Técnica PCR Slide Fisiologia

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Nomes: Letícia Vieira, Paola Macedo, Paulo Hoffmann, Rúbia Marcon e Tainá Maciel.
Turma: Enfermagem 2ª e 3ª fase noturno.
Disciplina: Bases Diagnósticas.
Professora: Karla Lorena Guarido.
 Técnica PCR
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 O que é a Técnica PCR?
Técnica vem do inglês Polymerase Chain Reaction (PCR), que em português significa Reação em Cadeia da Polimerase;
Permitiu o rápido desenvolvimento do estudo de sequências de ácidos; 
É considerada uma técnica de biologia molecular;
Por meio dessa técnica é possível a obtenção de muitas cópias de uma sequência específica de ácido nucleico a partir de uma fita molde;
Cada ciclo é repetido em torno de 60 vezes;
Após o iniciador sinaliza para a polimerase o início da sequência a ser replicada.
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 Etapas da PCR
Extração:
 O primeiro passo é pegar o material genético a ser utilizado, que no caso é o DNA.
 Ele não pode ser alterado e nem contaminado por algum outro reagente que cause um resultado diferente do que se espera da combinação final.
 Essa extração vai ser aquecida a ponto de ser desnaturada juntamente com a região que precisa ser amplificada.
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 Etapas da PCR
Desnaturação:
É dividida em duas partes.
Para que essa etapa da técnica de PCR funcione, o manipulador deve adicionar uma base nitrogenada composta por um três fosfato: os oligonucleotídeos e a polimerase que será usada para promover a reação.
Em seguida, a amostra vai para o termocirculador.
Esse aparelho vai promover variações de temperatura específicas na solução tampão em que se encontra o DNA e a mistura.
Primeira aquece com temperatura máxima de 95° para que as fitas se separem.
Depois vem o resfriamento, com o termociclador apresentando uma temperatura de 50°.
E aí entra a fase de anelamento.
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 Etapas da PCR
Anelamento
Baixar a temperatura de 96 para 60 graus, no termociclador, para que os Primers entrem em ação.
Primers são fragmentos de simples de DNA, +/- 20 nucleotídeos, de sequência exatamente 
complementar a extremidade do fragmento alvo.
Necessário dois primers: um para cada extremidade do DNA
Quando o primer se associa ao DNA, ocorreu o anelamento dos primers. 
 
Primer
Primer
Etapa onde ocorre a união das fitas de DNA em cada lado complementar
É necessário conhecer o fragmento de nucleotídeos do seu fragmento alvo
 Etapas da PCR
Polimerização ou extensão
Para se chegar a uma amplificação com nível considerável, são necessárias várias repetições desse processo, com até 30 ciclos refeitos para que a nova molécula se estruture corretamente.
Desnaturação + anelamento + extensão
A DNA Polimerase vai construir as novas fitas de DNA. DNA-polimerase é a enzima que faz a síntese de uma nova fita de DNA no nosso organismo.
A DNA Polimerase se associa a estrutura criada pelo anelamento e adiciona os nucleotideos faltantes. Os nucleotídeos foram disponibilizados de forma livre em solução, no início da reação
Duas moléculas novas, idênticas
Temperatura de 72 graus
 Depois da PCR Eletroforese
Antes da PCR
Depois da PCR
- Alvo não possui várias cópias dele
- Reagentes disponíveis em quantidades ideais
- Alvo duplicado diversas vezes
Análise de produto da PCR
Moléculas de DNA são separadas de acordo com seu peso molecular
Cuba de eletroforese
Fragmentos de DNA de tamanho conhecido
 Finalizando a Técnica PCR
O ciclo inteiro é então reiniciado, os produtos do primeiro ciclo de replicação são então desnaturados, hibridizados e novamente replicados com DNA-polimerase. O procedimento é repetido muitas vezes até que o nível desejado de amplificação seja obtido.
Na prática, a amplificação efetiva do DNA requer de 20 a 30 ciclos de reação, com os produtos de cada ciclo servindo como DNA-molde para o próximo – dando origem ao termo “reação em cadeia” da polimerase.
Como cada etapa da reação ocorre em uma temperatura específica, a reação pode ser controlada. É utilizado um termociclador para determinar a temperatura e o tempo de cada etapa, bem como o número de ciclos de replicação.
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	A primeira ação do RT-PCR é o uso da enzima transcriptase reversa para transformar o RNA do vírus em DNA complementar, também chamado de cDNA. O RNA é produzido a partir de uma molécula de DNA e apresenta informações com as quais é possível coordenar a produção das proteínas. Depois de ter sido transformado, são inseridos dois primers, que é uma fita simples de DNA, para auxiliar a amplificação do material genético em 100 milhões de vezes. 
	Com uma sonda complementar ao vírus procurado é possível observar se o conteúdo molecular é correspondente ao do agente infeccioso que os pesquisadores estão investigando.
Passo a passo do PCR 
1 . Transforma RNA do vírus em DNA 
2 . DNA é ampliado utilizando fitas de DNA simples 
3 . Observa se há sinais do vírus nas amostras 
4 . Se for positivo, é confirmada a suspeita de coronavírus
 Técnica PCR para detectar o COVID-19
 Aplicações
PCR
Genotipagem
Identificação de genótipos
Detecção/identificação de organismos
Amplificação de um genoma específico
Diagnóstico
Testes laboratoriais p identif. de doença hereditária
Forense
Pouca quantidade de DNA ou de má qualidade
A PCR também é muito utilizada como fluxo de trabalho em diversas outras técnicas
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 Referências
PROLAB. Conheça os princípios da técnica de PCR e suas etapas.2018. Disponível em: <https://www.prolab.com.br/blog/equipamentos-aplicacoes/conheca-os-principios-da-tecnica-de-pcr-e-suas-etapas/> 08 abr 2020
PROLAB. O que é a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase – PCR? 2014. Disponível em: https://www.prolab.com.br/blog/curiosidades/o-que-e-reacao-em-cadeia-da-polimerase/ 08 abr 2020
Universo da Biologia Molecular. PCR – Resumão. 
2020. Disponível em: <https://www.youtube.com/watch?v=TaNtNjq-VQw&t=1318s> 10 abr 2020