BIOMOL AULA 01

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14/08 - AULA 01 – BIOLOGIA MOLECULAR – INTRODUÇÃO
INTRODUÇÃO
· A biologia molecular é a área da biologia que busca estudar os organismos do ponto de vista molecular, focando principalmente na base de todos os organismos, os ácidos nucleicos, que formam RNAs e DNAs que posteriormente dão origem às proteínas;
· Ciência multidisciplinar: Nascida da junção dos ramos da genética, da bioquímica, da biologia celular entre outras áreas, a biologia molecular é um campo que visa entender os fenômenos biológicos e como estes se relacionam com o material genético do organismo. Mais especificamente, ela estuda os processos de replicação, transcrição e tradução do material genético e a regulação destes processos.
DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR ==> Fluxo da informação genética.
· O dogma central da Biologia Molecular, proposto por Francis Crick em 1958, consiste em explicar como as informações contidas no DNA são transmitidas. Em síntese, ele explica que o fluxo das informações genéticas ocorre na seguinte sequência: DNA → RNA→ PROTEÍNAS.
· Isso significa que o DNA promove a produção de RNA (Transcrição), o qual por sua vez codifica a produção de proteínas (Tradução). No momento da descoberta, acreditava-se que esse fluxo não poderia ser invertido. Hoje, sabe-se que a enzima transcriptase reversa é capaz de sintetizar DNA a partir do RNA.
HISTÓRICO
· A história da Biologia Molecular começa a ter início com a suspeita de algum tipo de material presente no núcleo celular.
· Os ácidos nucleicos foram descobertos em 1869, pelo pesquisador Johann Friedrich Miescher ao analisar o núcleo de glóbulos brancos do pus de feridas. Porém, eles foram inicialmente denominados de nucleínas. 
· Os glóbulos brancos eram um bom material pois são células que apresentam núcleos grandes e fáceis de serem isolados do citoplasma. Além disso, o pus era muito fácil de se conseguir na época em ataduras usadas em ferimentos. Miescher descobriu a presença de um composto de natureza ácida que era desconhecido até o momento. Esse composto era rico em fósforo e em nitrogênio, era desprovido de enxofre e resistente à ação da pepsina (enzima proteolítica).
HISTÓRICO - O DNA COMO MOLÉCULA DA HEREDITARIEDADE: EVIDÊNCIAS EXPERIMENTAIS
· O trabalho de Gregor Mendel mostrou que características (como a coloração da flor em plantas de ervilha) não eram herdadas diretamente, mas ao invés, eram especificadas por genes que passam dos pais para a prole. O trabalho de outros cientistas por volta do século 20, incluindo Theodor Boveri, Walter Sutton e Thomas Hunt Morgan, estabeleceram que os fatores hereditários de Mendel eram, provavelmente, transmitidos pelos cromossomos.
· Cientistas inicialmente pensaram que as proteínas, que são encontradas em cromossomos ao longo do DNA, seriam as componentes do tão procurado material genético. Proteínas eram conhecidas por suas sequências diversas de aminoácidos, enquanto se pensava que o DNA era um polímero entediante e repetitivo, devido, em parte, a um modelo incorreto (mas popular) de sua estrutura e composição.
· Hoje, sabemos que o DNA na verdade não é repetitivo e pode carregar grandes quantidades de informação, como discutido mais profundamente no artigo sobre a descoberta da estrutura do DNA. Mas como os cientistas inicialmente perceberam que o "entediante" DNA talvez pudesse ser o material genético?
I. FREDERICK GRIFFITH - Transformação bacteriana (1928)
· Em 1928, o bacteriologista britânico Frederick Griffith conduziu uma série de experimentos usando a bactéria Streptococcus pneumoniae e ratos. Griffith não estava tentando identificar o material genético, mas, sim, criar uma vacina contra a pneumonia. Em seus experimentos, Griffith usou duas cepas relacionadas de bactéria, conhecidas como R e S.
Cepa R --> Quando cultivadas em placa de Petri, a bactéria R forma colônias ou aglomerados de bactérias relacionadas, que têm bordas bem definidas e aparência rugosa (daí a sigla "R"). As bactérias R são avirulentas, significando que não causam doenças quando injetadas em ratos.
 Cepa S --> A bactéria S formou colônias arredondadas e suaves (daí a sigla "S"). A aparência suave se dá por conta de um polissacarídeo ou uma capa a base de açúcar produzida pela bactéria. Essa capa protegeu a bactéria S do sistema imune do rato, fazendo-as virulentos (capazes de causar doenças). Ratos em que foram injetadas bactérias S vivas desenvolveram pneumonia e morreram.
· Como parte de seus experimentos, Griffith tentou injetar ratos com bactérias S mortas por calor (isso é, bactérias que haviam sido aquecidas a altas temperaturas, causando a morte das células). Sem surpresas, a bactéria S morta pelo calor não causou doença nos ratos.
· Os experimentos tiveram um resultado inesperado, contudo, quando bactérias R inofensivas foram combinadas com bactérias S mortas por calor e injetadas em um rato. Não só o rato contraiu pneumonia e morreu, mas quando Griffith retirou uma amostra de sangue do rato morto, ele encontrou bactérias S vivas!
· Griffith concluiu que as bactérias da cepa R teriam adquirido o que ele chamou de "princípio transformante" da bactéria S morta por calor, permitindo que elas se "transformassem" em bactérias S, tornando-se virulentas. Ou seja, cepas bacterianas não-patogênicas podem se tornar infecciosas quando misturadas com uma cepa virulenta inativada por calor.
II. AVERY, MACLEOD E MCCARTY - Identificando o princípio transformante (1944)
· Em 1944, três pesquisadores, canadenses e americanos, Oswald Avery, Maclyn McCarty, e Colin MacLeod, dispuseram-se a identificar o "princípio transformante" de Griffith.
· Para tanto, eles começaram com grandes culturas de células S inativadas por calor e, através de uma longa série de etapas bioquímicas (determinadas por experimentação cuidadosa), purificaram progressivamente o princípio transformante através de lavagens, separação, ou destruição enzimática dos outros componentes celulares. Por este método, eles foram capazes de obter pequenas quantidades de princípio transformante altamente purificado, que eles puderam então analisar através de outros testes para determinar sua identidade.
· Várias linhas de evidência sugeriram a Avery e seus colegas que o princípio transformante poderia ser DNA:
i. A substância purificada apresentou resultados negativos em testes químicos conhecidos para detectar proteínas, mas um resultado fortemente positivo em um teste químico conhecido para detectar DNA.
ii. A composição dos elementos do princípio transformante purificado assemelhava-se muito a DNA em suas proporções de nitrogênio e fósforo.
iii. Enzimas que degradam proteínas e RNA tinha pouco efeito sobre o princípio transformante, mas enzimas capazes de degradar DNA eliminavam a atividade transformante.
· Todos estes resultados apontavam para DNA como o provável princípio transformante. Contudo, Avery foi cauteloso na interpretação de seus resultados. Ele percebeu que era possível que alguma substância contaminante presente em pequenas quantidades, não DNA, fosse o verdadeiro princípio transformante.
· Por causa desta possibilidade, o debate acerca da função do DNA continuou até 1952, quando Alfred Hershey e Martha Chase usaram uma abordagem diferente para conclusivamente identificar o DNA como o material genético.
III. MARTA CHASE E ALFRED HERSHEY - Experimento do liquidificador (1952)
· Em seus agora lendários experimentos, Hershey e Chase estudaram bacteriófagos, ou vírus que atacam bactérias. Os fagos que usaram era simples partículas compostas de proteína e DNA, com as estruturas externas feitas de proteína e o núcleo interno consistindo de DNA.
· Hershey e Chase sabiam que os fagos prendiam-se à superfície de uma célula bacteriana hospedeira e injetavam alguma substância (DNA ou proteína) no hospedeiro. Esta substância dava "instruções" que faziam a bactéria hospedeira iniciar a produção de muitos e muitos fagos - em outras palavras, era o material genético do fago. Antes do experimento, Hershey pensou que o material genético se provaria ser proteína.
· Para estabelecerse o fago injetava DNA ou proteína no interior da bactéria hospedeira, Hershey e Chase prepararam dois diferentes lotes de fagos. Em cada lote, os fagos eram produzidos na presença de elemento radiativo específico, que era incorporado nas macromoléculas (DNA e proteínas) sintetizadas pelos fagos.
i. Uma amostra foi produzida na presença de S35, um isótopo radioativo do enxofre. O enxofre é encontrado em muitas proteínas e está ausente do DNA, assim somente as proteínas dos fagos eram radioativamente marcadas por esse tratamento.
ii. A outra amostra foi produzida na presença de P32, um isótopo radioativo de fósforo. O fósforo é encontrado no DNA mas não em proteínas, então só o DNA do fago (e não as proteínas do fago) estava marcado radioativamente por este procedimento.
· Cada lote de fagos era usado para infectar uma cultura diferente de bactérias. Após a infecção, cada cultura era turbilhonada em um liquidificador, removendo qualquer fago remanescente e partes de fagos externas às células bacterianas. Finalmente, as culturas eram centrifugadas a alta velocidade, para separar as bactérias dos resíduos de fagos.
· A centrifugação faz o material mais pesado, tais como bactérias, moverem-se para o fundo do tubo e formarem um amontoado chamado sedimentado.
· O material mais leve, tais como o meio (caldo) usado para o crescimento de culturas, junto com fagos e partes de fagos, permanecem próximo à parte de cima do tubo e forma uma camada líquida chamada de sobrenadante.
· Quando Hershey e Chase mediram a radioatividade no sedimentado e no sobrenadante para ambos os experimentos, eles encontraram que uma grande quantidade de P32 apareceu no material sedimentado, enquanto quase todo o S35 apareceu no sobrenadante. Com base neste e em experimentos similares, Hershey e Chase concluíram que o DNA, não a proteína, era injetado nas células hospedeiras e compunham o material genético dos fagos. Ou seja, durante a infecção viral, apenas o material genético viral é transferido para a célula hospedeira e promove a produção de novas partículas virais.
· Usando marcadores radioativos, mostraram que é o DNA de um vírus, e não suas proteínas, que programam as células infectadas para fazer cópias do vírus.
IV. ERWIN CHARGAFF - Regras de Chargaff (1948)
· Chargaff analisou o DNA de diferentes espécies, determinando sua composição de bases A, T, C e G. Ele fez várias observações fundamentais:
I. A, T, C e G não eram encontradas em quantidades iguais (como alguns modelos da época diziam);
II. As quantidades de bases variavam entre as espécies, mas não entre indivíduos da mesma espécie;
III. A quantidade de A sempre igualava a quantidade de T, e a quantidade de C sempre igualava a quantidade de G (A = T e G = C).
Conclusão: No DNA, a razão molar A-T e G-C é sempre a mesma em diferentes organismos estudados.
· Esses resultados, chamados de regras de Chargaff, acabaram sendo cruciais para o modelo de Watson e Crick da dupla hélice de DNA.
V. MAURICE WILKINS E ROSALIND FRANKLIN - Imagem da molécula de DNA (1952)
· Wilkins e Franklin obtêm excelente imagem da molécula de DNA por difração de raio X, revelando uma repetição regular de "blocos moleculares" correspondendo aos nucleotídeos e estrutura compatível com uma alfa-hélice (repetições de 34 Ângstroms e largura de 20 Ângstroms).
VI. WATSON, CRICK E ROSALIND FRANKLIN (início anos 50)
· No início dos anos de 1950, o biólogo americano James Watson e o físico britânico Francis Crick elaboraram seu famoso modelo da dupla hélice de DNA. Eles foram os primeiros a cruzar a linha de chegada nessa "corrida" científica, com outros como Linus Pauling (que descobriu a estrutura secundária da proteína) também tentando encontrar o modelo correto.
· Em vez de fazer novos experimentos no laboratório, Watson e Crick coletaram e analisaram conjuntos de dados já existentes, organizando-os de formas novas e esclarecedoras. Algumas de suas pistas mais cruciais sobre a estrutura do DNA vieram de Rosalind Franklin, uma química que trabalhava no laboratório do físico Maurice Wilkins.
· Franklin era uma especialista em uma técnica poderosa para determinar a estrutura das moléculas, conhecida como cristalografia de raios-x. Quando a forma cristalizada de uma molécula como o DNA é exposta a raios-x, alguns dos raios são defletidos pelos átomos no cristal, formando um padrão de difração que dá pistas sobre a estrutura da molécula.
· A cristalografia de Franklin deu a Watson e Crick pistas importantes para a estrutura do DNA. Algumas vieram da famosa "imagem 51", uma imagem de raio-x de difração do DNA notavelmente clara e impressionante produzida por Franklin e seus estudantes de graduação (imagem superior). Para Watson, o padrão de difração em formato de X da imagem de Franklin imediatamente sugeriu uma estrutura helicoidal, de duas fitas para o DNA.
WATSON E CRICK ROUBARAM DOS DADOS DE FRANKLIN?
· Watson e Crick juntaram dados de um número de pesquisadores (incluindo Franklin, Wilkins, Chargaff e outros) para montar seu celebrado modelo da estrutura de DNA em 3D. Em 1962, James Watson, Francis Crick e Maurice Wilkins foram premiados com o prêmio Nobel de medicina. Infelizmente, a essa altura Franklin já havia morrido, e os prêmios Nobel não são concedidos a título póstumo.
· Contribuíram para o modelo:
I. Erwin Chargaff
- Quantificou as bases nitrogenadas (adenina, timina, citosina e guanina) em diferentes organismos e demonstrou existir uma razão constante entre A-T e G-C --> Evidência para pareamento entre as bases nas duas fitas de DNA.
II. Linus Pauling
- Descreveu a estrutura de alfa-hélice para proteínas --> Mostrou que estrutura de alfa-hélice era possível.
III. Rosalind Franklin e Maurice Wilkins
- Realizaram estudos de difração de raios-X com DNA --> Seus dados foram fundamentais à proposição de estrutura de dupla-hélice.
VII. WATSON E CRICK - Modelo para a estrutura do DNA (1953)
· A estrutura do DNA, como representada no modelo de Watson e Crick, é uma hélice de dupla fita, antiparalela, para a direita. Os esqueletos de açúcar-fosfato das fitas de DNA constituem o exterior da hélice, enquanto as bases nitrogenadas são encontradas no interior e formam pares ligados por ligações de hidrogênio que mantêm as fitas de DNA juntas.
Orientação antiparalela: 
· O DNA de fita dupla é uma molécula antiparalela, ou seja, é composta de duas fitas que correm lado a lado mas apontam para direções opostas. Em uma molécula de DNA de fita dupla, a extremidade 5' (com fostato livre) de uma fita se alinha com a extremidade 3' (com hidroxila livre) de sua parceira, e vice-versa.
Hélice dextrógira (direita): 
· No modelo de Watson e Crick, as duas fitas de DNA enrolam-se uma em volta da outra para formar uma hélice dextrógira. Todas as hélices têm uma direção, que é uma propriedade que descreve como seus filamentos são orientados no espaço. 
· A torção da dupla fita de DNA e a geometria das bases criam um vão maior (chamado de sulco maior) e um vão menor (chamado de sulco menor) que estão ao longo do comprimento da molécula, como mostrado na figura acima. Esses sulcos são importantes locais de ligação para proteínas que mantêm o DNA e regulam a atividade dos genes.
Pareamento de bases:
· No modelo de Watson e Crick, as duas fitas da dupla hélice de DNA são mantidas juntas por ligações de hidrogênio entre as bases nitrogenadas nas fitas opostas. Cada par de bases fica plano, formando um "degrau" da escada da molécula de DNA.
· Pares de base não são feitos de qualquer combinação de bases. Em vez disso, se há um A em uma fita, ele deve ser pareado com um T na outra (e vice-versa). Similarmente, um G encontrado em uma fita, deve sempre ter um C como parceiro na fita oposta. Essas associações A-T e G-C são conhecidas como pares de base complementares.
· O pareamento de bases explica as regras de Chargaff, ou seja, porque a composição de A é sempre igual a de T, e a composição de C se iguala a de G. Onde há um A em uma fita, deve haver um T na outra, e o mesmo é verdade para G e C. Porque umagrande purina (A ou G) é sempre pareada com uma pequena piridimina (T ou C), o diâmetro da hélice é uniforme, chegando a cerca de 2 nanômetros.Apesar do modelo original de Watson e Crick propor que haveriam duas ligações de hidrogênio entre as bases de cada par, sabemos hoje que G e C formam uma ligação adicional (de forma que os pares A-T formam duas ligações de hidrogênio, enquanto pares G-C formam três).
DNA X RNA 
· A principal diferença entre esses dois ácidos nucleicos é que o DNA é o responsável pelo armazenamento da informação genética utilizada no desenvolvimento dos organismos vivos, enquanto o RNA é o responsável por sintetizar proteínas.
· Em sua estrutura, eles se diferem pois o DNA possui duas cadeias helicoidais, enquanto o RNA possui apenas uma cadeia. Porém, o RNA é mais versátil do que o DNA, sendo capaz de realizar inúmeras tarefas em um organismo.
Tipos de RNA:
· RNA mensageiro
- O RNA mensageiro é uma cópia de uma das fitas do DNA, e carrega as informações genéticas do núcleo para o citoplasma de uma célula, onde será produzida a proteína.
· RNA transportador
-O RNA transportador está localizado no citoplasma celular e ele transporta os aminoácidos que serão utilizados na formação das proteínas até os ribossomos, onde acontecerá a síntese das proteínas.
· RNA ribossômico
- O RNA ribossômico está localizado no ribossomo. Quando sintetizados, os rRNA se acumulam, formando os nucléolos, que se combinam com as proteínas para originar os ribossomos.