andrologia em equinos

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andrologia em equinos
Quanto mais tecnológica for a reprodução de uma espécie: mais dificuldade ela
tem em se reproduzir naturalmente. Em equinos, não existe seleção nos aspectos
reprodutivos.
Os equinos apresentam pênis do tipo músculocavernoso; aumento de volume.
A ejaculação é intrauterina (pressão).
A inseminação artificial é a biotecnologia
mais utilizada; deve-se coletar o sêmen (através
de: vagina artificial/farmacológica). Para a
coleta farmacológica pode-se utilizar xilazina,
imipramina ou prostaglandina (ansiolíticas);
deve-se levar em conta que o volume é menor,
porémmais concentrado.
➔ utiliza-se a coleta farmacológica para IA e
criopreservação ou em garanhões com
distúrbios ejaculatórios/animais
impossibilitados de realizar a cobertura
por debilidade/dor na monta. Pode ser
utilizada em casos de EPM (paralisia
peniana), incoordenação motora
(bambeira) e sequelas de doenças
neurológicas.
➔ a vagina artificial é o método mais
utilizado; deve-se levar em conta a
posição, a pressão e a temperatura (42 a
45ºC) o equipamento. Lubrificar.
➔ pode ser coletado com égua em estro ou
diestro/anestro (E2) ou manequim. Fazer
a contenção de égua. Égua nova +
garanhão experiente ou égua experiente
+ garanhão novo.
Durante a coleta em estação, a lavagem do pênis com água morna também é
estimulatória.
Em caso do óbito do garanão, pode ser feita a coleta da cauda do epidídimo – ou
em casos de patologias/retirada do testículo (hérnia inguino-escrotal).
Os diluentes utilizados são Merk; Kenney; INRA-96; Botu-Sêmen. Eles irão
preservar a longevidade espermática, neutralizar efeitos deletérios do plasma
seminal, reduzir a contaminação bacteriana e diminuir choques térmicos.
● sêmen fresco não diluído dura até 2h.
● sêmen fresco e diluído (1:1 ou 1:2) dura até 8h.
● sêmen diluído (1:2 a 1:10) e resfriado (0,3ºC/min até atingir 5 a 8ºC) dura de 12
a 48h após a coleta
● sêmen congelado: sêmen com grande volume e baixa concentração
espermática.
○ cavalos mau-congeladores.
40mL x 5x10^9 sptz – 80% dá 4x10^9
[ ] = 100 x 10^6/mL (sêmen puro) + diluidor
20mL sêmen + 20mL diluidor = [ ] de 50 x 10^6
volume 40mL -> concentração
Vi x Ci = Vf x Cf ou seja 20mL x 100x10^6 = y x 33x10^6, sendo que y = 66,6mL
(volume final total: considerar que 20mL corresponde ao sêmen, logo o diluidor
corresponde a 46,6mL).
imagem de câmara de neubauer
Em cada retículo, conta-se 5 quadrados grandes (em diagonal ou quatro cantos +
central): deve-se manter sempre o mesmo padrão.
➔ cálculo de concentração espermática
[ ]/mL = x . (1 / [1/10.000] x [n. de quadrantes contados/n. total] x taxa de diluição)
Sendo x a média dos espermatozoides encontrados nos quadrantes da câmara de
neubauer.
exemplo:
considerou-se que x = (45 + 40)/2, logo x = 42,5
42,5 = x (1 / [1/10.00] x [5/25] x [1/20]) = 42.500.000, ou seja, 42 milhões e 500 mil sptz por mL
considerou-se que x = 17.5
17,5 x (1 / [1/10.000] x [⅕ ou 5/25] x [1/100]) = 17,5 x 1 / (1/5.000.000) = 87,5x10^6 sptz/mL
se o animal ejaculou 30mL, commotilidade de 70%
concentração total = 30mL x 42,5x10^6 = 1.275 x 10^9 sptz → arredondado para 1,3 x 10^9, considerando
que a motilidade é de 70%, são 0,91x10^9 ou 910x10^6 de espermatozoides móveis
Pode-se utilizar a taxa de diluição como 1/20 ou 1/100, em equinos, a depender da
concentração espermática.
inseminação artificial
Apresenta como vantagens o maior número de fêmeas:machos pelo
fracionamento do ejaculado, menor risco para os animais (acidentes de monta
natural), útil para animais que são inaptos à MN, melhor controle reprodutivo, entre
outros. Porém, como desvantagens, pode apresentar execução incorreta, causando
redução drástica nas taxas de prenhez e endometrite pós IA, custo adicional
(colheita e processamento de sêmen), disseminação de genes indesejáveis e
fraudes – controle pela tipificação sanguínea ou teste de DNA.
O uso de sêmen congelado requer
mão de obra qualificada, custos
(principalmente em equinos e
suínos) e causa a diminuição dos
índices reprodutivos.
● BOVINOS
coleta o sêmen → dilui → no bovino, cada palheta é uma dose inseminante →
resfria o sêmen por 4 a 5 horas em torno de 5°C para que haja troca da célula com
omeio → congelação.
● EQUINOS
coleta → retira plasma seminal → diluição > resfria → congela.
Os princípios da criopreservação são 1. contato do sêmen emmeio apropriado, 2.
remover o plasma seminal (algumas espécies), 3. interação adequada célula:meio
(osmolaridade adequada), 4. respeitar a curva de diluição de temperatura e de
descongelação. Para ter sucesso, é necessário ter morfologia espermática em nível
aceitável (defeitos maiores e menores), metabolismo para produção de energia
(mitocôndrias; plasma seminal), motilidade progressiva (após o descongelamento)
e capacidade de adquirir a motilidade hiperativada (capacitação espermática) e o
acrossoma deve estar intacto.
➔ o plasma se torna deletério no processo de congelamento
MEMBRANA LIPÍDICA deve estar estável (colesterol), com atividade da enzima
flipase (instabilidade; inversão de fosfolipídeos) e fusão das membranas (no
momento certo). As proteínas na MP sobrevivem no ambiente uterino e se ligam
ao ovócito e, a falta de um desses quesitos, diminui drasticamente a fertilidade.
MEMBRANA PLASMÁTICA varia de célula para célula, define os limites celulares
e mantém o equilíbrio entre os meios intra e extracelular (permeabilidade).
Apresenta bicamada fosfolipídica, sendo que os lipídeos são responsáveis pela
organização estrutural da célula e as proteínas são responsáveis pelos processos
dinâmicos, agindo como receptores, enzimas, bombas iônicas e transdutores de
energia.
A fluidez da membrana é infuenciada pela composição lipídica, comprimento
de cadeias carbônicas, grau de insaturação de AGs, quantidade de colesterol e a
relação colesterol:fosfolipídeos.
● colesterol efeito estabilizador na MP, interfere na temperatura da transição
de fase e encontra-se próximo às caudas hidrocarbonadas dos FFL. Reduz a
formação da fase hexagonal II.
○ diminui os efeitos deletérios na congelação!!!!!
■ a quantidade excessiva de colesterol faz com que a membrana
não se torne instável no momento em que devia. Diminui a
taxa de prenhez.
○ aumenta a longevidade do espermatozóide, a permeabilidade a
crioprotetores e tolerância osmótica.
● uma membrana plasmática com maior rigidez apresenta maior
sensibilidade ao estresse osmótico;
● uma MP commenor rigidez apresenta maior resistência aos processos de
● congelação e descongelação.
Crioprotetores permeáveis (internos): glicerol, etilenoglicol,
amidas, metilformamida e dimetilformamida.
O glicerol e solvente e soluto e passa para o meio
intracelular; ao ser colocado como soluto → meio
hipertônico → perda de líquidos → célula murcha →
equilíbrio → o glicerol vai para dentro da célula → a
célula volta ao seu tamanho original.
➔ Não se deve colocar o glicerol muito
concentrado: morte celular.
Após isso, começa-se a abaixar a temperatura:
Ocorre desaceleração da movimentação lateral
dos lipídeos (aproximação de AGs), transição de
fase entre o estado líquido cristalino e estado gel
(quando há mais poliinsaturados, a temperatura
de solidificação abaixa; entre 8 e 19ºC).
Maior susceptibilidade ao choque térmico pelo
frio (ruptura de MP) e perda de motilidade.
● os fosfolipídios têm movimento de rotação no mesmo
eixo;
● pode acontecer a inversão dos ácidos graxos (flip flap) →
fosfolipídeos com predileção pelo meio extracelular e
intracelular → ao congelar a célula, é normal ocorrer a
inversão;
● inversão deve acontecer quando o espermatozóide
chega próximo ao ovócito → aumenta a permeabilidade
de membrana → espermatozoide passa pelo processo de capacitação e
reação do acrossoma;
● se inversão acontece antes, célula se torna inviável, rompe a membrana e
pode se perder → deve acontecer de forma controlada.
Cada 10ºC baixados, ocorre diminuição de 50% do metabolismo. Ou seja: em
15ºC existe 25% da capacidade metabólica.
Crioprotetores permeáveis (externos): gema de ovo (LDL) e lacose
Oscrioprotetores externos são responsáveis por atuar no compartimento
extracelular e causam desidratação da célula (impedem a formação de cristais de
gelo intracelular). Interagem e estabilizam a MP e o LDL forma um filme protetor
(reposição de FFL perdidos).
➔PLASMA SEMINAL
Substâncias que contribuem com a fertilização:
→ Motilidade;
→ Viabilidade;
→ Capacitação espermática.
Substâncias que não contribuem diretamente com a
fertilização:
→ Fatores decapacitantes;
→ Fatores que inibem a motilidade → por isso,
se retira o plasma seminal do sêmen de
equinos.
➔BSP
→ Ligam-se aos fosfolipídeos da MP →
potencializam a capacitação (não deve ser
capacitado antes da hora);
→ LDL (da gema de ovo) é interessante →
previne o efluxo/saída de fosfolipídeos e
colesterol da MP → dá maior viabilidade às
células;
→ HDL não é interessante → estimula
saída/efluxo de fosfolipídeos e colesterol da
MP.
➔ PROTEÇÃO DADA PELO LEITE
→ Leite desnatado não difere do leite total em
termos de roteção > logo, lipídeos do leite não
são responsáveis pela proteção;
→ Fatores envolvidos:
→ Micela de caseína + glicerol;
→ Lactose > atua como coadjuvante.
➔ AÇÚCARES
→ Substrato energético;
→ Atuam na pressão osmótica do meio →
diminui injúrias pela cristalização do gelo;
→ Interação direta com a MP > grupo hidroxil
do açúcar se liga com o grupo fosfato dos
fosfolipídeos;
→ Inibe a fusão das membranas;
→ Manutenção dos lipídeos na fase fluida;
→ Dissacarídeos atuam melhor que
monossacarídeos.
VANTAGENS DO SÊMEN CONGELADO
→ Programas de melhoramento genético;
→ Importação e exportação de material
genético > difusão;
→ Seleção de reprodutores geneticamente
superiores;
→ Permite a participação de reprodutores em
eventos;
→ Seguro biológico reprodutor;
→ Transporte a longas distâncias com baixo
custo;
→ Preservação por tempo indefinido;
→ Manutenção do bem-estar animal.
DESVANTAGENS DO SÊMEN CONGELADO
→ Resistência à congelação – tolerância; cerca
de 30% de garanhões com boa resistência;
- Variação entre: raças; indivíduos; ejaculados.
→ Menores taxas de prenhez;
→ Custo: infraestrutura, equipamentos,
congelação e IA;
→ Baixo número de doses/ejaculado > equinos
> 2 a 10 doses/ejaculado.
ETAPAS DA CRIOPRESERVAÇÃO
- Colheita do sêmen > vagina artificial;
- Avaliação > motilidade, vigor, concentração,
% stpz viáveis;
- Cálculo de diluição > no de
espermatozoides viáveis por palheta > varia
conforme a espécie;
- Diluição;
- Identificação e envase das palhetas:
→ No sêmen de garanhão deve-se fazer
centrifugação para retirar o plasma seminal.
- Equilíbrio > tempo varia conforme espécie;
- Congelação;
- Armazenamento em botijão de nitrogênio
líquido;
- Descongelação.
PROCEDIMENTO DE CONGELAÇÃO –
GARANHÃO:
Colheita de sêmen:
- Volume livre-gel;
- Concentração;
- % móveis.
Centrifugação:
- Diluir 1:1;
- Diluente centrifugação sem crioprotetor.
Ressuspensão:
- Diluente congelação com crioprotetor.
Envase:
- Identificação.
Refrigeração:
- 5°C/20 minutos.
Vapor nitrogênio:
- 20 minutos – 6cm N2 líquido.
ESTOCAGEM DO BOTIJÃO CRIOGÊNICO
- Botijão sempre cheio de nitrogênio;
- Não deixar baixar da metade no nível de
nitrogênio;
- Geralmente > 30 cm de N2;
- Nível mínimo de 15 a 16cm.
DESCONGELAÇÃO
- Não erguer muito a caneca ao manipular >
não retira
totalmente a caneca para não ter total
contato com a
temperatura do meio externo.
- Palhetas de 0,5ml;
- 37°C por 30 segundos;
- 46°C por 20 segundos.
- Seca, corta uma ponta, vira a ponta para o
tubo de
Eppendorf e corta a outra ponta para cair.
AVALIAÇÃO DO SÊMEN
PÓS-DESCONGELAÇÃO
- Descongelar uma palheta;
- Secar cuidadosamente;
- Cortar a extremidade que foi lacrada;
- Colocar a palheta dentro do tubete;
- Cortar a extremidade da bucha > o sêmen
escoará;
- Adicionar diluente > aguardar ~ 10 minutos;
- Avaliar – motilidade maior ou igual a 30% >
bovinos e
equinos.