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Identificação Laboratorial de Leveduras de Importância Médica
Inneke Marie van der Heijden
Laboratório de Bacteriologia (LIM-54)
Instituto de Medicina Tropical II
Hospital das Clínicas - FMUSP
Características gerais
	Grupo heterogêneo
	Unicelulares
	Diversidade
Cor das colônias
Textura
	Reprodução
Reprodução das leveduras
	Assexuada
Estado anamorfo
Por brotamento ou gemulação
Formação blastoconídios e pseudo-hifas
Reprodução das leveduras
	Reprodução sexuada: conjugação
Ascosporadas
 Candida guilliermondii (anamorfo)
 Pichia guilliermondii (teleomorfo)
Anascosporadas
 Candida famata (anamorfo)
 Debaryomyces hansenii (teleomorfo)
Balistosporadas
 Rhodotorula rubra
Basidiosporadas
Cryptococcus neoformans (anamorfo)
Filobasidiella neoformans (teleomorfo)
Procedimentos laboratoriais
	Diagnóstico laboratorial
Exame direto: levedura ou fungo filamentoso ?
Cultura: isolamento e identificação
	Condições adequadas de incubação
Meio de cultivo 
Temperatura 
Tempo
	Agar Sabouraud com cloranfenicol (leveduras e fungos filamentosos)
	Agar PDA (batata-dextrose) (fungos filamentosos)
	Agar Mycobiotic=Mycosel= agar seletivo para fungos patogênicos (uso restrito=inibe vários fungos sensíveis à cicloheximida, inclusive leveduras) 
Meios mais utilizados na micologia
Exame direto da amostra
	“a fresco” entre lâmina e lamínula
	após clarificação com KOH (10 a 20%)
	com tinta da China (nanquim)
	após coloração:
.esfregaços (Gram, Giemsa e outras)
.cortes histológicos (Mucicarmin de Mayer, Gomori-Grocott, H.E. e outras)
Exame da cultura:
achados microscópicos
	Leveduras com filamentação (hifas)
abundante: Candida spp.
escassa: Candida spp e outras dezenas de gêneros (p.ex. hifas curtas,curvas=Malassezia spp)
	Leveduras sem filamentação
Sem cápsula: Candida spp e outros gêneros
capsuladas: Cryptococcus neoformans
Exame direto - Leveduras 
Identificação Laboratorial
Coloração de GRAM
Coloração de Mucicarmin
Fonte: Laboratório de Micologia – IMT – LIM – HC/FMUSP
Coloração de Gomori-Grocott
Fonte: Laboratório de Micologia – IMT – LIM – HC/FMUSP
Identificação Laboratorial
	Pureza das colônias
Detecção por exame direto
Sub-cultivo
Técnica de esgotamento
Meios seletivos
Cloranfenicol: inibir bactérias
Cicloheximida: inibir fungos anemófilos
Identificação Laboratorial
	Características macroscópicas
Identificação Laboratorial
	Características microscópicas
Técnica de esgotamento
Finalidade: obter colônias isoladas
Pureza das colônias
CHROMagar Candida
Sugere espécie conforme
cor da colônia:
Verde = C. albicans
Azul = C. tropicalis
Rosa = C. krusei
Branco = outras espécies
 e outros gêneros
	 Alternativa: meios cromogênicos
Identificação Laboratorial
	Métodos clássicos
Análise morfológica
Assimilação de fontes de carbono e nitrogênio
Fermentação de carboidratos
Hidrólise da uréia (teste da urease)
	Métodos comerciais
Métodos clássicos de identificação de leveduras
	Análise morfológica 
presença de cápsula
produção de tubo germinativo, em geral leitura às 2h
cultivo em lâmina (micromorfologia, filamentação e presença de clamidosporos)
Tubo germinativo
	Identificação presuntiva e rápida de Candida albicans
	Descrito em 1960
	Capacidade de formar filamentos na presença de soro (1-3 h)
Humano, fetal bovino ou cavalo
	Técnica simples
	94-97% de positividade para C. albicans
Sidrim et al., 1999
Fonte: Manual da ANVISA, 2005-Módulo 7 
Análise morfológica
	 Produção de tubo germinativo
1 - ausência de tubo germinativo
2 - presença de tubo germinativo
1
2
Produção de tubo 
germinativo
Análise morfológica
	 Cultivo em lâmina 
Fonte: Manual da Anvisa, 2005- Módulo 7 
Cultivo em lâmina 
Espécies de
 Candida spp
Candida albicans
Análise morfológica
	 Presença de cápsula
Análise morfológica
	 Presença de cápsula
Métodos clássicos de identificação de leveduras
	Assimilação de fontes de C
	Assimilação de nitrogênio
	Fermentação de carboidratos
ZIMOGRAMA
	Hidrólise da uréia (teste da urease)
AUXANOGRAMA
}
}
AUXANOGRAMA
	Presença de oxigênio
	Utilização de fontes de:
Carbono (a partir de açúcares)
Nitrogênio (a partir de nitrato)
	CQ: cepas ATCC
	Meio basal sem fonte de carbono
Sólido ou líquido
Yeast Nitrogen Base (YNB)- 40mL
	Inóculo: escala 1 McFarland (2mL)
	Incorporar suspensão de levedura ao meio
	Aplicação de discos ou açúcar in natura
	Incubação 30oC por 24-48h
AUXANOGRAMA
	Meio basal sem fonte de nitrogênio
Sólido 
Yeast Carbon Base (YCB)- 20mL
	Inóculo: escala 1 McFarland (1mL)
	Incorporar suspensão de levedura ao meio
AUXANOGRAMA
Auxanograma
	Aplicação de compostos nitrogenados
Peptona (controle positivo)
Nitrato de potássio
	Incubação 30oC por 24-48 h até 7 dias 
	Resultados: presença de zona de crescimento (leitura visual) 
	Baixa tensão de oxigênio
	Fermentação
	Utilização de fontes de Carbono 
a partir de açúcares
produção de CO2
	Meio líquido ou semi-sólido gelosado
 a 0,6%
ZIMOGRAMA
	Meio basal (3mL)
Azul de bromotimol (opcional), extrato de levedura, peptona, etanol 95% e água
	Solução de açúcar 6% (1,5mL)
	Suspensão levedura: 2 McFarland (0,2mL/tubo)
	Leitura após 10-14 dias de incubação a 37oC
	Resultados: presença ou ausência de bolhas no tubo de Durham
ZIMOGRAMA
Testes adicionais
	 Teste da urease
Positiva: Cryptococcus neoformans
Negativa: Candida albicans
	 Resistência à cicloheximida
Resistentes: C. albicans, C. stellatoidea, C.guilliermondii e C.pseudotropicalis
Cultura positiva
Exame direto
Bactéria
Levedura
Cultura Pura
Sim
Não
Obter Colônia Pura por isolamento
Cápsula 
+
Macromorfologia
Colônia bege: Criptococcus sp
Colônia salmão/laranja:
Rhodothorula sp
-
Tubo Germinativo
-
+
C. albicans
Provas Bioquímicas e Cultivo em Lâmina (continua)
Fluxograma para Identificação de Leveduras de Importância Médica
Cultivo em lâmina
Provas bioquímicas
	Blastoconídios - Urease positiva:
Inositol - : Rhodotorula
Inositol + : Cryptococcus
	Presença de artrósporos(=artroconidios)
Urease - : Geotrichum
Urease + : Trichosporon (brotamento +)
Artrósporos
www.botany.utoronto.ca 
www.mycology.adelaide.edu.au 
Geotrichum sp.
Artrósporos – 
Trichosporon sp.
http://www.doctorfungus.org
Trichosporon beigelii
Sidrim et al., 1999
Métodos comerciais de identificação de leveduras
	Chromoagar Candida 
	API 20C AUX (BioMérieux)
	ID 32C (BioMérieux)
	Candifast (International Microbio)
	Vitek (BioMérieux)
Meios cromogênicos
	Cromogênicos: detectam enzimas através de substratos específicos ou substratos cromógenos
	Permitem detecção de colônias mistas
	Rápida identificação de C. albicans
Chromoagar Candida
	Colônias:
Verdes = C. albicans
Azul = C. tropicalis
Rosa = C. krusei
Branco = outras espécies
Painel de identificação 
API20C AUX system (BioMérieux)
	19 testes assimilativos - incubação 30oC - 24, 48 e 72 horas
	Leitura por verificação de crescimento - turbidez
	Necessidade de correlação com a análise morfológica
	Informa a necessidade de testes adicionais
	Método de referência
	Acurácia entre 96 e 98% para as espécies patogênicas mais comuns, sem testes adicionais
API20C AUX system
 (BioMérieux)
API20C AUX system 
(BioMérieux)
API20C AUX system 
(BioMérieux)
ID 32 C STRIPS 
(BioMérieux)
	29 testes
	leitura após 24/48 horas de incubação a 30oC - visual ou automatizada
	taxas de identificação variam de 94 a 98 %
	Ramani et al, 1998
taxa de identificação de 92% para as espécies comuns de leveduras
85 % para isolados raros
	apresenta uma base de dados bastante ampliada
Comparação entre os métodos comerciais 
semi-automatizados mais utilizados na identificação de leveduras
Fonte: Sidrim e Moreira, 1999.
Candifast (International Microbio)
	Identificação e teste de sensibilidade
	Gêneros: Candida, Trichosporon, Cryptococcus, Rhodotorula e Saccharomyces
	Único inóculo e leitura colorimétrica
	Resultados em 24 a 72 horas (37oC)
	Identificação
sensibilidade actidione
fermentação de 7 açúcares
hidrólise da uréia
	Teste de Sensibilidadesete antifúngicos: 1 concentração
www.int-microbio.com
Entre as cepas identificadas estão: Candida krusei; Candida glabrata; Candida tropicalis; Candida albicans e outras.
No teste de sensibilidade encontram-se: Fluconazol; Miconazol; Cetoconazol; Econazol; Flucitosina; Nistatina e Anfotericina B.
Vitek system (BioMérieux)
	Sistema automatizado: leitura turbidimétrica
	26 substratos baseado nos métodos convencionais
	Bionúmero - banco de dados do sistema
	Resultado: percentual de probabilidade de ser a espécie identificada
Vitek system (BioMérieux)
	16 espécies de Candida
	6 espécies de Cryptococcus
	3 espécies de Rhodotorula
	2 espécies de Trichosporon
	3 espécies de Geotrichum
	2 espécies de Prototheca, Pichia anomala, Pichia ohmeri, Saccharomyces cerevisiae e Yarrowia lipolytyca
Vitek system (BioMérieux)
	Percentual de probabilidade é baixo = testes adicionais
	93 % das leveduras comuns foram identificadas
	55 % das leveduras menos comum foram corretamente identificadas
	Falhas na identificação:
42% de C. krusei
80 % de C. lambica
88 % de T. beigelli 
83 % de Cryptococcus (não C.neoformans)
Vitek system (BioMérieux)
	Sistema rápido e adequado para identificar os isolados clínicos comuns
	Falhas na identificação de leveduras não usuais (Dooley et al, 1994)
Vitek 2
	Vitek 2 ID YST Card
	47 testes (29 clássicos e 18 enzimáticos)
	leitura fluorescente automatizada
	15 horas de incubação
	base de dados com 51 espécies
	inclui Candida dubliniensis e a atualização sistemática dos gêneros Rhodotorula e Trichosporon 
	taxa de identificação de 96,8%
Comparação entre métodos 
comerciais para identificação de 
leveduras
	Candifast X Vitek
98% de concordância (www.int-microbio.com)
	Candifast X API 20C AUX (Gundes et al., 2001)
116 isolados clínicos (C.albicans, C.parapsilosis, C.glabrata e outras leveduras)
87% de identificações corretas para API 20C 
82,7% de identificações corretas para Candifast
Diante disso a International Microbio desenvolveu o Candifast que se baseia: na susceptibilidade da cepa analisada à actidiona que se evidencia pela mudança de cor do indicador; na fermentação de sete açúcares; a determinação da resistência das leveduras a alguns agentes antifúngicos está baseada no crescimento ou na ausência de crescimento na presença de vários antifúngicos pela mudança de cor do meio pela fermentação da glicose ou hidrólise da uréia pelo indicador vermelho de fenol. 
Sidrim, JJC & Rocha, MFG (1999).
Sidrim, JJC & Rocha, MFG (1999).
Sidrim, JJC & Rocha, MFG (1999).
Considerações finais
	Diversos métodos 
	Diferentes níveis de sensibilidade, especificidade e acurácia em cada sistema 
	Necessidade de estudo morfológico e/ou a complementação com testes tradicionais
	Escolha do(s) método(s) 
Realidade de cada laboratório
Freqüência de isolamento
Custo do teste
Eficácia do teste