Aula 12 - Criopreservação de Sêmen

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Faculdade Anhanguera de Dourados 
Prof. Me. Baltazar A Silva Jr 
CURSO MEDICINA 
VETERINÁRIA 
Biotecnologia e Obstetrícia 
Aplicadas a Medicina Veterinária 
Aula 12 – Criopreservação de Sêmen 
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Criopreservação de sêmen 
• Interrompe o metabolismo dos espermatozoides mantendo 
suas características por período indeterminado. 
• Manutenção do potencial fertilizante dos espermatozoides 
(integridade e funcionalidade): 
– Flagelo (para garantir produção de ATP e motilidade); 
– Núcleo (para manter estável o armazenamento do DNA); 
– Acrossomo (para manter a fecundação); 
– Segmento Equatorial (para que ocorra a ativação do oócito); 
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Uso do Sêmen Congelado: 
• 1949: Christopher Polge - sêmen bovino com sucesso 
• Inseminação Artificial; 
• Comercialização nacional e internacional; 
• Produção in vitro de embriões (FIV); 
• Programa de Transferência de embriões; 
• Biobancos (armazenamento de material genético); 
• Pesquisa Cientifica; 4 
Criopreservação de sêmen 
• Diluidores e Crioprotetores – 
– Preservação das estruturas espermáticas mediante o 
congelamento/descongelamento 
• Curvas de Resfriamento - buscam minimizar os 
danos causados pelo 
– Choque térmico, 
– Formação de cristais de gelo 
– Desidratação celular; 
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Criopreservação de sêmen 
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Criopreservação de sêmen 
 Sequência para congelamento de sêmen 
• 1 – Diluição 
• 2 – Resfriamento 
• 3 – Congelamento 
• 4 – Armazenamento 
• 5 – Descongelamento 
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Diluição 
Diluentes 
• Devem garantir 
– Nutrição, 
– Proteção, 
– pH (6,5 a 6,9), 
– Osmolaridade adequada (300mOsm), 
– Atividade antibacteriana; 
• Após a coleta do sêmen deve ser diluído, para dar suporte 
até o processamento de criopreservação (transporte) 
• Diluição de1:1 (sêmen:diluente) 
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Diluientes 
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Diluição 
Crioprotetores 
• Classificados de acordo a capacidade de penetração da 
membrana plasmática; 
– Externos e Internos 
• Devem provocar a desidratação celular, 
• Proteger e estabilizar a membrana plasmática 
• Evitar formação de cristais de gelo 
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Diluentes - Crioprotetores 
• Exemplos 
– Glicerol, 
– Etilenoglicol, 
– Propilenoglicol, 
– Propanodiol, 
– Dimetilsulfóxido, 
– Dimetilformamida. 
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Crioprotetores Internos: 
São moléculas pequenas que atravessam a membrana 
plasmática; 
Diluentes - crioprotetores 
Crioprotetores Internos: 
• Ação 
– Atuam nos meios intra e extracelulares; 
– Aumentam a osmolaridade do meio extracelular e 
promovem a saída de água da célula; 
– Evita o acumulo de água e a formação de cristais de gelo 
intracelular. 
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Diluentes - Crioprotetores 
Crioprotetores Externos: 
• São moléculas grandes e não conseguem 
atravessar a membrana plasmática; 
• Exemplo: 
– Proteínas (gema do ovo - LDL - e leite desnatado), 
– Açúcares (frutose, glicose, manose) 
– Polímeros sintéticos (metilcelulose) 
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Diluentes - Crioprotetores 
Crioprotetores Externos: 
• Ação: 
– Agem como solutos ou coloides, pois contribuem para as 
propriedades osmóticas e afetam o movimento de água 
para dentro e para fora da célula 
– Proteção contra formação de cristais de gelo 
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Diluentes - Crioprotetores 
Toxicidade dos Crioprotetores: 
• Crioprotetores são tóxicos ao espermatozoide, pois 
causam injurias bioquímicas e danos osmóticos; 
• Altas concentrações (10 a 20%) de crioprotetores 
desestabilizam os lipossomos, dissolvendo os 
fosfolipídios; 
• Em concentrações moderadas, previnem os efeitos 
prejudiciais da desidratação; 
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Diluentes - Crioprotetores 
Crioprotetores: 
 * Bovinos: Tris-gema e Glicerol 
 * Equino: Dimetilformamida 
 * Caprinos: leite desnatado + glicose + glicerol 
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Crioprotetores 
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Criopreservação de sêmen 
Resfriamento: 
• O resfriamento lento abaixo de 0°C promove maior saída de 
água da célula, podendo levar a desidratação celular intensa; 
• O resfriamento rápido é insuficiente para permitir a saída da 
água, provocando a formação de cristais de gelo intracelular. 
• A taxa de resfriamento ideal: suficiente retirada de água 
intracelular, formando pequenos de cristais de gelo 
intracelulares e sobrevivência após o descongelamento. 
 * A velocidade de descongelamento deve ser compatível a 
velocidade utilizada de congelamento. 
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Curva de resfriamento/congelamento 
Curva de Resfriamento até 5°C (-0,25 °C/min); 
Curva de Congelamento até -80°C (-15°C/min); 
Curva de Congelamento até -120°C (-10°C/min); 
 Imersão em Nitrogênio líquido -196°C; 
Armazenagem 20 
Curva de resfriamento/congelamento 
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Criopreservação de sêmen 
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Palhetas 
0,25ml e 0,5ml 
Raques 
Criopreservação de sêmen 
Armazenamento: 
• Em Botijões de Nitrogênio Liquido (-196°C); 
• As palhetas são colocadas em raques identificadas; 
• Nível do NL e verificado e mantido periodicamente 
(15 dias); 
• Armazenamento por tempo ilimitado 
 
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Criopreservação de sêmen 
Descongelamento: 
• Retira do NL e coloca em Banho-Maria; 
• 36°C/30 segundos; 
• Cortar uma das extremidades da palheta para 
retirada do sêmen; 
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Criopreservação de sêmen 
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Criopreservação de Embriões 
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Conceito: 
• Criopreservação e um processo onde células ou tecidos 
biológicos são preservados através do congelamento a 
temperaturas muito baixas, 
– Geralmente −196 °C. 
 Objetivo: 
• Suspensão do metabolismo e manutenção das 
características biológicas, mantendo a viabilidade celular; 
– Uso de Criprotetores; 
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Criopreservação 
• Whittingham, 1972: congelamento e descongelamento lento 
de embriões de camundongo nas fases de clivagem sem 
afetar a sobrevida dos embriões 
• Whittingham, 1977: descrição de alterações estruturais de 
membrana durante o congelamento; 
• Trounson & Mohr, 1983: gestação após criopreservação de 
embriões humanos. 
• Chen, 1986: gestação proveniente de ovócito humano 
criopreservado; 
• Vajta et al., 1998: criopreservação ultrarrápida (vitrificação) 
de ovócitos bovinos; 28 
Histórico 
• Armazenamento de material genético – Biobancos 
• Comercialização Nacional e Internacional de Oócitos e Embriões 
• Auxilia Programas de MGA 
• Aplicação na Produção in vitro de Embriões e programas de TE 
• Coadjuvantes no Tratamento da Infertilidade 
• Preservar espécies em extinção 
• Medicina → Infertilidade e Reprodução 
• Veterinária → Melhoramento Genético e Reprodução 
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Aplicações 
• Resfriamento: mantém os embriões a temperatura entre 0 e 
4°C durante 24 a 72 horas antes da transferência: 
– Utilizado em alevinos a fim de transporte e comercialização; 
– Utilizado em embriões bovinos para transporte e inovulação; 
• Congelamento: conservação a -196°C durante um período 
indeterminado. 
– Congelamento lento: 
– Congelamento Rápido: 
– Congelamento Ultrarrápido: 
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Métodos de Criopreservação 
• Congelamento Lento: 
– Taxa de resfriamento entre 0,5 – 1,5°C/min (-80°C) 
– Duração de 3,5 a 4 horas. 
– Descongelamento e feito a 10°C /min. 
• Congelamento Rápido: 
– Taxa de resfriamento entre 17 – 30°C/min (-30°C) 
– Duração de 2 a 2,5 horas. 
– Descongelamento e feito a 30°C/min. 
• Congelamento Ultrarrápido e Vitrificação: 
– Congelamento a 250°C por minuto. 
– Duração do congelamento ficara entre 2 a 3 minutos, 
– Descongelamento > 300°C por minuto. 
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Protocolos de Criopreservação 
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Criopreservação 
Propriedades: 
• Solubilidade em soluções salinas aquosas 
• Baixo peso molecular para rápida e completa penetração na célula 
• Baixa toxicidade 
• Alta estabilidade em temperaturas reduzidas 
Divididos em: 
• 1) Intracelulares: crioprotetores de baixo peso molecular, como: 
– dimetilsulfoxido (DMSO), propanodiol, etilenoglicol, glicerol, metanol 
e butanodiol; 
• 2) Extracelulares: crioprotetores de maior peso molecular, como: 
– galactose, glicose, sacarose e trealose, polivinilpirrolidona (PVP), 
alcool polivinilico (PVA) e albumina serica bovina (BSA) 
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Agentes crioprotetores• A verificação e uma técnica de criopreservação que 
envolve rápidas taxas de resfriamento e 
concentrações muito altas de crioprotetores, 
– Prevenindo a formação de cristais de gelo, 
– Diminuindo as injurias causadas a célula; 
• Este método e aplicado a oócitos e embriões; 
• Exposição a soluções com alta concentração de 
crioprotetor seguida da imersão em nitrogênio. 
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Vitrificação 
• Rápida passagem através da temperatura critica 
(redor de 0°C), minimizando as crio injurias; 
Vantagens da Vitrificação: 
• Não requer o uso da aparelhagem de 
congelamento; 
• Alta velocidade na execução; 
• Metodologia e simples e barata; 
• Melhores taxas de sobrevivência. 
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Vitrificação 
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Criopreservação 
• 1) Adição de Agentes Crioprotetores; 
• 2) Resfriamento, indução da formação de gelo e 
Congelamento; 
• 3) Estocagem em Nitrogênio Líquido (-196°C); 
• 4) Descongelamento; 
• 5) Remoção das Soluções Crioprotetoras; 
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Etapas da Criopreservação 
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Criopreservação 
• O descongelamento deve ocorrer o mais rápido 
possível (275°C/min), em banho-maria a 37°C ; 
• O gelo extracelular deve penetrar na membrana 
celular reidratando a célula; 
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Descongelamento 
• Os crioprotetores são removidos através de sucessivas 
lavagens após o descongelamento; 
• Deve ser removida devido sua toxicidade; 
• Descongelamento com baixa concentração ou ausência de 
crioprotetor, ira causar rompimento celular devido a entrada 
brusca de água no interior da célula; 
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Remoção das soluções crioprotetoras 
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