessam a 
parede bacteriana com o capsídeo e este é deixado Apenas quando o material genético entra no 
citoplasma 
● uma vez dentro do citoplasma o material genético do fago pode iniciar sua replicação imediatamente ou 
se integrar no cromossomo bacteriano e isso depende de vários fatores a interação do bacteriófago 
bactéria ocorre de maneira específica ou pago em geral uma consequência do reconhecimento de 
receptores na superfície 
● um dos fagos mais bem estudados são os que infectam E.coli 
 
VETORES (FAGOS FILAMENTOSOS) 
● Os fagos utilizados no phage display são filamentosos e infectam enterobactérias como Escherichia coli. 
● A utilização de fagos filamentosos como vetores de clonagem tem como vantagens a estabilidade em 
ampla faixa de pH, de temperatura e ainda podem se acumular em elevada concentração nas células 
bacterianas infectadas sem causar lise às células 
M13 
● O fago filamentoso mais utilizado é o M13. Ele tem uma estrutura em forma de haste flexível com um 
genoma circular de DNA-fita simples, envolta em um capsídeo composto pelas proteínas pIII, pVI, pVII, 
pVIII e pIX. 
● Embora estas cinco proteínas possam ser utilizadas para apresentação de moléculas, pVIII e pIII são as 
mais empregadas para este fim 
● A proteína de revestimento pIII está envolvida na interação fago-célula durante a infecção. Ela está 
presente de três a cinco cópias por fago e suporta a inserção de proteínas tão grandes quanto um 
fragmento de anticorpo scFv. Entretanto, por ser a responsável pela infecção do fago, fusões na pIII 
podem causar a perda da infectividade produzindo fagos não viáveis 
● Já a proteína de revestimento pVIII compõe o corpo do fago e possui apenas 50 aminoácidos. Apesar 
de presente em milhares de cópias por vírion, a pVIII permite a apresentação de grandes quantidades 
da molécula de interesse, porém, essas moléculas devem ter sequências menores que oito 
aminoácidos já que se forem maiores podem desestabilizar a partícula viral. A proteína pVIII tem a 
desvantagem de favorecer moléculas de menor afinidade pelo fato da proteína pVIII apresentar 2700 
cópias por fago, expressando no Display muitas cópias por fago, baixando a afinidade em processos 
de seleção 
● O fago M13 possui uma rápida propagação e não necessita de seleção por antibiótico ou superinfecção 
por fago auxiliar (helper). Além disto, o gene lacZ, presente neste vetor, facilita a seleção entre colônias 
bacterianas infectadas com fagos de bibliotecas (colônias azuis) e colônias não infectadas ou infectadas 
com fagos selvagens (colônias brancas), pois o gene lacZ faz com que as bactérias infectadas 
expressem a enzima β-galactosidase que ocasiona a hidrólise do substrato X-Gal presente no meio de 
cultivo. 
● Replicação: O fago M13 possui um Genoma de DNA fita simples circular chamado de fita positiva que é 
imediatamente replicado pelo sistema de replicação da bactéria. um RNA inicie a dor é sintetizado pela 
primase DnaG seguida da replicação completa gerando um DNA fita dupla circular chamado de forma 
replicativa. a fita positiva é clivada por uma endonuclease do Fago e esta fita Então é replicada pelo 
método de círculo rolante gerando novas fitas positivas. Estas por sua vez irão gerar novas formas 
replicativas amplificando o processo ou uma fita positiva será incorporada na nova partícula viral 
Fago t7 
● O bacteriófago T7 tem um ciclo de vida lítico , o que significa que destrói a célula que infecta. 
● DNA fita dupla linear 
● Esquema genético: 
O fago T7 possui um Genoma pequeno e seu ciclo de vida é simples quando comparado a fagos com 
genomas maiores. Depois da infecção ocorre a imediata expressão dos genes iniciais contidos em uma das 
extremidades do genoma, que possuem promotores transcritos pela RNA polimerase bacteriana. um desses 
de genes codifica uma RNA polimerase que irá dirigir a transcrição dos genes tardios da infecção este genes 
tardios codificam as proteínas necessárias a replicação do Genoma viral e a montagem do bacteriófago. Estes 
Genes tardios codificam as proteínas do capsídeo Viral riram montar os novos vírus 
 
 
 
 
Funcionamento 
● Inicialmente, genes que codificam milhões de proteínas são inseridos no genoma de bacteriófagos 
gerando uma biblioteca de fagos. Após a inserção os fagos expressam essas proteínas na superfície 
viral, fusionadas a uma proteína do capsídeo. 
● Uma maior variedade de peptídeos na biblioteca gera uma maiorprobabilidade de seleção de fagos 
expondo proteínas que interajam com o alvo ligante. 
● Em um processo de seleção por afinidade denominado biopanning, a biblioteca é então apresentada às 
moléculas-alvo, que geralmente se encontram imobilizadas em um suporte sólido (placa de 
imunoensaio, membrana, beads, microesfera, etc.). - Normalmente, são realizadas três a cinco rodadas 
de biopanning para obter alvos que se ligam com alta afinidade- 
● Interações fracas entre os fagos expressando proteínas e o alvo são desfeitas por lavagens sucessivas, 
enquanto aqueles fagos que expõem moléculas com elevada afinidade pelo alvo são recuperados por 
eluição. Estes representam o resultado da bioprospecção. 
● A eluição é feita com a utilização de tampões ácidos ou de elevada força iônica, que desestabilizam de 
modo inespecífico interações entre proteínas - 
● Esse "bio-panning" pode ser repetido várias vezes até que uma população de melhores ligantes seja 
enriquecida. Seqüenciando o genoma do fago que codifica o peptídeo exibido, pode-se determinar e 
reproduzir sua sequência como peptídeos recombinantes ou sintéticos, e finalmente determinar ligantes 
específicos e seletivos para os receptores alvo 
● A próxima etapa é amplificar os fagos eluídos em cultivo bacteriano e submetê-los a novos ciclos de 
seleção (ligação, eluição e amplificação).. O processo é monitorado através da titulação dos fagos 
adicionados (entrada) e recuperados (saída) em cada ciclo, além da realização de imunoensaios. De 
três a cinco ciclos são suficientes para obtenção de um quantitativo de saída com fagos expondo 
moléculas com elevada afinidade pelo alvo-ligante. 
 
APLICAÇÕES 
● Definir a região de uma proteína que é reconhecida por um anticorpo 
● Identificação de motivos de ligação de receptores bioquímicos 
● Mapeamento de superfícies celulares e teciduais 
● Aplicações em genômica e proteômica 
● Obtenção de medicamentos, vacinas e inibidores enzimáticos 
 
Anticorpos 
● As bibliotecas de anticorpos produzidas por Phage Display podem ser varridas sobre superfície de 
células, tecidos ou órgãos em busca de novos marcadores moleculares. Além disso, a técnica ainda 
permite o aumento da afinidade de um anticorpo, mimetizando o processo fisiológico de hipermutação 
somática in vitro 
● Desde então, essa metodologia tem facilitado o desenvolvimento de anticorpos humanos para uso em 
pesquisa e com valores terapêuticos. 
● No caso de display de anticorpos a clonagem não é realizada no genoma do fago. A fusão 
recombinante é codificada em um plasmídeo separado de seu genoma em um sistema chamado 
Phagemid. 
● Nesse sistema, o genoma do fago, chamado de helper phage, codifica todas as proteínas do capsídeo 
e o Phagemid codifica a fusão recombinante. Como resultado final temos a produção de fagos híbridos, 
que expressam tanto a proteína pIII/pVIII selvagem como a fusão recombinante. 
● Esses fagos híbridos são, então, capazes de infectar bactérias e, o ao mesmo tempo, apresentar o 
anticorpo 
● Anticorpos produzidos por Phage Display podem apresentar duas estruturas possíveis: anticorpos Fab e 
anticorpos single-chain (ScFv). 
● As diferenças estruturais de cada molécula influenciam diretamente as propriedades bioquímicas dos 
anticorpos e trazem vantagens e desvantagens ao produzir bibliotecas em formato Fab ou single-chain. 
● Uma vantagem em produzir bibliotecas single-chain é a simplificação pela amplificação do PCR de 
overlap que reduz o número de etapas necessárias à construção da biblioteca. 
● Outra vantagem é a habilidade do ScFv em multimerizar, o que pode aumentar a avidez pelo antígeno 
e facilitar a seleção. 
● Porém, fragmentos ScFv nem sempre mantêm suas propriedades de reconhecimento do antígeno 
quando transportadas para um anticorpo funcional. Nestes casos, bibliotecas de Fab seriam mais 
recomendadas