BIOTECNOLOGIA DA REPRODUÇÃO- IA

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Resumo | @medveterinars 
Criopreservação do Sêmen 
 
Criopreservação: conceito. 
Congelação x congelamento 
Indicações: 
– Estocagem de material genético. 
– Melhoramento animal. 
– Vantagens sanitárias. 
– Otimização de utilização dos 
reprodutores. 
– Aplicações terapêuticas 
Armazenamento de material genético 
comprovado 
 a baixas temperaturas (-196ºC) 
por períodos indeterminados 
Utilização de animais excepcionais 
(com características desejáveis), 
mesmo após a perda da capacidade 
reprodutiva e ou morte. 
Seguro biológico do animal 
 
Racionalização no uso de touros e 
garanhões nas estações de montas e 
aumento da relação égua/garanhão e 
touro/vaca Facilidade do transporte 
menor de sêmen à grandes 
distâncias, além de menor custo em 
transportar o sêmen; aumento do número 
de fêmeas que possam criar de um macho 
em particular 
Para alguns machos que têm seu sêmen 
congelado, há diminuição da taxa de 
prenhez A colheita de sêmen e a 
técnica de congelação precisam ser 
feitas por um pessoal treinado e 
especializado, o que inclui gastos 
adicionais; a perda de células 
espermáticas devido a manipulação nas 
etapas, que vão desde a colheita do 
sêmen até o descongelamento Exclusão 
de indivíduos que não se obtém sucesso 
na criopreservação. 
• Anabiose 
– Diminuição da temperatura. – 
Conservação 
• Retomada do metabolismo e 
crioinjúria 
 – Integridade de Membranas. – 
Acrossoma. – Potencial de 
mitocôndrias. – Estresse oxidativo e 
 
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fragmentação do DNA 
Choque frio 
Resfriamento: temperaturas abaixo da 
corpórea (até 5ºC). 
Composição das membranas 
biológicas : -
Mudança da fase dos lipídios. -
Alteração dos domínios de membrana e 
fisiologia. -Morte celular. 
 -Estresse 
oxidativo. -Susceptibilidade 
individual. 
Resfriamento rápido até –5 a –15oC, 
quando a água congela. Conforme os 
cristais de gelo se formam, a pressão 
osmótica da fração líquida aumenta. 
Isto causa uma grande perda de água do 
sptz, até que haja um equilíbrio 
osmótico; tal situação pode levar a: 
desidratação da membrana (perda 
estabilidade e desnaturação de 
proteínas); deformação da célula (50% 
do volume original) e stress mecânico; 
altas concentrações de solutos e 
cristalização dos mesmos. 
Gelo intracelular: danos à organelas 
e citoesqueleto / ruptura de membranas 
Gelo extracelular: “Efeitos da 
solução”; desidratação – Efluxo de 
água. Reidratação: Influxo muito 
rápido danifica os canais
Resfriamento abaixo da temperatura 
corporal, causa a transição de fase 
dos lipídios de membrana, pois os 
diferentes lipídeos têm diferentes 
temperaturas de transição. Isto leva 
a formação de “domínios” lipídicos. As 
proteínas também são excluídas dos 
domínios de gel, levadas a um ambiente 
não fisiológico, o que impede suas 
funções, como integridade estrutural 
e metabolismo de íons; 
• Alta proteção contra crioinjúria. 
• Baixa toxicidade. 
• Baixa imunogenicidade: IA fêmeas / 
endometrites 
 
• Diminuição do ponto de 
solidificação. 
 
• Intracelulares. 
• Extracelulares. 
 Glicerol  Etilenoglicol  
Dimetilsulfóxido (DMSO)  1,2 
Propanodiol  Dimetil Formamide 
Glicerol 
– Amplamente utilizado – Por alguns 
considerado indispensável. 
 
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Etileno Glicol 
– Mais utilizado em embriões. – 
Penetração mais rápida 
DMSO: Solvente / Sêmen de coelho 
 
AMIDAS: Metil/Dimetil formamidas 
Utilização com sucesso em garanhões 
maus-congeladores. 
 Lactose  Sacarose  Rafinose  
Proteínas e lipoproteínas – gema de 
ovo, leite e soro. 
Gema de ovo / leite: proteínas e 
lipoproteínas 
 – Estabilização das membranas. – 
Proteção contra o choque frio. 
Açúcares: Rafinose; Trealose; 
Lactose; Frutose 
– Diminuição dos efeitos da solução – 
Fornecimento de substrato para o 
metabolismo energético do 
espermatozóide. 
Detergentes de membrana: Equex; Orvus 
ès paste; Lauril-éter-sulfato de 
Sódio (ODD neutro) -Emulsão de 
gorduras: melhor disponibilidade de 
componentes da gema do ovo para as 
células 
 Bicarbonato de sódio  Lactato de 
sódio  Citrato de sódio  Fosfato de 
sódio  TRIS – hidroximetil-amino-
metano  TES – C6 H15 NO6 S 
pH – 6,99 ± 0,02 
Osmolalidade – 300 mOsm 
 
Antibacterianos 
 Penicilina  Estreptomicina  Ticarcilina  Kanamicina 
 Sulfanilamida  Gentamicina  Polimixina B 
–
• O que devem conter: – pH e 
osmolaridade controlados – Sistema 
tampão – Nutrientes – Antibiótico – 
Crioprotetores intra e 
extracelulares. – Antioxidantes • 
Exemplos meios-base: – Tris-Gema-
citrato / frutose – Glicina-gema-
leite – Kenney 
• One Step 
– Concentração única de crioprotetor 
–Praticidade 
• Two Steps 
•
–Frações A e B –Fração B: dobro da 
concentração de crioprotetor. 
Adicionado a 5°C. –Vantagens 
 – Desvantagens 
• Comerciais 
– Garantias – Partidas homogêneas, 
resultados também. 
• “Caseiros” – Precisão no aviamento 
– Qualidade dos componentes – Variação 
entre partidas e resultados 
 
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Lavagem de pênis / prepúcio. 
Importância: 
Método de colheita Vagina artificial. 
Manipulação digital. 
Eletroejaculação. PLASMA SEMINAL... 
• Concentração. • Morfologia. • 
Motilidade. • Vigor. • Testes 
funcionais. 
 
• Remoção do plasma seminal 
– Garanhões; cachaços; cães; bodes 
(lecitinase) – Protocolo 
• Diluição 1:1 / 1:2. Meio 
Centrifugação: Kenney. • 600G por 10 
min. • Desprezar sobrenadante. • 
Ressuspensão em meio para 
criopreservação (fração A ou única) • 
Pulo do gato: ressuspender em pouco 
meio e calcular concentração para 
poder diluir corretamente 
• No de Sptz/ml x Volume ejaculado = 
Conc. Total Ejaculado / Total de por 
dose : 
100x106 Sptz - Eq 30-50x106 Sptz – Bov 
100 x 106 Sptz – Ov/Capr 50 x 106 Sptz 
– Cães 50 x 106 Sptz – Epidídimo 
(suíno) 
• = Número de palhetas a serem 
congeladas 
• Número de palhetas a serem 
congeladas x 0,5 / 0,25 ml = Volume 
final (ejaculado + diluidor) 
Volume de diluente 
A – Volume de diluente – Volume do 
ejaculado 
B - Volume de diluente/2 = Volume do 
ejaculado + Solução A do diluente 
Adicionar mesmo volume de B Meio one 
step: Volume final – volume ejaculado 
= volume da fração única do meio. 
Ex. 1: 40 mL de volume final Solução 
A – 15 mL + 5 ml ejaculado Solução B 
– 20 mL 
Ex. 2: 40 mL de volume final 35 mL de 
meio (fração única) 5 mL ejaculado 
• Vagarosa mesmo! • Meio no sêmen, não 
sêmen no meio. • Homogenização 
constante. • Realizada FORA DO BANHO 
MARIA: início da curva de 
resfriamento. 
 Nome do animal  Raça  Data  
Partida 
• Da temperatura do banho até 5 ºC. • 
Cuidado: Choque frio! • Geladeira X 
Máquina de congelar. – Curva rápida: 
-0,5 ºC/min. – Curva lenta: -0,25 
ºC/min. • Melhor curva: próxima à - 
0,3 ºC/min. • Estabilização: de 20 min 
até 4hs (Depende da espécie e do 
animal!) 
• Da 5 ºC até - 196 ºC. • Cuidado: 
Danos físicos • Caixa de Isopor X 
Máquina de congelar. – Curva rápida: 
- 20 ºC/min. •
 – Curva lenta: - 10 ºC/min. • 
Melhor curva: próxima à - 20 ºC/min. 
• Após atingir - 70 a - 120 ºC, imersão 
no N2 . 
Duas palhetas de cada partida. 
Motilidade. Vigor Teste de 
Termorresistência. Testes funcionais. 
Descartar partidas fora de padrão 
Palheta 0,25 mL - 37ºC/ 7 segundos 
Palheta de 0,5mL - 37ºC / 30 segundos 
- 46ºC / 20 segundos 
 
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Vantagens 
 Permite o controle de doenças  Reduz 
a possibilidade de injúria do garanhão 
e da égua  Permite o uso de garanhões 
com patologias no locomotor  Permite 
a avaliação imediata do sêmen 
(diagnóstico)  Identificação de 
problemas reprodutivos  Previne o 
desgaste excessivo do garanhão  
Utilização de mais fêmeas por garanhão 
 Permite o uso de éguas que não podem 
usar do serviço natural  Permite uso 
mais efetivo de garanhões idosos 
Resulta em melhores taxas que o 
serviço de monta natural 
Ajuste da vagina artificial para cada 
garanhão, Proporcionar higiene para 
manutenção da viabilidade seminal 
Remover o esmegma, debris e gel 
durante a colheita 
 Motilidade Progressiva  Vigor  
Concentração Espermática  
Concentração Total do Ejaculado 
Manter na fração diluída com 50 
milhões por mL EX: 325 x 106 /mL em um 
volume de 45 mL 325 : 50 = 6,5 mL 45 
x 6,5 = 296 mL da mistura (45 de sêmen 
e 247 mL de diluente) 
Pressão osmótica compatível com o 
espermatozóide Proporção balanceada 
de minerais Proporção balanceada de 
nutrientes Cuidado com 
neutralizantes tóxicos Diluente 
(recomendações importantes) 
 Maximizar o potencial zootécnico do 
garanhão  Evitar transporte de fêmeas 
 Evitar doenças dos potros  
Prolongar a vida dos espermatozóides 
 Permitir avaliação dos 
espermatozóides  Proteger o sêmen de 
condições ambientais desfavoráveis  
Diminuir a contaminação, ou o seu 
potencial, com o uso de antibióticos. 
DEFINIÇÃO 
É a deposição mecânica do sêmen no 
trato reprodutivo feminino 
OBJETIVOS DA INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL 
 Objetivo biológico: Promover a 
fecundação, ou seja, o encontro dos 
gametas masculino e feminino. 
 Objetivo econômico: 
Instrumento para o melhoramento 
genético animal 
VANTAGENS DA IA 
 Multiplicação da capacidade 
inseminante de um ejaculado. 
 
 Melhor aproveitamento de machos 
provados. 
 
 Controle de doenças. 
 
 Geração de descendentes após a morte 
do reprodutor. 
 
 
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 Uso de machos incapacitados de 
montar. 
 
 Fertilização de animais que não 
aceitam a cópula. 
LIMITAÇÕES DA IA 
 Mão de obra especializada. 
 
 Manejo dos animais. 
 Planejamento prévio. 
 Gastos com material e sêmen. 
 Levantamento sanitário. 
Processamento do Sêmen para a 
Inseminação Artificial: 
Sêmen Fresco 
Sêmen Resfriado °
 
Sêmen Congelado 
VANTAGENS DA IA EM BOVINOS 
 Multiplicação da capacidade 
inseminante de um ejaculado  Melhor 
aproveitamento de touros provados 
 Facilita o teste de progênie 
 Valorização do rebanho  Uso de 
diferentes raças 
 Melhoria de características 
desejáveis 
 Aumento na capacidade de produção 
 Menores gastos com manutenção do 
rebanho 
 Eliminação de barreiras de tempo e 
espaço 
 Aprimoramento do manejo 
 Encurtamento da estação reprodutiva 
 
 Controle de doenças  Geração de 
descendentes após a morte do 
reprodutor  Uso de machos 
incapacitados de montar 
LIMITAÇÕES DA IA EM BOVINOS 
 Pessoal habilitado  Dependência de detecção de 
cios 
 
 Planejamento prévio 
 
 
 Resumo | @medveterinars 
 Gastos com material e sêmen  Levantamento 
sanitário 
Pré-requisitos para IA 
 Animais  vacas ou novilhas  bom 
estado corporal  saudáveis  
histórico reprodutivo aceitável  
identificadas (a ferro ou brincos) 
 
 Manejo  sanitário 
 
nutricional
 
reprodutivo
 
 
 Assistência Técnica Veterinária  
levantamento sanitário  atuação 
preventiva 
  escolha dos touros 
  
implantação, execução e avaliação 
 Instalações  tronco, seringa e 
cômodo  energia elétrica e ponto de 
água  cobertura 
 Sêmen  empresa confiável ou 
congelado na fazenda (veterinário 
especializado)  armazenado 
adequadamente 
 
sobras: avaliação 
 Inseminador  responsável e 
organizado  higiene pessoal e 
profissional  bom curso teórico e 
prático Pré-requisitos para IA 
Detecção do Estro 
Manhã e Tarde (1 a 2 horas de 
observação) 
REGRAS GERAIS 
• Características fisiológicas – 
Duração de cio /momento da 
ovulação 
– Viabilidade espermática (in vitro / 
in vivo) – Viabilidade do ovócito pós 
ovulação 
Quando inseminar? 
 12 horas após observação do cio 
(aceitação de monta) 
Lembrete:  Duração do estro: 10 a 18 
horas. 
Ovulação: 30 horas após o início do 
estro (18 a 48) . 10 a 15 horas após 
o final do estro. 
 Viabilidade do oócito: 6 a 10 horas. 
 Viabilidade espermática: 12 a 24 
horas (4 a 48). 
Material para IA em Bovinos 
 Sêmen (Botijão de nitrogênio 
líquido) °  Banho-Maria ou água 
a 37o C °
 
 Resumo | @medveterinars 
 Termômetro  Pinça 
  Papel  Tesoura 
ou cortador de palheta  Aplicador 
universal  Bainha francesa  Luvas 
para palpação 
Palhetas 
 0,5 mL (grossa)  0,25 mL (fina) 
Dose Inseminante: 
 10 milhões sptz viáveis –
Armazenamento do Sêmen 
Botijão Criogênico: Nitrogênio 
Líquido = -196oC 
Material para IA 
Banho-Maria ou água a 37o C 
 , 
Pinça e Tesoura ou cortador de palheta 
Aplicador universal e Bainha 
Francesa, Limpeza do reto e 
Higienização Peri-vulvar 
Descongelação do Sêmen 
 Palhetas 0,5 mL  37o C/30 segundos 
 Palhetas 0,25 mL  37o C/7 segundos 
Passo a passo 
°
 
Finalização: 
Massagem no clítoris (Estimula 
contratilidade uterina) 
INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM EQÜINOS 
Manejo Reprodutivo em Eqüinos 
Reprodução a campo  
Transmissão de doenças 
 Acidentes 
 ? Data das 
coberturas 
  Número reduzido de 
éguas/garanhão 
Reprodução controlada ou assistida 
 Monta 
  IA 
VANTAGENS DA IA EM EQÜINOS 
 Multiplicação da capacidade 
inseminante de um ejaculado. 
  Maior 
uso de garanhões geneticamente 
superiores. 
 
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 Ajuda no diagnóstico de garanhões 
inférteis. 
  Elimina custo e estresse no 
transporte de égua e potro. 
 
Reduz a possibilidade de transmissão 
de doenças entre as propriedades.  
Diminui o risco de contaminação pela 
cobertura. 
LIMITAÇÕES DA IA EM EQÜINOS 
 Técnico habilitado (médico 
veterinário).  Acompanhamento do 
desenvolvimento folicular (palpação 
ou U.S.). 
  Custo para 
implantação.  Coordenação entre: 
colheita e transporte do sêmen e IA. 
  Sêmen 
de alguns garanhões não resfriam 
adequadamente. 
 
 
 
Características do Estro 
 Edema de vulva  Hiperemia de vulva 
 Presença de muco  Micção freqüente 
 Cauda levantada  Contrações 
rítmicas do clitóris  Orelhas em pé 
 Passiva ao macho  
Membros afastados 
 
Corredor de rufiação 
Inseminação Artificial 
Sem acompanhamento folicular (com 
sêmen fresco):  2 o , 4o e 6o dia do 
estro 
  3 o e 5o dia do estro 
Com acompanhamento folicular 
(resfriado): tem que ser coordenado  
Palpação retal  Ultra-sonografia 
Acompanhamento Folicular 
 
 Resumo | @medveterinars 
Ovário: 5 cm (1 a 8 cm) 
Folículo pré-ovulatório: 45 mm (10 a 
70 mm) 
Quando inseminar? 
Pré-ovulação ou pós-ovulação 
 
Viabilidade do oócito após ovulação: 
6 a 12 horas 
 Viabilidade dos 
espermatozóides no trato reprodutivo 
feminino: 48 horas (sêmen fresco) 
24 horas (sêmen resfriado) 
Processamento do Sêmen para 
Inseminação Artificial 
Diluição do sêmen para IA a fresco 
(imediata). 
 Resfriamento 
do sêmen (IA até 48 a 70 horas após a 
colheita). Criopreservação (IA tempo 
indeterminado). 
Preparo da Dose Inseminante 
Diluição: Proporção 1:1 em diluidor a 
base de leite desnatado (KENNEY et 
al., 1975) 
Diluição e resfriamento do sêmen: 
 Prolonga a vida dos espermatozóides 
por estabilizar o sistema enzimático. 
 Mantém a integridade das membranas 
espermáticas.  Protege contra 
injúrias causadas por choque térmico. 
 Evita os efeitos 
deletérios de produtos tóxicos 
produzidos pelos espermatozóides. 
  
Previne o crescimento de 
microorganismos. 
Resfriamento do Sêmen 
24 – 70 horas 
Preparo da Dose Inseminante 
Dose inseminante: 200 a 500 milhões 
sptz viáveis 
Semen sexado associado a Inseminação 
por histeroscopia 
 2000: “La Luna” e “Alexander the 
Great”c/ 5 milhões de sptz sexados (1% 
da dose inseminante) – via 
histeroscopia.  2001: “Starman”, 
primeiro de sêmen resfriado também via 
histeroscopia.