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VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE 
RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Profa. Cristiane Masetto de Gaitani (crisgai@fcfrp.usp.br)
Módulo II - Farmacotécnica e Tecnologia de Medicamentos e Cosméticos 
Ribeirão Preto - 2020
CONCEITO
“A validação deve garantir, através de estudos
experimentais, que o método atenda às exigências das
aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos
resultados” (ANVISA)
“A validação de métodos assegura a credibilidade
destes durante o uso rotineiro, sendo algumas vezes
mencionado como o “processo que fornece uma
evidência documentada de que o método realiza aquilo
para o qual é indicado para fazer” (USP)
� 2 Tipos
Validação no Laboratório
Validação Completa
Estudo InterlaboratorialEstudo Interlaboratorial
�� No Brasil No Brasil –– IPT (Instituto de Pesquisas Tecnológicas)IPT (Instituto de Pesquisas Tecnológicas)
METODOLOGIA OFICIALMETODOLOGIA OFICIAL
LEGISLAÇÃO
�Brasil
ANVISA ����Resolução ANVISA RDC nº 27, de 17/05/2012 (métodos bioanalíticos)
ANVISA ����Resolução ANVISA RDC nº 166, de 24/07/2017 (métodos analíticos)
�FDA
Guidance for Industry, Bioanalytical Method Validation, 2001
Guidance for Industry, Analytical Procedures and Methods Validation, 2000
�ICH 
Validation of Analytical Procedures: Definitions and Terminology, Q2A (CPMP/ICH/381/95), 1995
Validation of Analytical Procedures: Methodology, Q2B (CPMP/ICH/281/95), 1995
�European Medicines Agency
Guideline on bioanalytical method validation
EMA/CHMP/EWP/192217/2009, 21 July 2011 
Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP)
PROCESSO DE VALIDAÇÃO
� estudos de validação sejam representativos
� variação da faixa de concentração adequada
� tipos de amostras adequados
OS PARÂMETROS ANALÍTICOS DEVEM SER BASEADOS 
� Tipo de análise
� Freqüência uso
Parâmetros a serem 
analisados
OS PARÂMETROS ANALÍTICOS DEVEM SER BASEADOS 
NA INTENÇÃO DO USO DO MÉTODO
QUANTIFICAÇÃO DO COMPOSTO DE INTERESSE 
• Padronização externa
• Padronização interna
- substância na amostra
- soluções de concentrações conhecidas (padrão referência)
- Erros de preparo das amostras
�Padronização externa
- Erros de preparo padrão
- Erros de leituras
�Padronização externa
- solução-padrão de concentração conhecida
- adição de um padrão interno (concentração conhecida)
�Padronização interna
PADRÃO INTERNO IDEAL
Puro, estável e não-reativo;
Pouco volátil;
Não deve estar presente na amostra;
Completamente resolvido dos demais picos;
Padrão interno ideal
Completamente resolvido dos demais picos;
Deve eluir próximo aos picos de interesse;
Propriedades físico-químicas semelhantes aos compostos
analisados.
Concentração
plasmática (μg/mL)
Área do pico
10 50500
10 39250
10 38560
20 90800
20 99780
20 71068
�Padronização interna
20 71068
40 199230
40 210780
40 167579
80 360678
80 400676
80 399876
100 502780
100 322450
100 450720
y = 4437,6x + 5102,2
R² = 0,9361
400000
500000
600000
Área do pico 
�Padronização interna
0
100000
200000
300000
0 20 40 60 80 100 120
U
A
Conc. Plasmática (ug/mL)
Concentração
plasmática (μg/mL)
Área do pico Área padrão interno 
(PI)
10 50500 12500,1
10 39250 9700,3
10 38560 9812,6
20 90800 11390,1
20 99780 12550,9
20 71068 9170,8
�Padronização interna
Área pico/área 
padrão interno
4,040
4,046
3,930
7,972
7,950
7,74920 71068 9170,8
40 199230 12444,5
40 210780 12556,2
40 167579 11140,2
80 360678 10999,5
80 400676 12499,2
80 399876 12498,5
100 502780 12527,1
100 322450 8300,2
100 450720 11320,5
7,749
16,009
16,787
15,043
32,790
32,056
31,994
40,135
38,848
39,814
�Padronização interna
y = 0,398x + 0,011
R² = 0,998
25,000
30,000
35,000
40,000
45,000
Área pico/área padrão interno 
0,000
5,000
10,000
15,000
20,000
25,000
0 20 40 60 80 100 120
Conc. Plasmática (ug/mL)
U
A
�Padronização interna
Concentração
plasmática (μg/mL)
Área do pico Área padrão interno 
(PI)
10 50500 12500,1
10 39250 9700,3
10 38560 9812,6
20 90800 11390,1
20 99780 12550,9
20 71068 9170,8
Área pico/área 
padrão interno
4,040
4,046
3,930
7,972
7,950
7,74920 71068 9170,8
40 199230 12444,5
40 210780 12556,2
40 167579 11140,2
80 360678 10999,5
80 400676 12499,2
80 399876 12498,5
100 502780 12527,1
100 322450 8300,2
100 450720 11320,5
7,749
16,009
16,787
15,043
32,790
32,056
31,994
40,135
38,848
39,814
Parâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodos
SELETIVIDADE
Capacidade de avaliar, de forma inequívoca, a substância de 
interesse na presença de componentes que possam 
interferir na análise, como impurezas, diluentes e 
componentes da matriz 
Uso de detectores que comparam o pico obtido na separação com
o de um padrão (arranjo de diodos, espectrômetro de massas)
Para demonstrar ausência de interferência de produtos de
degradação, é necessário expor a amostra a condições de
degradação em ampla faixa de pH, de oxidação, de calor e de luz
LINEARIDADE 
Corresponde à capacidade do método em fornecer
resultados diretamente proporcionais à concentração da
substância em exame, dentro de uma determinada faixa de
aplicação.
Parâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodos
aplicação.
Parâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodos
LINEARIDADE 
O coeficiente de correlação linear (r) é frequentemente usado para
indicar o quanto pode ser considerada adequada a reta como modelo
matemático
Parâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodos
LINEARIDADE 
A linearidade deve ser demonstrada pela inclinação da reta
(estatisticamente diferente de zero e reprodutível), o intercepto (não
estatisticamente diferente de zero) e o coeficiente de correlação (não
estatisticamente diferente de 1) ;
ANVISA: r acima de 0,990
Como os desvios da linearidade são muitas vezes difíceis de serem
detectados visualmente, pode-se verificar a sua adequação por meio do
cálculo dos resíduos entre os valores medidos e os valores calculados
a partir da equação de regressão
A dispersão das medidas (valores de y) deve ser independente da
Parâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodos
LINEARIDADE 
A dispersão das medidas (valores de y) deve ser independente da
concentração do padrão de calibração, seguindo uma distribuição
normal, propriedade conhecida como homoscedasticidade
Homocedasticidade: igual (homo) dispersão (cedasticidade), isto é,
igual variância
Heteroscedasticidade: forte dispersão dos dados em torno de uma reta
concentração concentração Área do
da solução trabalho plasmática Pico
10 0,5 484
10 0,5 552
10 0,5 565
20 1 1072
20 1 1046
P
a
d
ro
n
iz
a
ç
ã
o
 e
x
te
rn
a
LINEARIDADE 
Parâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodos
20 1 1068
100 5 5828
100 5 5845
100 5 5789
200 10 10536
200 10 10341
200 10 11234
500 25 24987
500 25 23456
500 25 24567
P
a
d
ro
n
iz
a
ç
ã
o
 e
x
te
rn
a
y = 967,29x + 462,79
R2 = 0,9959
15000
20000
25000
30000
Á
re
a 
d
o
 p
ic
o
P
a
d
ro
n
iz
a
ç
ã
o
 e
x
te
rn
a
LINEARIDADE 
Parâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetrosanalíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodos
0
5000
10000
15000
0 5 10 15 20 25 30
Concentração (µg/mL)
Á
re
a 
d
o
 p
ic
o
P
a
d
ro
n
iz
a
ç
ã
o
 e
x
te
rn
a
concentração concentração Área do Concentração Erro 
da solução trabalho plasmática Pico Obtida Relativo (%)
10 0,5 484 0,02 -95,61
10 0,5 552 0,09 -81,55
10 0,5 565 0,11 -78,87
20 1 1072 0,63 -37,02
20 1 1046 0,60 -39,71
P
a
d
ro
n
iz
a
ç
ã
o
 e
x
te
rn
a
LINEARIDADE 
Parâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodos
20 1 1046 0,60 -39,71
20 1 1068 0,63 -37,43
100 5 5828 5,55 10,93
100 5 5845 5,56 11,28
100 5 5789 5,51 10,13
200 10 10536 10,41 4,14
200 10 10341 10,21 2,12
200 10 11234 11,14 11,35
500 25 24987 25,35 1,41
500 25 23456 23,77 -4,92
500 25 24567 24,92 -0,32
P
a
d
ro
n
iz
a
ç
ã
o
 e
x
te
rn
a
Parâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodos
Gráfico de resíduos
Análise dos Resíduos: conjunto de técnicas utilizadas para investigar a
adequabilidade de um modelo de regressão com base nos resíduos.
Resíduo: Valor
experimental (obtido) –
valor real (teórico) versus
concentração
•O efeito matriz deve ser determinado por meio da comparação
entre os coeficientes angulares das curvas de calibração
construídas com a substância química de referência (SQR) do
analito em solvente e com a amostra fortificada com a SQR do
analito.
EFEITO MATRIZ
Amostras complexas
analito.
•As curvas devem ser estabelecidas da mesma forma que na
linearidade para os mesmos níveis de concentração, utilizando, no
mínimo, 5 níveis de concentrações diferentes em, no
mínimo, triplicata.
•O paralelismo das retas é indicativo de ausência de interferência
dos constituintes da matriz e a sua demonstração deve ser
realizada por meio de avaliação estatística adequada.
A precisão de um método analítico está relacionada com a 
dispersão das medidas ao redor do seu valor médio. 
- desvio padrão absoluto (σσσσ), n>>>>20
- n geralmente é pequeno, e o que se calcula é a estimativa do
desvio padrão absoluto (s).
Parâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodos
PRECISÃO 
desvio padrão absoluto (s).
estimativa do desvio padrão relativo ou coeficiente de variação
Parâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodos
PRECISÃO 
Repetibilidade
�A precisão em validação de métodos é considerada em três 
níveis diferentes: 
Parâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodos
PRECISÃO 
Precisão intermediária
Reprodutibilidade
Repetibilidade (precisão intra-corrida)
concordância entre os resultados de medições sucessivas de um 
mesmo método, efetuadas sob as mesmas condições de medição 
(analista, instrumento e condições, local, curto intervalo de tempo)
Parâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodos
PRECISÃO 
Precisão intermediária (precisão inter-corridas)Precisão intermediária (precisão inter-corridas)
indica o efeito das variações dentro do laboratório devido a 
eventos como diferentes dias ou diferentes analistas ou 
diferentes equipamentos ou uma combinação destes fatores
Reprodutibilidade (precisão inter-laboratorial)
grau de concordância entre os resultados das medições de 
uma mesma amostra, efetuada sob condições variadas 
(mudança de operador, local, equipamentos, etc.)
EXATIDÃO
grau de concordância entre os resultados individuais 
encontrados em um determinado ensaio e um valor de 
referência aceito como verdadeiro
A exatidão de um método analítico é definida como a diferença 
entre o valor experimental obtido (média) e o valor verdadeiro 
Parâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodos
entre o valor experimental obtido (média) e o valor verdadeiro 
(teórico) presente na amostra 
EXATIDÃO
Parâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodos
LIMITE DE DETECÇÃO
menor concentração da substância em exame que pode ser
detectada, mas não necessariamente quantificada,
utilizando um determinado procedimento experimental
Parâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodos
• Método baseado em parâmetros da curva analítica
LIMITE DE DETECÇÃO
Parâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodos
s = estimativa do desvio padrão do coeficiente linear da equação 
S = coeficiente angular da curva de calibração analítica (slope)
LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO
Representa a menor concentração da substância em exame
que pode ser medida, utilizando um determinado
procedimento experimental
Parâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodos
COMPROMISSO:
CONCENTRAÇÃO/PRECISÃO/EXATIDÃO
De acordo como método analítico e seu respectivo uso
LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO
Parâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodos
•• Método baseado em parâmetros da curva analítica
s = estimativa do desvio padrão do coeficiente linear da equação 
S = coeficiente angular da curva analítica (slope)
Mede a sensibilidade que o método apresenta face a
pequenas variações
As mudanças introduzidas refletem as alterações que podem
ocorrer quando um método é transportado para outros
ROBUSTEZ
Parâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodos
ocorrer quando um método é transportado para outros
laboratórios, analistas ou equipamentos
Método cromatográfico: proporção solvente orgânico, pH e
força iônica, temperatura,
ESTABILIDADE DOS PADRÕES E AMOSTRAS
- Para gerar resultados confiáveis e reprodutíveis, as
amostras, os padrões e reagentes usados devem ser estáveis
por um período razoável
Parâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodos
- Esta estabilidade é importante em termos de temperatura e
tempo
- Embora a estabilidade de dias ou meses seja mais desejável,
em alguns casos as soluções precisam ser preparadas antes
de cada análise
REVALIDAÇÃO
É a reavaliação de um método analítico validado em resposta 
a uma mudança em algum aspecto do método
Situações:
Parâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodos
• Alterações de reagentes e equipamentos, por mudança de
fornecedor, troca de componentes ou desgaste do
equipamentopelo uso constante
• Alteração na proposta e/ou nível de qualidade desejados
• Uso apenas após um certo período de tempo
Pequenas variações - ROBUSTEZ
CONCLUSÕES
• Conceitos em constante evolução
• Técnicas cromatográficas e eletroforéticas são alvos
primordiais dos procedimentos de validação
• Legislação: ANVISA e INMETRO
Parâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodosParâmetros analíticos para validação de métodos
• Legislação: ANVISA e INMETRO
• A validação deve ser planejada antes de seu
desenvolvimento e execução
• Embora possa ser um processo trabalhoso, a qualidade dos
resultados gerada é diretamente relacionada à qualidade do
processo
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ANVISA - AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Diretoria
Colegiada. Resolução RDC nº 166, de 24 de julho de 2017.
RIBANI, M.; BOTTOLI, C. B. G.; COLLINS, C. H.; JARDIM, I. C. S. F.; MELO,
L. F. C. Validação em métodos cromatográficos e eletroforéticos. Quim.
Nova, v. 27, p.771-780, 2004.
UNITED STATES PHARMACOPEIA. 31th ed. Rockville: United States
Pharmacopeial Convention, 2008.
Cassiano, N. M.; Barreiro, J. C.; Martins, L. R. R.; Oliveira, R. V.; Cass, Q. B.
Validação em métodos cromatográficos para análises de pequenas
moléculas em matrizes biológicas. Química nova, 32, 1021-1030, 2009.