BIOSSENSORES PARA O MONITORAMENTO DA EXPOSIÇÃO A POLUENTES AMBIENTAIS

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CA D. S A Ú D E C O L E T . , R I O D E JA N E I R O , 16 (4 ) : 677 - 700, 2008 – 677
BIOSSENSORES PARA O MONITORAMENTO DA EXPOSIÇÃO A POLUENTES AMBIENTAIS
Biosensors to monitor the exposition to environmental pollutants
Paulo Rubens Guimarães Barrocas1, Ana Cláudia Santiago de Vasconcellos2,
Sheila da Silva Duque3, Lísia Maria Gobbo dos Santos4, Silvana do Couto
Jacob5, Ana Luzia Lauria-Filgueiras6, Josino Costa Moreira7
RESUMO
Este artigo apresenta uma síntese crítica da literatura sobre a tecnologia dos biossensores.
Os princípios nos quais se baseia esta nova abordagem analítica, suas principais
características que a diferenciam dos outros métodos tradicionais (químicos e bioensaios),
as múltiplas configurações e tipos que têm sido desenvolvidos por pesquisadores das
mais variadas áreas da ciência e uma definição adequada para esta nova classe de
sistemas analíticos são examinados. Por fim, as diversas aplicações dos biossensores,
com ênfase para o monitoramento de poluentes ambientais perigosos para a saúde
humana (ex: pesticidas, metais, fenol, nitrito, disruptores endócrinos, etc.) e as
perspectivas futuras nesta área são discutidas.
PALAVRAS-CHAVE
Biossensor, poluente, exposição, monitoramento ambiental
ABSTRACT
This article presents a critical review of the literature about the biosensor technology.
The principles of this new analytical approach, its main unique characteristics and the
multiple configurations or types developed, as well as a suitable definition for this class
of analytical systems are evaluated. The various applications of the biosensors in
several areas, specially for the monitoring of environmental pollutants (e.g. pesticides,
metals, phenol, nitrite, endocrine disruptors, etc.) hazardous to human health, and the
future perspectives in this filed are discussed.
KEY WORDS
Biosensor, pollutant, exposure, environmental monitoring
1 Pesquisador do Departamento de Saneamento e Saúde Ambiental da Escola Nacional de Saúde
Pública. Fundação Oswaldo Cruz. End: Escola Nacional de Saúde Pública Sérgio Arouca. Departamento
de Saneamento e Saúde Ambiental - Rua Leopoldo Bulhões, 1480 / sala 521 CEP: 21041-210.
2 Mestranda do Curso de Saúde Pública da Escola Nacional de Saúde Pública. Fundação Oswaldo Cruz.
3 Tecnologista do Laboratório de Zoonoses Bacterianas. Instituto Oswaldo Cruz. Fundação Oswaldo Cruz.
4 Doutoranda do Curso de Vigilância Sanitária do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde.
Fundação Oswaldo Cruz.
5 Pesquisadora do Departamento de Química do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde.
Fundação Oswaldo Cruz.
6 Pesquisadora do Laboratório de Zoonoses Bacterianas do Insti tuto Oswaldo Cruz.
7 Pesquisador do Centro de Estudos da Saúde do Trabalhador e Ecologia Humana da Escola Nacional
de Saúde Pública. Fundação Oswaldo Cruz.
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1. INTRODUÇÃO
Embora bioensaios sejam utilizados para a avaliação dos efeitos de substâncias
químicas nos organismos há várias décadas, o desenvolvimento da tecnologia dos
biossensores é relativamente recente. Devido à grande versatilidade dos biossensores,
houve um aumento significativo do seu uso em diversos campos da ciência nas
últimas décadas. Isto pode ser constatado pelo aumento exponencial no número
de publicações que tratam desta abordagem. Obtiveram-se resultados similares
em levantamentos realizados nas bases de dados PubMed e Web of Science, utilizando
como palavra-chave o termo biosensor. A exceção de um único artigo de 1965, as
primeiras referências sobre biossensores surgem a partir de 1984. Entre os anos
de 1965 e 1985, apenas sete artigos foram publicados. Já no período seguinte
(1986-1996) obteve-se cerca de 2.000 referências, enquanto nos últimos anos
(1997-2007) foram encontrados 12.000 artigos. Outros exemplos do crescente
interesse da comunidade científica sobre o tema foram a realização do primeiro
simpósio (nos EUA) e a publicação do primeiro periódico (Biosensors and
Bioleletronics) dedicados ao tema, respectivamente em 1984 e 1985 (IEEE, 1984).
O grande atrativo desta técnica, em relação aos métodos químicos tradicionais,
é que ela permite determinar diretamente a biodisponiblidade das substâncias
químicas e seus efeitos biológicos. Estes dados possuem diversas aplicações em
várias áreas, como por exemplo: a maximização da absorção de vitaminas e
nutrientes na área de nutrição, o estudo da efetividade de novas drogas na
medicina, a avaliação do risco das espécies químicas de poluentes nas ciências
ambientais. O objetivo do presente artigo foi realizar uma revisão crítica da
literatura sobre este importante tema, enfatizando suas aplicações para o
monitoramento de poluentes ambientais perigosos para a saúde humana.
1.1. DEFINIÇÂO E PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS
Atualmente, com as crescentes aplicações dos biossensores em vários campos
da ciência, diferentes abordagens têm sido utilizadas por pesquisadores para a sua
construção e o termo tem sido empregado para designar várias configurações de
sistemas analíticos, indiscriminadamente. Rodriguez-Mozaz et al. (2005) apresen-
taram uma definição conveniente para biossensores, que pode ser aplicada aos
vários tipos existentes: “Biossensor é um sistema autônomo integrado, composto de um elemen-
to biológico receptor em contato direto com um elemento conversor, o qual é capaz de converter a
reação entre o elemento biológico e o analito de interesse em um sinal mensurável” (Figura 1).
Enquanto os receptores biológicos são os responsáveis pela seletividade do
sistema, a sua sensibilidade é determinada principalmente pelo conversor
(Castillo et al., 2004). O elemento biológico pode ser uma enzima, um anticorpo,
microorganismos, ácidos nucléicos ou mesmo células inteiras. Conseqüentemente,
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alguns exemplos das reações biológicas monitoradas são: a atividade ou inibição
de enzimas, a indução de genes específicos ou até a morte celular. A interação do
elemento biológico receptor com o analito alvo através de reações específicas
gera alterações no meio (ex: alteração da concentração de prótons, emissão de
gases, emissão ou absorção de luz, liberação de calor, aumento da massa do
receptor e/ou alteração do estado de oxidação do analito), as quais são captadas
e transformadas pelo conversor em um sinal mensurável (ex: variação na
corrente, no potencial, na temperatura, etc.). Este sinal é proporcional à con-
centração do analito, permitindo medições tanto qualitativas e quantitativas em
tempo real. Geralmente, os conversores realizam medidas óticas ou
eletroquímicas, que são amplificadas eletronicamente (Batzias & Siontorou, 2007;
Alfaya & Kubota, 2002).
Os biossensores, definidos como uma classe específica de sistemas analíticos
podem ser diferenciados dos bioensaios tradicionais pela ausência, nestes últimos,
de um conversor como parte integral do sistema analítico. Nos bioensaios
tradicionais, os resultados são obtidos após o uso de equipamentos ou
“conversores” externos. Isto gera muitas vezes a necessidade de diversas etapas
de processamento das amostras, com maiores custos e tempos de resposta
(Rodriguez-Mozaz et al., 2006).
As principais características genéricas dos biossensores são a grande
especificidade e sensibilidade, a simplicidade e a rapidez nas análises, fazendo dos
biossensores uma alternativa promissora, de baixo custo de operação ede
manutenção (Figura 2). Além destas vantagens, existe a possibilidade de
miniaturização dos biossensores, tornando-os sistemas portáteis, o que aliado à
capacidade de trabalhar em condições de campo (ex: elevadas temperaturas,
Figura 1
Representação esquemática dos Biossensores (adaptado de Nakamura & Karube, 2003).
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ambientes contaminados) e à possibilidade de determinar os analitos diretamente
em amostras complexas (ex: amostras ambientais ou biológicas), sem a necessidade
de longos e custosos pré-tratamentos, os tornam candidatos ideais para programas
de monitoramento ambientais. Isto é ainda mais relevante, nos casos onde se
deseja monitoramento em tempo real, visto que os biossensores podem ser
automatizados. Apesar de todas estas vantagens, o uso de biossensores para o
monitoramento ambiental ainda é pequeno, quando comparado ao seu uso na
medicina e na indústria farmacêutica. Por fim, a tecnologia dos biossensores pode
complementar os métodos analíticos tradicionais, fornecendo informações que
de outra forma não estariam disponíveis (ex: biodisponibilidade e efeitos biológicos)
(Selifonova et al., 1993; Ramanathan et al., 1997; Parellada et al., 1998).
Figura 2
Comparação das características dos Biossensores em relação aos métodos analíticos
tradicionais (adaptado de Rodriguez-Mozaz et al., 2004).
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A principal desvantagem dos biossensores, é a sua direta dependência do
elemento biológico receptor. Conseqüentemente esta técnica analítica, em geral,
é menos reprodutível que os métodos químicos tradicionais (Ron, 2007).
2. CLASSIFICAÇÕES DOS BIOSSENSORES
Os biossensores podem ser classificados de diversas maneiras. Dois tipos de
classificação comumente descritos na literatura são baseados no método de
conversão do sinal ou no elemento biológico receptor (Alfaya & Kubota, 2002).
2.1. CLASSIFICAÇÃO CONFORME O MÉTODO DE CONVERSÃO DO SINAL
Segundo Rodriguez-Mozaz et al. (2004), podemos classificar os biossensores
em quatro grupos diferentes, de acordo com a forma de conversão do sinal:
2.1.1. BIOSSENSORES ELETROQUÍMICOS
Neste grupo de biossensores, a reação entre o receptor biológico e o analito
estudado gera variações na corrente ou no potencial, que são medidas por eletrodos
amperométricos ou potenciométricos, respectivamente. A maioria dos biossensores
descritos na literatura é eletroquímica, o que pode ser explicado pela alta sensibi-
lidade destes eletrodos e as suas compatibilidades com as modernas tecnologias de
microfabricação, portabilidade e baixo custo (Rodriguez-Mozaz et al., 2004).
Os biossensores eletroquímicos nos permitem trabalhar com amostras turvas e
apresentam custos menores, quando comparados com os métodos ópticos. Por
outro lado, dependendo das condições experimentais, podem apresentar uma
ligeira perda de sensibilidade e seletividade (Lazcka et al., 2007).
2.1.2. BIOSSENSORES ÓPTICOS
Neste grupo de biossensores, a reação entre o receptor biológico e o analito
estudado, produz ou absorve luz, que é comumente detectada por tubos
fotomultiplicadores. Estes biossensores são os mais utilizados para bioanálise, sendo
o segundo grupo mais comum de biossensores. Eles têm sido utilizados para a
detecção de contaminantes, drogas, substâncias tóxicas e agentes patogênicos. Os
sensores ópticos, além de rápidos, possuem componentes de miniaturização
adequados e apresentam a capacidade de analisar mais de um elemento simulta-
neamente (Rodriguez-Mozaz et al., 2004; Lazcka et al., 2007).
2.1.3. BIOSSENSORES SENSÍVEIS À MASSA (PIEZOELÉTRICOS)
Neste grupo de biossensores, a reação entre o receptor biológico e o analito
estudado faz com que a massa do receptor biológico aumente. Para este grupo de
biossensores, as quantidades necessárias de receptor e de amostra são extremamente
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reduzidas e os limites de detecção alcançados são bastante baixos quando
comparados com os métodos clássicos. Além disso, estes biossensores permitem
o monitoramento em tempo real no ar, no vácuo ou em amostras ambientais
que se encontrem no estado líquido (Rodriguez-Mozaz et al., 2004).
2.1.4. BIOSSENSORES TERMOMÉTRICOS
Estes biossensores são baseados na detecção de alterações de temperatura
provenientes de reações biológicas que produzem calor. Suas aplicações são,
principalmente, na área clínica e em processos industriais. No campo ambiental,
suas aplicações começaram a ser estudadas para a identificação de alguns pesticidas
cujas reações produzem calor (Rodriguez-Mozaz et al., 2004).
2.2. CLASSIFICAÇÃO CONFORME O ELEMENTO BIOLÓGICO RECEPTOR
Os biossensores podem ser divididos em dois grupos, de acordo com o
elemento biológico receptor: biocatalíticos (ex: enzimas, microorganismos,
organelas, células ou tecidos de plantas e animais) e bioligantes (ex: anticorpos,
receptores, ácidos nucléicos). Recentemente, alguns elementos artificiais também
têm sido considerados como elementos biológicos receptores, tais como os polímeros
biomiméticos, que possuem as mesmas características de seletividade e apresentam
vantagens em relação à estabilidade química e capacidade de adsorção (Nakamura
& Karube, 2003; Tarley, 2005).
2.2.1. BIOSSENSORES IMUNOLÓGICOS
Nestes biossensores, anticorpos são usados como o elemento biológico receptor.
A detecção pode ser eletroquímica, quando o anticorpo é previamente imobilizado
num eletrodo, ou óptica, quando o anticorpo é imobilizado em um suporte.
A imobilização pode ser através de adsorção passiva, interações covalentes ou
através de uma matriz de gel (Castillo et al., 2004; Patel, 2002).
2.2.2. BIOSSENSORES DE ÁCIDO NUCLÉICO
Muitos biossensores de ácido nucléico são baseados na capacidade de
hibridização das moléculas de DNA e de RNA. Muitos testes de toxicidade são
baseados na interação do composto tóxico com a molécula de DNA, imobilizada
em um suporte adequado, desenvolvida especificamente para monitoramentos
ambientais e testes de triagem (Baeumner, 2003).
2.2.3. BIOSSENSORES ENZIMÁTICOS
O primeiro biossensor descrito na literatura era do tipo enzimático,
desenvolvido para a detecção de glicose (Clark & Lions 2006). As enzimas são
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substâncias orgânicas de natureza protéica, com atividade intra ou extracelular e
que induzem reações químicas que dificilmente aconteceriam sem a sua presença.
Este tipo de biossensor utiliza enzimas específicas que interagem com o analito de
interesse, gerando produtos que são detectados diretamente pelo conversor. Os
biossensores enzimáticos representam um dos maiores grupos de sensores com apli-
cações em amostras ambientais e de alimentos (Baeumner, 2003; Castillo et al., 2004).
2.2.4. BIOSSENSORES CELULARES
Os biossensores podem ser construídos com componentesbiológicos isolados
(ex: proteínas, anticorpos, ácido nucléicos, etc.) ou com organismos íntegros
(ex: células microbianas intactas). Existem algumas questões que devem ser consi-
deradas quanto ao uso de organismos íntegros, tais como: tempo de vida da
célula, maiores tempos de resposta e de retorno do sinal a linha de base,
possibilidade de obtenção de baixa reprodutibilidade devido à variabilidade
entre lotes de células produzidas, provável influência dos mecanismos de trans-
porte e metabolismo celular no sinal do biosensor e etc. Um ponto fundamental
para este tipo de biossensor é o controle cuidadoso das condições de cultivo
celular. A idade da cultura, a temperatura, a densidade celular, as condições de
aeração das culturas (caso isto seja necessário) durante o cultivo e a experi-
mentação podem afetar significativamente a resposta dos biossensores celulares
(Ramanathan et al., 1997).
Apesar destas questões, as quais não são insuperáveis, existem várias vantagens
no uso de células íntegras em biossensores. Primeiramente, a construção destes
biossensores é mais barata, uma vez que, geralmente, as células são produzidas
facilmente, em grandes quantidades e não é necessario o isolamento dos compo-
nentes celulares receptores, que muitas vezes requerem técnicas analíticas sofisti-
cadas. Em segundo lugar, estes biossensores são geralmente mais tolerantes às
condições experientais (ex: temperatura e pH fora dos limites usuais), uma vez
que os componentes biológicos se encontram no ambiente intracelular que é
controlado internamente por mecanismos celulares. Portanto, muitas vezes, este
tipo de biossensor apresenta maior estabilidade e duração de uso, que os
biossensores construídos com componentes biológicos isolados. Por último, com o
uso deste tipo de biossensor podemos obter informações sobre o funcionamento
do analito dentro da célula, como o efeito estimulante ou inibidor (agonista ou
antagonista) ou a toxicidade do analito (causando a morte celular), que depen-
dendo do objetivo do estudo, podem ser muito valiosas. Por estas razões, existe
um grande número de biossensores construídos com células íntegras, descritos na
literatura. Biossensores baseados neste tipo de elemento biológico são amplamente
utilizados no monitoramento de contaminantes químicos no meio ambiente, como
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é o caso do monitoramento da demanda bioquímica de oxigênio (DBO) e de
metais pesados (Selifonova et al., 1993; Bousse, 1996; Ramanathan et al., 1997).
Um importante subgrupo de biossensores celulares utiliza células microbianas
íntegras (biossensores microbianos). Eles apresentam uma configuração um pouco
diferente da definição descrita anteriomente. Embora existam uma grande
variedade de arranjos, o princípio geralmente utilizado na construção deste tipo
de biossensores se baseia na técnica do DNA recombinante (Figura 3). Nesta
abordagem, um gene sinalizador é colocado sob o controle de um promotor,
muitas vezes proveniente de um gene de resistência à substância que se deseja
estudar, o qual é induzido apenas pela presença intracelular desta substância. O
material genético manipulado pode ser inserido em um organismo hospedeiro,
que por sua vez pode ser imobilizado ou não em um substrato. Enquanto a
especificidade do biosensor é determinada pelo promotor, a sua sensibilidade é
definida pela efetividade da expressão do gene sinalizador. Fazendo uma analogia
com a definição clássica de biossensores, o promotor funciona como o elemento
receptor enquanto o gene sinalizador é o elemento conversor. Assim a célula
como um todo funciona como um sistema bioanalítico. A detecção da expressão
do gene sinalizador pode ocorrer por uma diminuição do consumo de oxigênio,
pela degradação e detecção de xenobióticos ou por alterações extracelulares.
Estas alterações podem ser mensuradas quantitativamente por detectores
eletroquímicos (ex: mudança de pH) ou ópticos (ex: produção de luz), ou mesmo
qualitativamente, como no caso de reações bioluminescentes que não necessitem
da adição de outros substratos (ex: gene da proteína flourescente verde). Vários
promotores diferentes tem sido utilizados na construção de biossensores
microbianos. Entretanto existem poucos genes sinalizadores disponíveis para
serem usados na construção de biossensores. Na sua maioria, eles codificam
proteínas facilmente detectáveis, muitas delas luminescentes ou fluorescentes. Os
biossensores microbianos têm sido usados de duas maneiras: para detecção de
analitos específicos (ex: metais e compostos orgânicos) ou para a avaliação de
parâmetros mais genéricos como genotoxicidade (Patel, 2002; Köhler et al., 2000).
Figura 3
Representação do princípio dos Biossensores Microbianos (adaptado de Köhler et al., 2000).
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3. APLICAÇÕES DOS BIOSSENSORES
3.1. APLICAÇÕES EM ALIMENTOS
Para garantir a qualidade dos produtos e o controle das etapas de produção,
as indústrias de bebidas e de alimentos necessitam de métodos analíticos para
detecção de contaminantes e de patógenos, rápidos e precisos. Embora existam
técnicas analíticas tradicionais que atendem a estes requisitos, estas requerem
elevado investimento financeiro e geralmente um longo tempo para preparo das
amostras. Os biossensores tem se mostrado como uma alternativa promissora
neste campo, graças à seletividade, à rapidez e ao baixo custo deste tipo de
tecnologia. Embora, nos últimos anos, tenha sido publicado um grande número
de trabalhos sobre o uso de biossensores para análise de alimentos, poucos desses
sistemas estão disponíveis comercialmente, uma das razões para este fato é a curta
vida útil do componente biológico (Harkensee et al., 2006; Carelli et al., 2007;
Vermeir et al., 2008).
Para análise de alimentos, a maior parte dos biossensores desenvolvidos tem
como princípio a inibição da atividade enzimática. A enzima acetilcolinesterase é
usada em 50% das análises, enquanto que a butilcolinesterase é usada em 11%
dos casos. As aplicações de biossensores enzimáticos em alimentos restringem-se,
preferencialmente, à análise de pesticidas (71%) e de metais pesados (21%).
Outros compostos como glicoalcalóides, ácido benzóico, cianamida
hidrogenada, óxido nítrico e neurotoxinas, representam 8% do uso desta
tecnologia (Amine et al., 2006).
Xavier et al. (2000) utilizaram um biossensor de fibra ótica para detecção de
dois pesticidas da classe carbamato (propoxur e carbaril) em cultivo de vegetais.
Enquanto Del Carlo et al. (2005) aplicaram um biossensor eletroquímico de inibição
enzimática para analisar a presença de carbamatos e organofosforados em amostras
de origem animal. Os resultados obtidos nestes estudos demonstraram que os
biossensores foram precisos, sensíveis e com baixo tempo de resposta, além de
serem simples de manipular.
Outros estudos bem sucedidos, relatados na literatura, com biossensores
eletroquímicos são: amostras de plantas em Del Carlo et al. (2002); suco de uva em
Ivanov et al. (2003); extrato de maçã e trigo em Amine et al. (2006) e ensaios com
amostras de maionese (matriz hidrofóbica) e de refrigerantes contendo cola (matriz
hidrofílica) para detecção de ácido benzóico em Morales et al. (2002).
3.2. APLICAÇÕES BIOMÉDICAS
Na área biomédica, o biossensor mais utilizado associa sensores amperométricos
com receptores enzimáticos. Dentre as suas aplicações, podemos destacar o
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monitoramento da glicose no sangue in situ. Neste caso, a enzima oxidase reage
quando há açúcar no sangue analisado e transmite um sinal, com intensidade
proporcional à quantidade de glicose detectada pelo eletrodo (Abel & Von
Woedtke, 2002).
O uso de biossensores na medicina apresenta uma série de vantagens como,
por exemplo, detecção rápida do analito sem tratamento prévio da amostra,
facilidade no manuseio e necessidade de uma quantidade pequena da amostra
para análise. Além da glicose, outras substâncias de importância biomédica são
detectadas a partir de biossensores amperométricos enzimáticos como o lactato, a
uréia, o glutamato, a creatinina, o álcool e o colesterol (Castillo et al., 2004).
Recentemente, Maki et al. (2008) desenvolveram o primeiro biossensor capaz
de detectar a metilação do DNA celular, alteração capaz de provocar a formação
de tumores malignos. Esse sistema tem como alvo o promotor do gene p16INK,
gene de supressão tumoral, o qual é capturado e concentrado em pontos
magnéticos. A presença de moléculas do DNA alvo provoca alterações na carga
elétrica que geram sinais detectáveis pelo sensor. Este sistema teve limite de detecção
adequado e não apresentou resultados falsos positivos.
3.3 APLICAÇÕES AMBIENTAIS
Centenas de substâncias químicas têm sido liberadas todos os anos no meio
ambiente sem que sejam conhecidos seus possíveis efeitos tóxicos para saúde
humana e ambiental. Por esse motivo, é de extrema importância o contínuo
desenvolvimento de novas técnicas analíticas capazes de avaliar os riscos relacio-
nados à liberação desses contaminantes no ambiente e à exposição humana
(Sorensen et al., 2003). Neste contexto, a tecnologia dos biossensores surge como
uma abordagem promissora. Além de possuir diversas características que fazem o
seu uso para o monitoramento ambiental de poluentes mais vantajoso em relação
a outras técnicas, os biossensores complementam os métodos analíticos tradicionais,
gerando novas informações que são fundamentais para avaliação do risco de
poluentes (Marco & Barceló, 1996).
3.3.1. DISRUPTORES ENDÓCRINOS
Os disruptores endócrinos formam uma nova categoria de contaminantes
ambientais, capazes de mimetizar ou antagonizar os efeitos de hormônios
endógenos masculinos e femininos, como o estrógeno e o andrógeno, e de
interferir na sua síntese ou metabolismo. Essa classe de poluentes, que inclui
estrógenos naturais ou farmacêuticos, fitoestrógenos, alquilfenóis, dioxinas,
hidrocarbonetos policíclicos aromáticos e pesticidas organoclorados, não é
conhecida por sua natureza química, mas por seus efeitos biológicos. A principal
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via de exposição humana a esses compostos é através do contato com águas
contaminadas por esgoto doméstico e industrial ou por efluentes de áreas de
cultivo vegetal (Marchesini et al., 2007; Pillon et al., 2005 Dempsey et al., 2004).
Os disruptores endócrinos podem ser detectados através de técnicas analíticas
clássicas, como a cromatografia líquida de alta performance, cromatografia a gás
ou técnicas imunoquímicas como o teste ELISA (De Melenauer et al., 2002). O
principal problema destas técnicas é que a especificidade do método permite a
detecção de somente um composto ou um grupo de compostos relacionados
estruturalmente (Cliquet et al., 2003). Entretanto, os disruptores endócrinos
apresentam uma grande diversidade estrutural. Nesse sentindo, os biossensores
são a melhor alternativa tecnológica, pois permitem distinguir a fração biodisponível
e a toxicidade do contaminante analisado. As duas principais classes de biossensores
são os que medem efeitos endócrinos e aqueles que respondem à presença de
substâncias específicas baseados no reconhecimento específico de uma molécula
biológica. Foi desenvolvida uma série de biossensores específicos para alguns
importantes disruptores endócrinos, tais como: resíduos de esteróides, compostos
bifenil policlorados, compostos fenólicos, surfactantes, hidrocarbonetos aromáticos
policíclicos e pesticidas (Rodriguez-Mozaz et al., 2004). Estudos recentes têm
ressaltado a importância da aplicação dos biossensores na detecção de disruptores
endócrinos e novos produtos vêm sendo desenvolvidos e patenteados com este
objetivo (Pillon et al., 2005; Dittmer et al., 2008; Marchesini et al., 2008).
Os resíduos de esteróides são encontrados na carne de animais, no solo e na água
que recebem os excrementos desses animais. Embora sua concentração na água seja
freqüentemente baixa, seu uso é amplamente disseminado, o que torna preocupante
sua presença no ambiente aquático. Algumas técnicas têm sido empregadas para
a análise de esteróides e outros poluentes orgânicos na água, principalmente o uso
de imunossensores ópticos (Lopez de Alda & Barcelo, 2001; Lange et al., 2002).
Os compostos bifenil policlorados são reconhecidos como poluentes ampla-
mente distribuídos no ambiente, em decorrência de sua utilização industrial. Sua
alta toxicidade representa um risco de saúde pública. Existem na literatura regis-
tros sobre a utilização de biossensores de DNA, enzimáticos, celulares e
imunossensores para a detecção destes compostos em águas de rios (Del Carlo et al.,
1997; Marrazza et al., 1999).
Os surfactantes, um grupo de poluentes orgânicos de larga distribuição no
meio ambiente, têm sido detectados a partir da utilização de biossensores
microbianos e imunossensores com detecção eletroquímica (Reshetilov et al., 1997;
Taranova et al., 2002).
Os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos apresentam-se distribuídos de forma
abundante no ambiente e são reconhecidos como carcinogênicos. Podem atuar
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como bloqueadores da ativação do receptor de estrogênio ou disparando um
largo espectro de respostas antiestrogênicas a partir da indução de genes
específicos. Para sua detecção no ambiente, foram desenvolvidos biossensores
microbianos com resposta amperométrica e imunossensores fluorescentes (Alarie
et al., 1990; Koenig et al., 1997).
Apesar do grande número de biossensores em desenvolvimento e de pesquisas
nessa área, poucas soluções práticas voltadas à aplicação ambiental estão dispo-
níveis comercialmente.
3.3.2. PESTICIDAS
Segundo a Organização Mundial de Saúde, dois milhões de pessoas são into-
xicadas por pesticidas anualmente e cerca de duzentas mil chegam a óbito (WHO,
1990). A toxicidade de alguns pesticidas está relacionada com a sua capacidade
de modificar irreversivelmente a enzima acetilcolinesterase (AChE) (Vakurov et
al., 2004). Nas últimas décadas, uma série de estudos demonstrou que as enzimas
da classe colinesterase (ChO) são extremamente eficazes para análise de toxicidade
de pesticidas em programas de monitoramento ambiental. Conseqüentemente, na
maioria dos estudos relatados na literatura para a detecção de pesticidas, utilizou-se
biossensores enzimáticos, cujo princípio consiste exatamente na inibição enzimática.
Para a construção de biossensores podem ser usados dois tipos deChO: a
acetilcolinesterase (AChE) e a butirilcolinesterase (BuChE), que podem apresentar
diferentes níveis de especificidade e de susceptibilidade dependendo da fonte
utilizada (Cremisini et al., 1995; Marques et al., 2004; Dzyadevych et al., 2005).
Embora as enzimas ChO possuam sensibilidade adequada, pesticidas com
estruturas químicas bastante diferentes entre si (ex: carbamatos e organofosforados)
inibem o funcionamento da enzima de forma bastante similar, indicando baixa
seletividade. Para atenuar a falta de especificidade, novas enzimas têm sido desen-
volvidas em laboratório através de manipulações genéticas, podendo ser usadas
para detecção específica de analitos (Andrés & Narayanaswamy, 1997).
Os primeiros biossensores com ChO surgiram na década de 1980, para
detecção de pesticidas organofosforados através de alterações de corrente elétrica
(Andreescu & Marty, 2006). Até hoje esse tipo de tecnologia é aplicada, mas tem
passado por inovações para aumento da sua eficácia. Como por exemplo, no
trabalho de Du et al. (2007) em que se testou o uso de quitosan como matriz
enzimática, visando aumentar a compatibilidade e a estabilidade da enzima AChE
no eletrodo. Esse estudo corrobora outros trabalhos (Skladal et al., 1996; Schulze
et al., 2005) que apontam a elevada sensibilidade da AChE quando exposta a
pesticidas. A sensibilidade da enzima ao pesticida testado é determinada pelas
alterações no seu comportamento eletroquímico.
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Como alternativa ao uso de enzimas, Natarajan et al. (2006) desenvolveram
um biossensor para detecção de piretróides através do uso de células cardíacas
associadas a microeletrodos. Esse dispositivo demonstrou sensibilidade a todos os
piretróides testados (alfa-cipermetrin, tetrametrin e teflutrin) e respostas similares
na freqüência e na amplitude dos batimentos das células.
Outros estudos apresentaram bons resultados utilizando imunossensores
piezelétricos (Yokoyama et al., 1995; Horacek & Skladal, 1997) e amperométricos
(Schipper et al., 1998; Mallat et al., 2001) para a análise de alguns pesticidas.
3.3.3. FENOL
Os compostos fenólicos encontrados em ambientes aquáticos podem ser
provenientes da degradação natural de substâncias usadas na agricultura e em
atividades industriais, destacando-se neste grupo os nitrofenóis e os clorofenóis.
Essa classe de contaminantes apresenta elevada toxicidade e pode ser acumulada
em compartimentos ambientais (Leejarv et al., 2006; Degiuli & Blum, 2000).
Leejarv et al. (2006) aplicaram um biossensor celular bacteriano para detecção
de compostos fenólicos em amostras ambientais. Para isso, foi usada como sensor
a bactéria Pseudomonas fluorescens OS8 contendo o operon luxCDABE sob o controle
do gene promotor Po, proveniente da cepa Pseudomonas sp. CF600 e ativado pela
presença de fenol.
Biossensores amperométricos utilizando diferentes elementos biológicos
receptores foram desenvolvidos para análises de compostos fenólicos em amostras
ambientais. Por exemplo, Parellada et al. (1998) desenvolveram um biossensor
utilizando a enzima tirosinase, imobilizada em matriz de hidrogel e disposta
sobre um eletrodo de grafite. Esse dispositivo apresentou resultados analíticos
análogos aos obtidos utilizando métodos convencionais. Mais recentemente Kafi
et al. (2008) detectaram vários tipos de compostos fenólicos utilizando um
biossensor composto de hemoglobinas retidas em uma matriz sol-gel e associadas
a um eletrodo amperométrico.
3.3.4. NITRITO
Nitritos são amplamente usados para a preservação de alimentos e para a
fertilização de solos. Entretanto, a ingestão contínua desses íons pode causar
graves implicações na saúde humana, inclusive câncer. Particularmente o nitrito
pode reagir irreversivelmente com a hemoglobina, interferindo no transporte de
oxigênio no sangue (Mirvish, 1995; Moorcroft, 2001).
Chen et al. (2007) desenvolveram um biossensor para determinação
amperométrica de nitrito utilizando o citocromo c da enzima nitrito redutase
(ccNiR), proveniente da bactéria Desulfovibrio desulfuricans, imobilizado e conectado
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a um eletrodo. O biossensor apresentou um tempo de resposta rápido ao nitrito
e um limite de detecção adequado às análises ambientais. Embora não seja
especifico, o biossensor para nitrito demonstrou ser mais seletivo do que os métodos
espectrofotométricos baseados na Reação de Grisses, os quais são susceptíveis a
interferências de matrizes complexas. Mais recentemente, Dai e colaboradores
(2008) descreveram outro biossensor eletroquímico para determinação de nitrito.
Este se baseia na transferência de hemoglobinas imobilizadas em nanoesferas de
HS-CdS. Os resutados obtidos no estudo comprovaram a aplicabilidade desta
abordagem para atingir os objetivos propostos.
3.3.5. DEMANDA BIOQUÍMICA DE OXIGÊNIO
A demanda bioquímica de oxigênio (DBO) é um método capaz de detectar a
presença de substâncias biodegradáveis no ambiente, sendo considerado um dos
parâmetros mais importante para determinar a qualidade da água. A longa demora
do método tradicional, que requer cinco dias, contribuiu para que em 1977 fosse
desenvolvido o primeiro biossensor para DBO. Este consistia em um eletrodo
para oxigênio dissolvido associado à levedura T. cutaneum (Karube et al., 1977).
Embora já tenham sido construídos diversos tipos de biossensores para detecção
rápida de DBO que associam eletrodos de oxigênio e microorganismos aeróbicos
(Lehmann et al., 1999; Kim & Kwon, 1999), é difícil manter a atividade e a estabi-
lidade da membrana de células sobre o eletrodo de oxigênio por um longo período.
Em 2003, Nakamura e Karube desenvolveram um novo sistema para medição
de DBO a partir de células de Escherichia coli recombinadas com os genes lux A-E
de Vibrio fisheri. Com este sistema foi possível a análise de múltiplas amostras em
tempo real. Esses dispositivos de uso prático têm sido comercializados principal-
mente para indústrias farmacêuticas e alimentícias. Recentemente, Sakaguchi et al.
(2007) desenvolveram outro biossensor óptico para monitoramento de DBO, no
qual a bactéria luminescente Photobacterium phosphoreum IFO 13896 foi imobilizada
sobre um bio-chip. Esse sistema foi capaz de detectar valores de DBO inferiores
a 16 ppm e os valores apresentaram correlação similar aos obtidos através do
método convencional.
3.3.6. METAIS
O perigo associado à poluição por metais pesados é decorrente da presença
ubíqua destes elementos na biosfera em formas bioacessíveis, provenientes tanto
de fontes naturais quanto antropogênicas, e de sua elevada toxicidade. Assim,
existem vários casos descritos na literatura onde a exposição de populações a estes
poluentes resultou em danos severos à sua saúde humana, inclusive com números
significativos de óbitos. Os contaminantes metálicos mais comumente observados
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são: chumbo, cromo, zinco, mercúrio, cádmio e cobre (Maffia & Davis, 2001). A
tecnologia dos biossensores tem sido cada vez mais aplicada em estudos para
monitoramento de metais tóxicos no ambiente, inclusive várias revisões foram
publicadas sobre este tema (Selifonova et al., 1993; Ramanathan et al., 1997; Riether
et al., 2001; Stoyanov etal., 2003; Ren & Frymier, 2005).
Muitos dos biossensores desenvolvidos para análises de metais em amostras
ambientais se utilizam de genes específicos de resistência bacteriana a estes
elementos, como elementos biológicos receptores. Ao longo da evolução, os
microorganismos desenvolveram mecanismos que permitem sua sobrevivência na
presença de metais. Já foram isoladas cepas bacterianas resistentes a uma série de
metais como zinco, cobre, estanho, prata, mercúrio e cobalto. Estes genes de
resistência a metais são induzidos apenas quando o elemento atinge o citoplasma
bacteriano. A especificidade desse mecanismo de resistência contribuiu para que
fossem construídos biossensores celulares para detecção de metais, a partir da
fusão desses genes de resistência com genes codificadores de proteínas
bioluminescentes, como por exemplo, a luciferina. A produção de luz indica a
presença do metal investigado na amostra e pode ser medida por instrumentos
como luminômetros e fotômetros (Ramanathan et al., 1997).
Em 1993, Selifonova e colaboradores desenvolveram biossensores para
detecção de espécies mercuriais biodisponíveis no meio ambiente. Esses sistemas
foram construídos a partir da fusão de genes do operon Tn21, que confere
resistência ao mercúrio, com os genes luxCDABE da bactéria Vibrio fischeri. Os
resultados demonstraram a grande eficiência desta abordagem para análise de
mercúrio em água doce, de chuva e de estuários. Sendo capaz de detectar
concentrações mercuriais na faixa nanomolar. Mais tarde, Omura e colaboradores
(2004) desenvolveram um biossensor para mercúrio ainda mais sensível, capaz de
ser ativado na concentração de 2 pM de mercúrio em 1 mL de amostra de água
contaminada. Esse biossensor foi construído também a partir da fusão do operon
de resistência ao mercúrio presente no plasmídio pMR26 da cepa Pseudomonas K-62
com o gene luxAB de Vibrio harveyi.
Em 2000, Campbell e colaboradores construíram um biossensor bacteriano
luminescente geneticamente modificado para avaliar a relação entre a toxicidade
de metais e a presença de íons livres. Neste ensaio, uma cepa de Escherichia coli
HB101, contendo os genes lux no plasmídio pUCD607 foi exposta a Cd, Cu e Zn
na presença de substâncias quelantes (EDTA e ácido fúlvico) posteriormente,
foram feitas medições das respostas biológicas aos metais tóxicos. Os resultados do
trabalho mostraram que nem sempre é possível estabelecer uma relação direta
entre biodisponibilidade e toxicidade, indicando que células vivas competem
ativamente pelos metais com as substâncias de caráter ligante.
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4. PERSPECTIVAS FUTURAS PARA A TECNOLOGIA DOS BIOSSENSORES
Os avanços nas áreas de bioquímica, química analítica, bioeletrônica e ciências
dos materiais determinarão os próximos passos da tecnologia dos biossensores. O
progresso dos biossensores depende principalmente da evolução em dois campos:
melhoria na tecnologia dos elementos conversores e o aumento de elementos
biológicos receptores disponíveis. Espera-se em um futuro próximo, a significativa
melhora nos sistemas de conversão e detecção utilizados nos biossensores a partir
das pesquisas em micro-eletrônica e nano-eletrônica, ou mesmo, o desenvolvi-
mento de novos materiais ópticos. Da mesma forma, a criação de novos elementos
biológicos receptores como resultado de pesquisas nas áreas de biotecnologia e
engenharia genética, influenciarão grandemente a produção dos novos biossensores.
A nossa capacidade de projetar e construir elementos biológicos com propriedades
físico-químicas específicas desejadas tem crescido bastante nas últimas décadas,
inclusive com a criação de moléculas sintéticas (ex: ácidos nucléicos sintéticos) e a
manipulação gênica de células (ex: produção de células bioluminescentes) e será
determinante para o desenvolvimento do campo dos biossensores. Por fim, apesar
dos resultados e avanços já obtidos por esta nova tecnologia, existe ainda a neces-
sidade de melhorar os métodos de construção empregados. Uma questão crucial
para o desenvolvimento de novos e melhores biossensores é a eficiente imobilização
dos elementos biológicos receptores em matrizes adequadas. Isto garante a sua
efetiva conexão com elemento conversor, aumentando a estabilidade, a
reprodutibilidade e o tempo de vida útil do biossensor. Para isso novas técnicas
têm sido desenvolvidas ou adaptadas de outras áreas (ex: eletropolimerização) e
acredita-se que avanços nestas áreas terão um impacto importante na tecnologia
dos biossensores.
Outra tendência que deve se confirmar no campo dos biossensores é o
aumento da disponibilidade e a conseqüente comercialização de sistemas paten-
teados por grandes empresas para análise de vários analitos (ex: metais, pesticidas,
etc.), resultado do investimento maciço que os países desenvolvidos têm aplicado
nesta área nas últimas décadas. De maneira análoga, espera-se o crescimento no
número de substâncias analisadas por biossensores, sobretudo já observar-se um
esforço dos pesquisadores para o desenvolvimento de biossensores para o estudo
de novas classes de contaminantes (ex: disruptores endócrinos).
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Recebido em: 19/08/2008
Aprovado em: 08/12/2008
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