7 Métodos analiticos

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Prof. Dr. Marcel Rangel
MÉTODOS 
ANALÍTICOS
MÉTODOS ANALÍTICOS
FOTOMETRIA
ESPECTROFOTOMETRIA
ELETROFORESE
CROMATOGRAFIA
FOTOMETRIA
Método de quantificação com base na absorbância da luz – representando toda a enérgica que se propaga no comprimento de onde
380 - VIOLETA
750 - VERMELHO
Sempre utilizar faixas especificas de luz para cada tipo de exame; 
Ex- glicose usa 550nm
FOTOMETRIA DE CHAMA
Quantifica amostras através das propriedades da absorção de energia térmica de emissão de luz em comprimento de onda especifico. 
Na
CALOR
E
LUZ
Cátions com 1e na ultima camada de Valência, assim ao fornecermos calor, eles perdem este ultimo elétron transformando-o em energia - LUZ
http://www.medicalexpo.com/pt/prod/analytik-jena/product-83550-545537.html 
ESPECTROFOTOMETRIA
Método que usa um Prisma para separar a luz, os melhores aparelhos, mais precisos são aqueles que separam faixas mais estreitas de cores.
CONCEITOS BÁSICOS:
TRANSMITÂNCIA
ABSORBÂNCIA
LINEARIDADE
ESPECTROFOTOMETRIA
TRANSMITÂNCIA
Capacidade de uma solução passar parte da luz que nela incide.
A % da transmitância é inversamente proporcional a sua [ ].
** não utilizamos transmitância pois ela é inversamente proporcional a [ ], assim não serve para quantificar amostras, pois é uma variação não linear. 
TRANSMITÂNCIA
ABSORBÂNCIA
Capacidade que uma solução tem de reter parte da luz que nela incide (contrario da transmitância)
Utilizamos a absorbância nos testes bioquímicos pois ela e linear/proporcional a [ ] , assim se dobrarmos a ABS. A [ ] também vai dobrar
ABSORBÂNCIA
LINEARIDADE - DILUIÇÃO
Cada exame tem uma linearidade, assim se o resultado ultrapassa a linearidade do normal, você dilui a amostra reduzindo sua [ ]. No final você multiplica o resultado final pela diluição. 
FATORES DE CALIBRAÇÃO
Fazer o cálculo da [ ] das amostras obtidas pelo padrão.
Ideal realizar a leitura do padrão todo dia, pois se variar a [ ] você pode errar no laudo, se o KIT não tem padrão você multiplica pelo valor fornecido pelo próprio KIT. 
FATORES DE CALIBRAÇÃO
Ex: 
Soro controle normal [ ];
Soro controle patológico [ ]; 
O soro controle patológico não pode resultar em [ ], assim não valida o exame, tendo como possíveis erros:
Calibração do aparelho  comprimento de onda errado não tendo máxima absorção;
Banho Maria  desnaturando reagente (pouco provável);
	
FATORES DE CALIBRAÇÃO
Ex: 
Soro controle normal [ ];
Soro controle patológico [ ]; 
O soro controle patológico esta certo, contudo o normal não pode dar [ ], assim o mais provável que seja erro de pipetação. 
	
CUIDADOS
Aparelho sempre em superfície plana para não desnivelar os raios;
Não deixar na mesma bancada da centrifuga pois da erro no comprimento de onde;
Deixar o aparelho aberto em transmitância, pois se ficar em absorbância ele descalibra. 
ELETROFORESE
Exame que quantifica e identifica substâncias baseado na migração dos compostos carregados, onde são submetidos a um campo elétrico.
Sofrem influência de:
INTENSIDADE DE MIGRAÇÃO;
PESO MOLECULAR;
INTENSIDADE DO CAMPO ELÉTRICO;
INTENSIDADE DE MIGRAÇÃO
Quanto maior a [ ] de elétrons ocorre uma maior migração. 
pH do meio modifica a carga das substancias:
Meio ácido  a carga fica mais + devido o aumento na [ ] de prótons H+, assim migrando para o pólo -;
Meio Básico  a carga fica mais -, fazendo com que ocorra a migração para o pólo +.
Solução tampão bem acondicionada para não interferir no exame.
PESO MOLECULAR
Quanto maior o PM da substância menos ela vai migrar no meio.
INTENSIDADE DO CAMPO ELÉTRICO
Cada substância a ser analisada tem uma voltagem especifica de migração, assim utiliza-se a voltagem especifica para diferenciar substâncias. 
Hemoglobina – utiliza para diferenciar patologias como FALSSEMIAS E TALISSOMIA;
Proteínas Plasmáticas – Diferenciar proteínas totais de albumina;
Isoenzimas – São mesmas enzimas contudo produzidas em locais diferentes do nosso corpo (CK) 
MATERIAL DO MEIO
CELULOSE
ÁGAR / AGAROSE
PAGE
CELULOSE
Barato
Pouca definição / diferenciação nas migrações, 
Com bandas largas e as vezes ocorre sobreposição das bandas. 
ÁGAR / AGAROSE
Barato;
Boa definição;
As vezes não utilizado porque precisa deixar em solução tampão devido o Agar ter Agaropectina com CARGA - , assim pode influenciar no exame. 
PAGE
Caro;
Ótimo diferenciação com bandas estreitas e não ocorre sobreposição das bandas. 
CROMATOGRAFIA
Método de análise que separa substâncias de uma mistura, quantificando e identificando 
FASES
MÓVEL  Solvente se movimenta pela coluna, podendo ser um líquido ou um gás;
ESTACIONÁRIA  Fica dentro da coluna cromatográfica. 
CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA
Retenção se deve a atração entre os íons da substância e os sítios carregados da fase estacionária.
HEMOGLOBINA GLICADA
A HB normalmente tem CARGA +, quando a pessoa esta com diabetes a glicose faz com que esta hemoglobina fique com CARGA NEUTRA, assim coloca-se a fase estacionária com CARGA -, retendo todas as hemoglobinas normais, somente sendo coletada a hemoglobina glicada que será dosada em espectrofotômetro.