TECNICAS DE ESTERELIZAÇÃO EM CULTURA DE TECIDOS

•

UNEB

Cinthia Carolinne@hotmail.com

20/05/2020

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Biotecnologia

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UNIVERSIDADE DO ESTADO DA BAHIA – UNEB
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA E CIÊNCIAS
SOCIAIS
CURSO DE ENGENHARIA AGRONÔMICA, CAMPUS III

CINTHIA CAROLINNE DE SOUZA FERREIRA

TÉCNICAS DE ESTERILIZAÇÃO EM CULTURA DE
TECIDOS

JUAZEIRO – BA, 2016

CINTHIA CAROLINNE DE SOUZA FERREIRA

Relatório de Estagio Supervisionado, conforme
Resolução Nº 88/93 apresentado ao DTCS da
Universidade do Estado da Bahia, como parte dos
requisitos para a obtenção do Título de Bacharel
em Engenharia Agronômica.

JUAZEIRO – BA, 2016

Relatório de Estágio Supervisionado

CERTIFICADO DE APROVAÇÃO

CINTHIA CAROLINNE DE SOUZA FERREIRA

DIFERENTES TÉCNICAS DE ESTERILIZAÇÃO NA MICROPROPRAGAÇÃO

Relatório de estagio supervisionado do curso de
Engenharia Agronômica, apresentado à
Universidade do Estado da Bahia, sob Supervisão
e orientação da Prof.ª. Dra. Joselita Cardoso de
Souza da Universidade do Estado da Bahia,
Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais,
Campus III, concedente do Estágio.

Aprovada em: __/ __/______

Comissão Examinadora

___________________________________________
Prof.ª Drª. Joselita Cardoso de Souza
Universidade do Estado da Bahia (DTCS/UNEB)

__________________________________________
Prof. Dr. Alessandro Carlos Mesquita
Universidade do Estado da Bahia (DTCS / UNEB)

_________________________________________
Prof.ª Drª. Maria Herbênia Lima Cruz Santos
Universidade do Estado da Bahia (DTCS/UNEB

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DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho a Deus, o autor de grandes
maravilhas em meu viver, aos meus pais e em
especial a minha dádiva divina meu filho Nathan
Guilherme.

AGRADECIMENTOS

Á Deus que com seu amor sublime nos concede o dom da vida, semeia em nossos
corações sonhos e nos dar força e sabedoria para torná-los realidade. A ti Senhor, meu
coração será sempre grato, por tudo que fez, faz e irá fazer em meu viver, pois reconheço
que diante de ti eu nada sou. Acredito que todas as coisas cooperam para o bem daqueles
que te ama, que traçamos planos, mas é o Senhor que os conduzem a acontecer, pois teus
propósitos são maiores e melhores do que os nossos!
Á Washington Luís Ferreira e Elizabeth de Souza, meus pais, meus exemplos de vida
lutas e conquistas, por todo amor, cuidado, dedicação, orientação e pela formação do meu
caráter. Agradeço, aquele que me ensinou a ter responsabilidades e me fez sonhar muito
mais alto, que me alegra todo dia, minha presente de Deus, meu filho, meu Gui!
A minha família pelo afeto, compreensão, pelo testemunho de cada um, ás minhas Marias
(tias) por todas as orações e por todo apoio em cada decisão por mim tomada.
A Pedro Ferreira (namorado e amigo) que sempre acreditou no meu potencial e juntos
construímos valores e sentimentos para toda vida.
A UNEB, por me proporcionar momentos inesquecíveis e por ter possibilitado estreitar
laços de amizade com pessoas maravilhosas.
Aos professores que compartilharam o seu saber, em especial a profª. Drª. Joselita
Cardoso que me acolheu e instruiu na etapa final da graduação, dividiu comigo
carinhosamente seu conhecimento e tempo. Ao querido e singular profº Dr. Claudio
Mistura (in memória) pela motivação dada a cada sorriso e abraço apertado.
A toda equipe do laboratório de Biotecnologia da UNEB: Dora, Lene, Anderson, Brenda
e Damiana, que tornaram os meus dias mais divertido, por me darem força e compartilhar
comigo histórias e sentimentos (quero vocês sempre pertinho de mim).
A todos que participaram direta ou indiretamente para realização dessa conquista. O
mérito é nosso!

Aprendi com o Mestre dos Mestres que a arte de pensar é
o tesouro dos sábios. Aprendi um pouco mais a pensar
antes de reagir, a expor - e não impor - minhas idéias e a
entender que cada pessoa é um ser único no palco da
existência.
Aprendi com o Mestre da Sensibilidade a navegar nas
águas da emoção, a não ter medo da dor, a procurar um
profundo significado para a vida e a perceber que nas
coisas mais simples e anônimas se escondem os segredos
da felicidade.
Aprendi com o Mestre da Vida que viver é uma
experiência única, belíssima, mas brevíssima. E, por
saber que a vida passa tão rápido, sinto necessidade de
compreender minhas limitações e aproveitar cada
lágrima, sorriso, sucesso e fracasso como uma
oportunidade preciosa de crescer.
Aprendi com o Mestre do Amor que a vida sem amor é
um livro sem letras, uma primavera sem flores, uma
pintura sem cores. Aprendi que o amor acalma a emoção,
tranquiliza o pensamento, incendeia a motivação, rompe
obstáculos intransponíveis e faz da vida uma agradável
aventura, sem tédio, angústia ou solidão. Por tudo isso
Jesus Cristo se tornou, para mim, um Mestre
Inesquecível.
Augusto Cury

SUMÁRIO

RESUMO................................................................................................................3
1-NTRODUÇÃO GERAL......................................................................................4
2-REVISÃO BIBLIOGRAFICA............................................................................5
2.1-Gérbera..............................................................................................................5
2.2 - Culturas de tecidos .........................................................................................7
2.3 - Contaminações na micropropagação..............................................................8
4-REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA..................................................................10

CAPÍTULO I.........................................................................................................15
Volatilização do cloro presente no meio de cultura esterilizado com hipoclorito de
sódio na micropropagação de gérbera hibrida cv. Essandre
RESUMO..............................................................................................................16
1-INTRODUÇÃO.................................................................................................16
2-OBJETIVO........................................................................................................17
2.1-OBJETIVOS ESPECÍFICOS.........................................................................18
3-MATERIAL E MÉTODOS...............................................................................18
4-RESULTADO E DISCUSSÃO.........................................................................20
4.1-Enraizamento in vitro nos tratamentos com esterilização química e controle
sem esterilização térmica......................................................................................21
4.2- Aclimatização das plantas obtidas nos tratamentos.......................................24
5- CONCLUSÕES................................................................................................28
6- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................28

CAPÍTULO II.......................................................................................................30
Fontes de contaminação em cultura de tecidos na esterilização química e térmica
RESUMO..............................................................................................................311- INTRODUÇÃO................................................................................................31
2-OBJETIVO .......................................................................................................32
3-MATERIAL E MÉTODOS...............................................................................32
4-RESULTADO E DISCUSSÃO.........................................................................33
5- CONCLUSÕES................................................................................................37
6- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................37

CAPÍTULO..........................................................................................................39
Esterilização de meio de cultura com óleo essencial de bergamota (Citrus aurantium
subsp. Bergamia (Risso) Wight & Arn) e melaleuca (Melaleuca alternifolia Chel)
RESUMO............................................................................................................40
1-INTRODUÇÃO...............................................................................................40
2-OBJETIVO .....................................................................................................42
2.1-OBJETIVOS ESPECÍFICOS.......................................................................42
3-MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................42
4-RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................43
5- CONCLUSÕES............................................................................................. 46
6- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................46
8-ANEXO...........................................................................................................50

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO I

Volatilização do cloro presente no meio de cultura esterilizado com hipoclorito de
sódio na micropropagação de gérbera hibrida cv. Essandre

Tabela 1- Descrição dos tratamentos ...................................................................18
Tabela 2 – Desenvolvimento das plantas inoculadas no meio de cultura esterilizados
termicamente e quimicamente com NaClO, com diferentes tempos para vedação do
recipiente. Acesso 1- e inoculação com 24 horas..................................................21
Tabela 3 – Desenvolvimento das plantas inoculadas no meio de cultura esterilizados
termicamente e quimicamente com NaClO, com diferentes tempos para vedação do
recipiente Acesso 2- e inoculação com 48 horas...................................................21
Tabela 4 – Desenvolvimento das plantas inoculadas no meio de cultura esterilizados
termicamente e quimicamente com NaClO, com diferentes tempos para vedação do
recipiente. Acesso 3- e inoculação com 72 ho......................................................22
Tabela 5 – Desenvolvimento das mudas de gérberas cv. Essandre 30 dias após o início da
aclimatização em seus respectivos tratamentos.
Acesso 1 – Inoculação com 24 horas .....................................................................26
Tabela 6 – Desenvolvimento das mudas de gérberas cv. Essandre 30 dias após o início da
aclimatização em seus respectivos tratamentos.
Acesso 2 – Inoculação com 48 horas .......................................................................26
Tabela 7 – Desenvolvimento das mudas de gérberas cv. Essandre 30 dias após o início da
aclimatização em seus respectivos tratamentos.
Acesso 3– Inoculação com 72 horas ..........................................................................27

CAPÍTULO II
Fontes de contaminação em cultura de tecidos na esterilização química e térmica

Tabela 1- Descrição dos tratamentos...................................................................32
Tabela 2- Percentagem de contaminação em diferentes procedimentos de
Esterilização.........................................................................................................34
Tabela 3- Comportamento dos explantes de Gerbera hibrida cv. Essandre inoculados nos
tratamentos com esterilização térmica e química no meio de
enraizamento......................................................................................................35

CAPÍTULO
Esterilização de meio de cultura com óleo essencial de bergamota (Citrus aurantium
subsp. Bergamia (Risso) Wight & Arn) e melaleuca (Melaleuca alternifolia Chel)
Tabela 1- Percentagem de contaminação no meio nutritivo em diferentes tratamentos
Esterilização.........................................................................................................43

8-ANEXOS
Tabela 1- Composição do meio nutritivo ........................................................... 50

LISTA DE IMAGENS

CAPÍTULO I

Volatilização do cloro presente no meio de cultura esterilizado com hipoclorito de
sódio na micropropagação de gérbera hibrida cv. Essandre

Figura 1- Procedimentos...................................................................................21
Figura 2 Seca inicial dos explantes esterilizados com hipoclorito de
sódio .............. ..................................................................................................22
Figura 3 Recuperação das plantas esterilizadas quimicamente (T2 e T3) comparadas ás
inoculadas em meio autoclavado.............. .........................................................22
Figura 4- Características visuais similares das plantas submetidas ao controle térmico e
obtidas no meio com esterilização química .............. ...........................................27

CAPÍTULO II
Fontes de contaminação em cultura de tecidos na esterilização química e térmica

Figura 1- Plantas de gérbera no meio esterilizado quimicamente e termicamente após 30
dias de inoculadas .............. .................................................................................36

CAPÍTULOIII
Esterilização de meio de cultura com óleo essencial de bergamota (Citrus aurantium
subsp. Bergamia (Risso) Wight & Arn) e melaleuca (Melaleuca alternifolia Chel)

Figura 1- Controle sem esterilização com 100% contaminado .............. .............44
Figura 2- Controle com esterilização de O.E de bergamota na concentração de 0,25% ,
apresentando 80% de contaminação ........................................................................44
Figura 3- Tratamentos térmico.................................................................................44
Figura 4- Tratamentos que não apresentaram contaminação...................................44
Figura 5- Tratamentos que não apresentaram contaminação...................................44
Figura 6- Tratamentos que não apresentaram contaminação...................................45

LISTA DE ABREVIAÇÕES

MS MURASHIGE & SKOOG
NaClo Hipoclorito de Sódio
O.E Óleo essencial

RESUMO GERAL

A assepsia do ambiente, materiais e operação da prática reduz de forma considerável o
índice de contaminação, contribuído para a obtenção de bons resultados. A utilização de
técnicas alternativas à esterilização térmica de vidrarias e meio de cultura pode acelerar
o processo de micropropagação e com isso vem se desenvolvendo protocolos de
esterilização que são eficientes e menos onerosos queo método tradicional de
esterilização térmica. O trabalho foi subdivido em três capítulos referentes a diferentes
técnicas de esterilização na micropropagação abordando controles de contaminação com
utilização de esterilizante químico (NaClO) e óleos essenciais de bergamota (Citrus
aurantium subsp. Bergamia (Risso) Wight & Arn e melaleuca (Melaleuca alternifolia
Chel), e determinação das fontes de contaminação no cultivo in vitro de Gérbera hibrida
cv. Essandre. No primeiro capítulo determinou-se a influência do tempo na volatilização
do cloro presente no meio de cultura esterilizado com hipoclorito de sódio na
micropropagação de Gérbera hibrida cv. Essandre inoculadas em períodos de tempo
distintos (24, 48 e 72horas) e o desenvolvimento dessas plantas no desenvolvimento ex
vitro. Os tratamentos consistiram em controle I (Esterilização térmica), Tratamento II
(esterilização química com NaClO, com a espera de 10 minutos para vedação dos frasco)
e Tratamento III (esterilização química com NaClO, com vedação imediata dos frascos
de cultura). Os explantes foram inoculados no período de 24, 48 e 72 horas após preparo
do meio nutritivo. O segundo capitulo, baseou-se nos protocolos de controle térmico e
esterilização química com uso de hipoclorito de sódio, em que foram realizadas
adaptações a fim de determinar as fontes de contaminação no controle térmico
autoclavado e tratamento químico com hipoclorito de sódio. Os tratamentos
corresponderam a esterilização da água, vidrarias e meio, alternando os procedimentos,
visando a identificação das fontes contaminantes do cultivo in vitro. O meio esterilizado
quimicamente com NaClO e termicamente apresentaram respostas positivas na inibição
da ação de microrganismos. O mesmo ocorreu com as vidrarias e água esterilizadas com
NaClO, sem necessidade de adição do cloro ativo no meio. Quando não se esterilizou o
meio no autoclave ocorreu 100% de contaminação. As plantas inoculadas no meio onde
a esterilização química ocorreu apenas nas vidrarias e água foi similar ao das plantas no
meio esterilizado em autoclave (meio, agua e vidraria). O terceiro capítulo avaliou os
óleos essenciais de bergamota e melaleuca na esterilização de meio de cultura de
enraizamento. Determinou-se a concentração mínima inibitória (CMI) dos óleos
essenciais na esterilização do meio de cultura MS. Foram avaliadas as concentrações de
0,25%, 0,5% e 1. Após 30 dias observou-se a presença de contaminação nos frascos de
cultura e os resultados comprovaram que a CIM do O.E de bergamota foi 0,50%, e no
O.E de melaleuca a concentração de 0,25% foi eficiente no controle de microrganismos,
todavia devem ser testadas concentrações inferiores para determinação da CMI.

1-INTRODUÇÃO GERAL

A floricultura brasileira vem se destacando nos últimos anos, tornando-se uma
atividade econômica promissora, gerando emprego e renda no campo e na cidade, do
pequeno ao grande produtor (MITSUEDA ,2011). A gérbera (Gerbera jamesonii Bolus
ex Hook), comercializada como flor de corte se destaca sendo de grande aceitação, tanto
no comércio interno quanto no externo.
O mercado exige uma produção de mudas de qualidade, associadas às técnicas
que favoreçam a redução de custos e período de produção. Os métodos tradicionais de
produção de mudas, sementes e divisão de touceiras, não satisfazem a demanda para
instalação e renovação de campos da cultura na produção brasileira de gérberas,
(BARBOSA et al., 1993). Essa limitação torna o Brasil dependente da importação das
mudas de empresas multinacionais, o que poderia ser reduzido com lançamento de
novos híbridos competitivos no mercado (CARDOSO et al., 2007) e a propagação a
partir da técnica de cultura de tecidos.
Na cultura de tecidos, a técnica da micropropagação possibilita a clonagem de
plantas sadias, oriundas da limpeza clonal, com características morfológicas e
fisiológicas desejáveis, em menor espaço e tempo, satisfazendo os interesses comerciais
(PAIVA et al., 1995). Além disso, apresenta elevado potencial quando se trata de
práticas de melhoramento vegetal, abrangendo desde a multiplicação à produção de
mudas com alta qualidade e sanidade. Esse processo biotecnológico baseia-se na teoria
da totipotência, capacidade de regeneração de organismos a partir de uma célula.
Os procedimentos de cultura de tecidos são executados em ambientes assépticos,
com temperatura e iluminação controladas, uma vez que para se obter resultados
satisfatórios deve-se estabelecer condições ótimas que propiciem o crescimento e
desenvolvimento das culturas (ASSIS et al.,1998). A micropropagação é a técnica mais
utilizada e que apresenta melhores resultados, quando se trata de cultura de tecidos
vegetais (GRATTAPAGLIA et al., 1998). Compreende diferentes estádios: do
estabelecimento da cultura in vitro ao enraizamento, concluindo com a aclimatação da
planta (BASTOS et al., 2007). Segundo Torres (1998), o êxito de um sistema de
micropropagação depende de uma associação de fatores, desde a composição do meio
nutritivo, à influência de fatores exógenos e endógenos, por isso, a capacidade de
regeneração e crescimento in vitro não está limitada ao genótipo.
4

A contaminação é um dos fatores limitantes, sendo responsável por perdas
significativas durante as etapas do processo de cultivo in vitro. O controle microbiano
durante o processo de estabelecimento in vitro, é essencial. Condições de manuseio
assépticas, e a escolha de uma planta matriz com boa qualidade sanitária reduzem a
contaminação. A principal medida para evitar a proliferação de microrganismos (fungos,
bactérias vírus e leveduras), no cultivo in vitro é a esterilização do meio nutritivo, agua e
vidrarias no autoclave (LONDE et al.,2007; PANICKER et al., 2007). Atualmente, busca-
se descobrir técnicas alternativas para esterilização visando à redução de custos dos
laboratórios de biotecnologia, tornando a micropropagação de plantas mais viável
economicamente.
De acordo com Teixeira (2008), uma opção promissora para diminuir os custos
da prática seria a substituição do controle térmico através da autoclavagem por outras
mais econômicas, ás quais têm sido testadas em diferentes trabalhos, em procedimentos
físicos, como o micro‑ondas (TEIXEIRA et al., 2005), controle químico, com uso do
hipoclorito de sódio (TEIXEIRA et al., 2008) e do peróxido de hidrogênio
(YANAGAWA et al., 1995) e óleos essenciais (OLIVEIRA et al., 2008, DEEIN et al.,
2013);

3-REVISÃO BIBLIOGRAFICA

3.1-Gérbera

A primeira descrição oficial da espécie, Gerbera jamesonii Bolus ex Hook,
também conhecida por Transvaal Daisy ou Barberton Daisy, foi feita por Hooker (1889),
no Curtis Botanical Magazine, é uma espécie originária da Ásia, África do Sul (LUDWIG
et al., 2010) e Tasmânia, pertence à ordem Asterales, família Asteraceae (Compositae),
Tribo Mustisieae, Subtribo Mustisiina. O gênero compreende cerca de 30 espécies,
distribuídas pela África, Madagascar e Ásia tropical, (HANSEN et al.,1985, BARROSO
et al.,1991, Elomaa & Teeri,2001);
Dentre as espécies ornamentais, a gérbera (Gerbera jamesonii) planta herbácea,
de aproximadamente 45 cm de altura, possui caule subterrâneo, um rizoma simpodial,
que emite brotos aéreos foliares e floríferos (CARDOSO et al., 2007). São classificadas
em dois grupos distintos: as gérberas de vaso, que apresentam escapos curtos e são
principalmente propagadas por semente, e as gérberas de corte, com escapos longos
5

resultantes de programas de melhoramento e propagadas principalmente através da
micropropagação (CARDOSO et al., 2008, BHARGAVA et al., 2013)
A propagação da gérbera pode ser sexuada ou assexuada por meio da divisão da
planta adulta ou micropropagação (SOROA et al., 2005). A propagação por sementes é
menos utilizada para a produção de floresde corte, agronegócio que exige maior
investimento de recursos e trabalho, pela probabilidade de se perder características
desejáveis pela segregação genética que resulta na manifestação de uma grande variedade
de características fenotípicas e genotípicas.
Portanto, a propagação vegetativa é mais adequada para manter características das
plantas híbridas (MUNIZ et al., 2010) que constituem as principais cultivares de gérbera.
O método de propagação vegetativa por divisão de touceiras, assim como o de reprodução
sexuada, necessita de mais tempo e não garante ao produtor mudas sadias,
comprometendo a produção, elevando o custo e consequentemente causando prejuízos.
A micropropagação é a técnica mais adequada na propagação de gérbera
(MURASHIGE et al., 1974; BHARGAVA et al., 2013). Estudos sobre a
micropropagação de gérbera têm sido realizados, a fim de estabelecer protocolos e vários
meios de cultura e diferentes explantes são testados como: ápice (HUANG & CHU
,1985), ápices de rizoma (SEVERIN et al.,2000), capítulos jovens e pequenos explantes
(LALIBERTÉ et al., 1985; SEVERIN et al., 2000; CARDOSO et al., 2005), folhas
(JERZY & LUBOMSKI, 1991; REYNOIRD et al., 1993), inflorescência (PIERIK et al.,
1973; PREIL et al., 1977; SEVERIN et al., 2000) e óvulos (MIYOSKI & ASAKURA,
1996; TOSCA et al., 1999).
A gérbera, quando propagadas por sementes, a germinação ocorre entre sete a
quatorze dias após a semeadura. As plântulas devem ser transplantadas quando possuírem
de quatro a cinco folhas. A etapa de crescimento vegetativo se prolonga por dois a três
meses. Aproximadamente no quinto mês após o plantio inicia-se a floração produzindo
de três a seis flores no primeiro ano, já no segundo e terceiro ano a produção se eleva para
seis a dezoito flores por ano (BELLÉ et al., 1998).
O melhoramento de gérbera consiste basicamente nos cruzamentos e seleção e os
genótipos elites que têm sido propagados através da cultura de tecidos (NARAJU et al.,
1998). Os programas de melhoramento buscam aperfeiçoar os atributos qualitativos:
coloração de flores, longevidade, forma e arquitetura da planta, resistência a pragas e
doenças, entre outas características exigidas pelo consumidor.
6

Sendo uma cultura perene, o cultivo de gérberas pode durar vários anos, mas
comercialmente a produção de flores diminui a partir do terceiro ano. Em consequência
disso, as plantas são cultivadas comercialmente apenas por dois ou três anos
(PENNINGSFELD & FORCHTHAMMER, 1980).
De acordo com Jaspe (2009), a gérbera se destaca mundialmente tanto como flor
de vaso como de corte. Porém o domínio do comércio internacional é compreendido pelas
flores de corte, sendo produzida principalmente na Holanda, Alemanha, França, Itália,
Israel, Colômbia e Estados Unidos. No Brasil é a 4ª flor de corte produzida JUNQUEIRA
e PEETZ, (2005), o cultivo em vaso é pouco executado (LUDWIG et al., 2010b).

3.2- Cultura de tecidos

A cultura de tecidos vegetais apresenta os melhores resultados na área da
biotecnologia (SILVA et al., 2014); baseia-se no princípio da totipotência celular,
capacidade de regeneração do organismo completo a partir de uma célula.
A micropropagação, uma das técnicas mais utilizadas na cultura de tecidos, é
definida por Santos et al (2003), como o conjunto de técnicas de cultura de tecidos
utilizadas para a multiplicação de plantas a partir de pequenos explantes. Essa pratica de
propagação clonal possibilita a produção de um número maior de plantas, em um espaço
físico e temporal reduzido. As plantas resultantes serão geneticamente idênticas a planta
matriz, doadora do explante. Sendo assim, a micropropagação mantém a identidade
genética do material propagado (CÂMERA, 2009)
Ribeiro (2016), aborda que as técnicas de cultura in vitro se torna possível à
propagação de espécies e/ou variedades de interesse, de forma rápida, sendo ainda um
meio para auxiliar na eliminação de patógenos, resultando em plantas sadias, de qualidade
genética e sanitária. Entretanto na execução da micropropagação se faz necessário
otimizar as condições de cultura para cada espécie e /ou variedade (ROGALSKI et al.,
2003).
A finalidade inicial da técnica de micropropagação é conduzir o crescimento e o
desenvolvimento do explante manipulado, para se obter resultados significativos utiliza-
se normalmente a adição de substancias no meio de cultivo, principalmente reguladores
de crescimento, ou ainda o uso de nutrientes, assim também como controle da temperatura
e iluminação (CARVALHO; MOREIRA; VIEIRA et al., 1999). Segundo Cid (2001),
para o explante crescer in vitro, é fundamental, que se forneça condições que favoreçam
7

o seu desenvolvimento, assim se faz necessário que seja disponibilizado nutrientes, por
isso, ele é inoculado em um meio de cultura contendo água e sais.
O meio de cultivo mais utilizado na micropropagação é o MS (MURASHIGE &
SKOOG, 1962), que é constituído de macro nutrientes, micronutrientes, componentes
orgânicos (sacarose e inositol) e vitaminas. A depender da necessidade da espécie, é
definida a concentração dos constituintes do meio nutritivo, podendo ainda ser
introduzido reguladores vegetais de crescimento. O ágar-ágar (polissacarídeo produzido
por algas –Gelidium amansii, é o agente solidificante do meio mais utilizado (CID, 2001).
De acordo com Barbosa (1993), a pratica da cultura de tecido tem sido crescente para a
gérbera, por se tratar de uma alternativa viável para sua propagação assexuada.

3.3 Contaminação na micropropagação

O cultivo de plantas in vitro depende da execução de procedimentos que requerem
tempo e elevam os custos das mudas produzidas por micropropagação (CARDOSO et al.;
2009) e dentre eles está o controle de microrganismos. A contaminação microbiana é
responsável por perdas severas em biofábricas e laboratórios de pesquisa (Dantas et al.,
2002, Donato et al., 2005).
A contaminação ocorre principalmente pela presença de microrganismos
epifíticos, oportunistas ou patogênicos, que podem penetrar nos tecidos ou estarem
presentes na superfície do explante. Eles se desenvolvem no meio de cultura que
apresenta desinfestação ineficiente, ou ainda, pela entrada de microrganismos após o
estabelecimento da planta devido ao manuseio incorreto durante as subculturas (Londe et
al. 2007, Panicker et al. 2007).
A inibição de agentes contaminantes na fase de estabelecimento in vitro é
importante, pois nesta fase os danos ainda são pequenos, devido ao menor volume de
explantes que estão sendo multiplicados, evitando assim que esses microrganismos
passem para as etapas seguintes (MONTARROYOS, 2000). Fungos filamentosos,
bactérias e leveduras são os contaminantes mais frequentes no cultivo in vitro. A
diferença básica entre esses contaminantes está no fato de que a ocorrência de fungos e
leveduras é facilmente percebida no meio de cultura, após poucos dias de cultivo,
facilitando a eliminação do material contaminado (LEIFERT; WOODWARD, 1998). As
bactérias, por serem muitas vezes de difícil visualização, nem sempre sua presença é
8

evidenciada no início do cultivo, sendo sua disseminação facilitada entre materiais
durante as etapas da multiplicação (MONTARROYOS, 2000).
A determinação exata da fonte de contaminação, muitas vezes é difícil, uma vez
que os contaminantes podem ser introduzidos em várias etapas no processo de
micropropagação. Porém, existem formas de prevenir o aparecimento de contaminações
e algumas técnicas podem ser adotadas, dentre elas a autoclavagem que é um
procedimento que utiliza altas temperaturas (121°C) e pressão (1 kgf cm-²) para
eliminação de microrganismos no meio de cultura e no recipiente de cultivo das plantas
(TORRES et al., 1998). Entretanto, Ribeiro et al (2009) aborda que esse método de
controle além de aumentar os custos de produção dasmudas micropropagadas devido ao
elevado consumo de energia das autoclaves, também diminui o rendimento de produção
de meios de cultura no laboratório. Por isso, a substituição do método tradicional
(térmico), no controle de contaminação nas técnicas de propagação in vitro, tem sido
pesquisada e a esterilização química com o uso de hipoclorito de sódio com variação de
concentrações e tempo, tem sido uma alternativa viável e eficiente. (PASSOS et al., 2004;
TEIXEIRA et al., 2005a, 2005b). Assim também o uso de antibióticos como a cefalexina
(REIS; COSTA; LAMEIRA, 2003), peróxido de hidrogênio (YANAGAWA et al., 1995),
óleos essenciais (NASCIMENTO et al., 2006) e micro-ondas tem sido relatadas.
O hipoclorito de sódio (NaClO), produto químico com cloro ativo, muito utilizado
para esterilização devido ao seu vasto espectro de atividade biocida contra bactérias e
fungos, é um produto de fácil aquisição e baixo custo (ESTRELA et al., 2002). Buscando
uma forma alternativa para a esterilização de meios nutritivos em micropropagação,
Teixeira et al. (2005a; b; c; 2006; 2008) e Ribeiro & Teixeira (2007) desenvolveram um
protocolo de preparo de meio de cultura utilizando o hipoclorito de sódio em baixas
concentrações com eficiência total.
Por outro lado, os óleos essenciais, são outra opção de esterilização que vem se
destacando. Originados do metabolismo secundário das plantas, possuem composição
química complexa, destacando-se a presença de terpenos e fenilpropanóides, constituem
elementos voláteis contidos em muitos órgãos vegetais e estão relacionados com diversas
funções necessárias à sobrevivência (SIANI et al., 2000).
Segundo Kelsey (1984), as plantas sintetizam e emitem inúmeros compostos
voláteis com a finalidade de defenderem-se ou de atrair os polinizadores. Por isso, os
óleos essenciais são considerados fontes em potencial de substâncias biologicamente
ativas, principalmente contra microrganismos, como bactérias, fungos filamentosos e
9

leveduras. Todavia, se faz necessário, adotar uma metodologia, adequada e bem
padronizada para se obter sucesso no procedimento, uma vez que os OEs apresentam
algumas características que interferem significativamente nos resultados, como:
volatilidade, insolubilidade a agua e complexidade (NASCIMENTO et al., 2006).
Em relação a esterilização no micro-ondas Teixeira (2005) relata que a
esterilização pelo é eficiente quando as vidrarias e o meio são expostos a potencias
elevadas sem intervalo de tempo. A alternativa de preparar o meio de cultura com água
quimicamente tratada com hipoclorito de sódio torna mais eficiente a esterilização no
micro-ondas.
Os métodos alternativos têm obtido êxito na desinfestação do meio nutritivo,
entretanto, em algumas espécies, têm causado problemas de fitotoxicidade, em geral pelos
produtos químicos utilizados na esterilização ou por dificuldades no uso dessas técnicas
(Pais, 2016).

4-REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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CAPITULO I

Volatilização do cloro presente no meio de cultura esterilizado
com hipoclorito de sódio na micropropagação de Gérbera hibrida cv.
Essandre

RESUMO

Na gérbera a sensibilidade ao cloro pode resultar na seca das folhas iniciais do explante
em meio esterilizado com hipoclorito de sódio. Este trabalho teve como objetivo avaliar
a toxidez inicial no explante em função do tempo decorrido para fechamento dos frascos
de cultura e a inoculação, bem como acompanhar a desenvolvimento das plantas
micropropagadas no período de aclimatização. O experimento foi realizado em duas
etapas sendo a primeira referente aos tratamentos in vitro e a segunda, a aclimatização
das mudas obtidas nos tratamentos. Utilizou-se tratamento controle autoclavado e os
tratamentos com esterilização química com fechamento imediato dos frascos de cultura e
fechamento após 10 minutos da distribuição do meio. Em relaçãoà inoculação do
explante adotaram-se três intervalos de tempo: 24, 48 e 72 horas. O transplantío e
aclimatização das plântulas foi realizado após 30 dias da aplicação dos respectivos
tratamentos, em que se efetuou a transferência das mesmas, que até então estavam em
condição in vitro, para casa de vegetação Na esterilização química com NaClO a espera
10 minutos para vedação não influenciou na toxidez das plantas em relação as obtidas
com vedação imediata dos frascos. O desenvolvimento das plantas foi melhor quando a
inoculação do explante ocorreu 24 horas após o preparo do meio. A toxidez do cloro
durante o estabelecimento da cultura in vitro, não influenciou no desenvolvimento da
Gérbera hibrida cv. Essandre durante a aclimatização.

PALAVRAS CHAVES
Fitotoxidez; Cloro ativo; Regeneração

1- INTRODUÇÃO

A busca por métodos menos onerosos para controle de contaminação na prática
da cultura de tecidos torna-se crescente, uma vez que o método comumente utilizado, a
esterilização térmica, apresenta elevado gasto de energia, demanda tempo maior na sua
execução e pode alterar os constituintes do meio, devido à elevada temperatura a qual é
submetido. A substituição deste método pela esterilização química tem sido proposta,
16

sendo o hipoclorito de sódio (NaClO) uma alternativa viável devido à facilidade de
aquisição e baixo custo.
A esterilização química com hipoclorito de sódio (NaClO), proposta por Teixeira
(2005 a,b), na micropropagação do abacaxi (Ananas comosus L. cv Smooth Cayenne) foi
eficiente na esterilização do meio e proporcionou melhor desenvolvimento das plantas.
Resultado semelhante foi obtido na micropropagação de sequoia (Sequoia sempervirens
L.) (Ribeiro et al. 2011) e eucalipto (Eucalyptus pellita L. e Eucalyptus benthamii Maiden
& Cambage, Brondani et al. 2013). O mecanismo de ação do cloro ativo não é bem
conhecido, embora algumas hipóteses sugiram que há uma combinação com proteínas da
membrana celular dos microrganismos, assim formando compostos tóxicos e levando à
inibição das enzimas essenciais. O cloro também pode ser aplicado sob as formas de
hipoclorito de cálcio e hipoclorito de sódio, os quais, em contato com a água, se ionizam.
O cloro presente na água sob as formas de ácido hipocloroso e de íon hipoclorito é
definido como cloro residual livre (OPAS et al., 1987; Rossin et al., 1987).
Contudo, apesar de sua eficiência no controle da contaminação microbiana, o uso
do hipoclorito de sódio e demais sais de cloro, são precursores formação de cloraminas
orgânicas, estas prejudiciais à saúde devido ao seu alto potencial carcinogênico
(SREBERNICH et al., 2007). Quando existem, na água, amônia e compostos amoniacais,
com a adição de cloro são formados estes compostos clorados ativos, (cloro residual
combinado).
Segundo Donini (2005), em condições in vitro deve-se utilizar uma solução de
NaClO com a menor concentração possível de cloro ativo, evitando os danos ao tecido
do explante. A sensibilidade da gérbera ao cloro pode resultar numa toxidez inicial nos
explantes inoculados em meio esterilizado com hipoclorito de sódio que se manifesta
como a seca das folhas no explante inoculado, havendo, posteriormente a rápida
regeneração do explante. Esta toxidez pode ser consequência de cloro residual no frasco
de cultura.

2- OBJETIVO

Avaliar a toxidez inicial do explante de gérbera na esterilização química com
hipoclorito de sódio em função do tempo decorrido para fechamento dos frascos de
cultura e a inoculação.

2.1- OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Observar o efeito da toxidez do hipoclorito de sódio nos explantes;
 Analisar a relação do tempo com a toxidez do cloro ativo presente no meio
nutritivo;
 Acompanhar desenvolvimento das plantas no processo de aclimatização;

3- MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi realizado no Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais
(DTCS) da Universidade do Estado da Bahia- UNEB, em Juazeiro –BA, em duas etapas
sendo a primeira referente aos tratamentos in vitro e a segunda, a aclimatização das mudas
obtidas nos tratamentos.
Na primeira etapa utilizou-se tratamento controle autoclavado e os tratamentos
com esterilização química com fechamento imediato dos frascos de cultura e fechamento
após 10 minutos da distribuição do meio. Em relação à inoculação do explante adotaram-
se três intervalos de tempo: 24, 48 e 72 horas (Tabela 1).

Tabela 1- Descrição dos tratamentos
Método de Tempo para vedação Tempo para
Esterilização Do frasco de cultura inoculação dos
explantes
Térmico Imediato
Químico 10 Minutos 24 horas
Químico Imediato
Térmico Imediato
Químico 10 Minutos 48 horas
Químico Imediato
Térmico Imediato
Químico 10 Minutos 72 horas
Químico Imediato

No controle com esterilização térmica, as vidrarias e a água foram autoclavados a
temperatura ± 121ºC e pressão de 1 kgf cm-2 por 40 minutos, enquanto o meio nutritivo
foi submetido as mesmas condições pressão e temperatura por 20 minutos. Nos
tratamentos com esterilização quimica as vidrarias foram lavados com detergente,
18

enxaguados com água destilada e imersos em recipiente com agua destilada contendo
0,003% de cloro ativo que corresponde à 1,5 mL de hipoclorito de sódio por litro. Na
água destilada deionizada, utilizada no prparo do meio de cultura foi acrescentado a
concentração de 0,0005% de cloro ativo NaClO (250 µL/ l).
O meio nutritivo foi constituído dos sais inorgânicos de MS (MURASHIGE e
SKOOG, 1962), vitaminas de White (WHITE, 1943), 100 mg L-1 de i-inositol, 30 g L-1
de sacarose, e 10 g L -1 de ágar como agente de solidificação do meio. O pH do controle,
autoclavado foi ajustado para 5,7 ± 1, nos tratamento esterilizados quimicamente aferiu-
se o pH em 6,0 ± 1, após 15 minutos da adição de 0,003 % NaClO no meio. Vale ressaltar
que toda metodologia dos controles químicos foi baseada no Protocolo de Esterilização
Química de Meios Nutritivos para Cultivo in vitro de Teixeira (2008).
Após preparado, 20 mL do meio de cultura foi distribuído em recipientes de vidro
com volume de 250 mL. Nos tratamentos em que o fechamento dos frascos ocorreu opôs
10 minutos, os mesmos permaneceram abertos na câmera de fluxo laminar por 10 minutos
para favorecer a volatização do cloro. A inoculação foi dividida em três etapas levando
em consideração o tempo, foram inoculados explantes no período de 24, 48 e 72 horas
após o preparo do meio nutritivo. Buscou-se selecionar explantes com tamanho e número
de folhas uniformes. Depois de inoculados, o material foi disposto em condições
favoráveis para seu desenvolvimento em temperatura de 26 + 1 0C, fotoperíodo de 16
horas e irradiância de 19 mol.m-2.s-1.
Após 35 dias realizou-se a avaliação do comprimento da parte aérea (Comp-PA)
e raízes (Comp–Rz), número de folhas (NºFlh), número de folhas secas (NºFS) e
produção de biomassa fresca (PBF). Utilizou-se o delineamento inteiramente
casualizado com quatro repetições constituídas de um explante por frasco. Os dados
obtidos foram submetidos à análise de variância e quando significativos (P<0,05), as
médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, utilizou-se o
software desenvolvido pela Universidade Federal de Pelotas WinStat.
Na segunda etapa do experimento ocorreu a aclimatização das mudas, em que as
Plântulas de Gerbera jamesonii estabelecidas em condições in vitro foram transferidas
para copos plásticos contendo o substrato comercial Tropstrat®. As plantas foram
retiradas do meio de cultura e seu sistema radicular lavado em água destilada.
Após a transferência, cada recipiente foi coberto com copos plásticos para a manutenção
da umidade, sendo retirados após sete dias, as plantas foram levadas para casa de
vegetação com sombrite 75%.
19

O transplantíoe aclimatização das plântulas foi realizado após 30 dias da
aplicação dos respectivos tratamentos, em que se efetuou a transferência das mesmas, que
até então estavam em condição in vitro, para casa de vegetação. Seguindo o critério
anterior dos tratamentos: nove tratamentos com quatro repetições, totalizando 36
amostras experimentais, oi utilizado o delineamento experimental inteiramente
casualizado.
Depois de um período de 30 dias as plantas foram retiradas da casa de vegetação
para avaliação das seguintes variáveis: comprimento da parte aérea (Comp-PA) e raízes
(Comp–Rz), número de folhas (NºFlh), número de folhas secas (NºFS), clorofila A (Clor
A), clorofila B (Clor B), clorofila total (Clor total) e produção de biomassa fresca (PBF).
Os dados adquiridos foram submetidos à análise de variância e quando significativos
(P<0,05), as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, utilizou-se
o software WinStat.

4-RESULTADOS E
DISCUSSÃO
a
Fig1- Procedimento das
atividades, (a ;b)-
Inoculação dos explantes
e vedação do recipiente,
(c;d)- Transplantio, (e;f)-
Aclimatização, (g;h) –
Coleta de dados, clorofila
( A e B ) e comprimento
da raiz.
Figura 1
20
a b c
d e f
g h

4- RESULTADO E DISCURSSÃO
4.1- Enraizamento in vitro nos tratamentos com esterilização química e controle som
esterilização térmica

O número de folhas nos explantes que foram inoculados com 24, 48 e 72 horas
em meio esterilizado com hipoclorito de sódio foi inferior ao produzido pelos explantes
inoculados no meio com esterilização térmica (Tabela 1,2 e 3). O número mais reduzido
de folhas nos explantes em meio com esterilização química ocorreu porque houve seca
das folhas iniciais em todos os tratamentos e isso não ocorreu na esterilização térmica
(Figura 1).
Nesta variável não houve diferença significativa nos tratamentos com
esterilização química em relação ao fechamento imediato dos frascos ou após 10 minutos
da distribuição do meio.

Tabela.2- Desenvolvimento das plantas inoculadas no meio de cultura esterilizados
termicamente e quimicamente com NaClO, com diferentes tempos para vedação do
recipiente. Acesso 1- Inoculação dos explantes em 24 horas.

Número de folhas (NºFlhs), comprimento médio da parte aérea (CMPA), comprimento médio da raiz (CMR), peso da
biomassa fresca (PBF) de Gérbera cv. Essandre, submetidas a diferentes controles de esterilização. ¹ Médias seguidas
por letras iguais, na mesma coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade; ²Coeficiente de
variação.

Tabela.3 Desenvolvimento das plantas inoculadas no meio de cultura esterilizados
termicamente e quimicamente com NaClO, com diferentes tempos para vedação do
recipiente. Acesso 2- Inoculação dos explantes em 48 horas.
Número de folhas (NºFlhs), comprimento médio da parte aérea (CMPA), comprimento médio da raiz (CMR), peso da
biomassa fresca (PBF) de Gérbera cv. Essandre, submetidas a diferentes controles de esterilização. ¹ Médias seguidas
Tempo para
Esterilização inoculação Nº flhs CMPA CMR PBF
cultura dos explantes
Térmico Imediato 8,25a 3,93a 4,03a 0,56a
Químico 10 Minutos 24 Horas 5,50b 3,22a 3,10a 0,53a
Químico Imediato 4,50b 2,83b 3,43a 0,42a
²CV% 11,94 21,62 23,71 29,21
Tempo de vedação Variáveis
do frasco de
Tempo para
Esterilização inoculação Nº flhs CMPA CMR PBF
cultura dos explantes
Térmico Imediato 8,00a 3,82a 5,48a 0,78a
Químico 10 Minutos 48 Horas 3,75b 2,35b 1,63b 0,36b
Químico Imediato 4,25b 2,73b 2,45b 0,35b
²CV% 22,96 18,48 20,01 25,95
Tempo de vedação Variáveis
do frasco de
21

por letras iguais, na mesma coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade; ²Coeficiente de
variação.

Tabela.4 Desenvolvimento das plantas inoculadas no meio de cultura esterilizados
termicamente e quimicamente com NaClO, com diferentes tempos para vedação do
recipiente. Acesso 3- Inoculação dos explantes em 72 horas

Em relação ao comprimento da parte aérea, comprimento da raiz e biomassa
fresca, os explantes inoculados após 24 horas do preparo do meio esterilizado com NaClO
não diferiram significativamente do tratamento controle autoclavado. Isso se deu devido
á capacidade de recuperação dos explantes no meio esterilizado quimicamente. Após o
terceiro dia de inoculação o explante apresentou os primeiros sinais de seca, no quinto
dia estavam totalmente secos, entretanto, a planta se regenerou, desenvolveu-se,
acompanhado o crescimento das plantas do controle térmico, que não sofreram nenhum
tipo de estresse (Figura 2).

Tempo para
Esterilização inoculação Nº flhs CMPA CMR PBF
cultura dos explantes
Térmico Imediato 9,00a 3,33a 4,35a 0,70a
Químico 10 Minutos 72Horas 5,00b 2,88ab 2,98a 0,39b
Químico Imediato 6,00b 2,33b 3,35a 0,34b
²CV% 20,00 15,75 23,15 16,90
Tempo de vedação Variáveis
do frasco de
a
Fig.2- Seca inicial dos explantes esterilizado
com hipoclorito de sódio, (a)Tratamento
químico com fechamento do frasco com
espera de 10 minutos e inoculação do
explante com 24 horas, (b) Tratamento
químico com fechamento imediato do frasco
e inoculação do explante com 24 horas.
a
a b
22

Fig.2

Todavia, os explantes inoculados com 48 e 72 horas após o preparo do meio não
tiveram o mesmo desenvolvimento. Topoonyanont & Debergh (2000), observou que as
brotações axiais não têm a mesma resposta nos subcultivos que brotações principais.Pais
(2016) no experimento com esterilização química com NaClO em gérbera, inoculou os
explantes após 48 horas do preparo do meio e observou que a resposta dos explantes na
esterilização química não diferiu significativamente do controle autoclavado em todas as
variáveis analisadas.
O tempo de espera para fechamento dos frascos, de forma semelhante ao
observado na variável número de folhas, também não influenciou no comprimento da
parte aérea, comprimento da raiz e biomassa fresca. Dessa forma, constatou-se que a
espera ou não de 10 minutos após a distribuição do meio de cultura não interferiu no
desenvolvimento da planta. Pais (2016), relata a necessidade da espera de 10 minutos,
antes da vedação do frasco para volatilização do cloro, reduzindo assim o efeito tóxico
nas plantas. Contudo, no presente trabalho, o tempo de espera não interferiu na toxidade
do NaClO nos explantes, uma vez que, os após três dias de inoculados todos sofreram os
mesmos danos, entretanto, se recuperaram rapidamente.
Ribeiro (2011), na esterilização química com NaClO do meio de micropropagação
de Sequoia sempervirens, observou que os brotos formados nos tratamentos esterilizados
quimicamente apresentaram menores comprimentos médios quando comparados com
aqueles cultivados no meio autoclavado, mas foram produzidos em maior número médio,
equilibrando a relação entre estas variáveis na etapa de multiplicação. Esse fator foi
Fig.2-Recuperação das plantas esterilizadas
quimicamente (T2 e T3) comparadas ás
inoculadas em meio autoclavado (T1). (a)
plantas inoculadas após24 horas após preparo
do meio, (b) plantas inoculadas após 48 horas
após preparo do meio, (c) plantas inoculadas
após 72 horas após preparo do meio
a b
c
23

explicado pela relação antagônica existente entre estes dois parâmetros, ou seja, sempre
que o número de ramos aumenta o comprimento deles diminui, e vice-versa, já que a
biomassa total produzidaestará em função da quantidade de nutrientes disponível no
ambiente limitado do frasco de cultura.
Os dados obtidos neste trabalho corroboram com resultados de autores, que
comprovam a eficiência do NaClO, como alternativa de esterilização da agua, vidraria e
meio MS para as práticas de micropropagação de diferentes espécies (BRONDANI et al.,
2013; WEBER et al., 2015). Cardoso (2009), concluiu que o uso da esterilização química
é uma alternativa adequada ao sistema de autoclavagem, sendo que o cloro pode ser
empregado para o processo de esterilização com eficiência semelhante à da
autoclavagem. Pais (2016), afirma que a esterilização química pode substituir a
esterilização térmica de meios nutritivos para o enraizamento de gérbera in vitro.

4.2- Aclimatização das plantas obtidas nos tratamentos.

No desenvolvimento das plantas obtidas nos tratamentos in vitro, 30 dias após o
início da aclimatização observou-se que apenas em um tratamento com esterilização
química com explante inoculado após 24 horas, as plantas tiveram número de folhas
inferior às obtidas no tratamento com esterilização térmica (Tabela 2). Em todos os outros
tratamentos com esterilização química houve a recuperação das plantas que se igualaram
as obtidas no tratamento controle autoclavado. O comprimento da parte aérea não mostrou
diferença significativa em nenhuma das plantas dos tratamentos com esterilização
química em relação ás plantas do controle autoclavado. Entretanto nos tratamentos
referente às plantas introduzidas ao meio no intervalo de tempo de 48 horas após a
aclimatização, apresentou diferença significativa na variável comprimento da raiz que foi
inferior a todos os outros tratamentos.
Em relação a clorofila A, B e Total não houve diferença significativa entre as
plantas obtidas no tratamento controle autoclavado e na esterilização química com
inoculação após 24 horas. Nos demais tratamentos com esterilização química o teor das
clorofilas foram inferiores ao controle autoclavado. Castro (2002), aborda que o teor de
clorofila está inteiramente ligado a capacidade fotossintética da planta em geral com uma
equivalência de 3:1, clorofila A e B respectivamente. Os dados das Tabelas 4, 5 e 6
mostram que nos tratamentos com esterilização química com e sem a espera dos 10 min
24

para volatilização do cloro as plantas apresentaram desenvolvimento similar conforme
mostra a figura 3.
Os resultados corroboram com os obtidos por Oliveira (2015), na aclimatização
de mudas abacaxi (Ananas comosus) oriundas da esterilização química com NaClO, que
não apresentaram danos durante a aclimatização.
25

Tabela.5 – Desenvolvimento das mudas de gérberas cv. Essandre 30 dias após o início da aclimatização em seus respectivos tratamentos. Acesso 1- Inoculação
do explantes em 24 horas.
Número de folhas (NºFlhs), comprimento da parte aérea (C-PA), comprimento da raiz (C-Rz), clorofila A (CLOR A), clorofila B (CLOR B), clorofila total (CLOR TOTAL) de Gérbera hibrida
cv essandre, submetidas a diferentes controles de esterilização, com inoculação após 24 horas da preparação do meio MS e seu desenvolvimento pós-transplantío e aclimatização. ¹ Médias seguidas
por letras iguais, na mesma coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade; ²Coeficiente de variação.

Tabela.6 – Desenvolvimento das mudas de gérberas cv. Essandre 30 dias após o início da aclimatização em seus respectivos tratamentos. Acesso 2- Inoculação
do explantes em 48 horas.

TEMPO PARA VEDAÇÃO
TEMPO PARA

VARIÁVEIS
ESTERILIZAÇÃO
DO FRASCO DE
INOCULAÇÃO DOS Nº flhs CMPA CMR CLOR A CLOR B
CLOR
TOTAL
CULTURA EXPLANTES
TÉRMICO IMEDIATO 8,50a 6,67a 11,45a 30,04a 10,20a 40,60a
QUÍMICO 10 MINUTOS 48 HORAS 6,50a 6,27 9,27ab 21,97b 4,35b 26,32b
QUÍMICO IMEDIATO 6,75a 5,5a 8,42b 18,35b 6,00 a 24,35b
²CV% 20,9 19,61 12,01 20,65 20,65 16,17
Número de folhas (NºFlhs), comprimento da parte aérea (C-PA), comprimento da raiz (C-Rz), clorofila A (CLOR A), clorofila B (CLOR B), clorofila total (CLOR TOTAL) de Gérbera hibrida
cv essandre, submetidas a diferentes controles de esterilização, com inoculação após 24 horas da preparação do meio MS e seu desenvolvimento pós-transplantío e aclimatização. ¹ Médias seguidas
por letras iguais, na mesma coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade; ²Coeficiente de variação.

TEMPO PARA VEDAÇÃO
TEMPO PARA

VARIÁVEIS
ESTERILIZAÇÃO
DO FRASCO DE
INOCULAÇÃO DOS Nº flhs CMPA CMR CLOR A CLOR B
CLOR
TOTAL
CULTURA EXPLANTES
TÉRMICO IMEDIATO 8,75a 5,82a 11,12a 24,77a 7,40a 32,17a
QUÍMICO 10 MINUTOS 24 HORAS 7,00a 6,17a 8,50a 27,00a 5,50a 32,50a
QUÍMICO IMEDIATO 6,25b 5,62a 11,12a 28,77a 9,47a 38,25a
²CV% 12,48 13,50 20,96 22,8 27,21 22,22
24
26

Tabela.7– Desenvolvimento das mudas de gérberas cv. Essandre 30 dias após o início da aclimatização em seus respectivos tratamentos. Acesso 3- Inoculação
do explantes em 72 horas.
Número de folhas (NºFlhs), comprimento da parte aérea (C-PA), comprimento da raiz (C-Rz), clorofila A (CLOR A), clorofila B (CLOR B), clorofila total (CLOR TOTAL) de Gérbera hibrida
cv essandre, submetidas a diferentes controles de esterilização, com inoculação após 24 horas da preparação do meio MS e seu desenvolvimento pós-transplantío e aclimatização. ¹ Médias seguidas
por letras iguais, na mesma coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade; ²Coeficiente de variação.

TEMPO PARA VEDAÇÃO
TEMPO PARA

VARIÁVEIS
ESTERILIZAÇÃO
DO FRASCO DE
INOCULAÇÃO DOS Nº flhs CMPA CMR CLOR A CLOR B
CLOR
TOTAL
CULTURA EXPLANTES
TÉRMICO IMEDIATO 8,50a 5,12a 8,30a 21,80a 8,42a 30,22a
QUÍMICO 10 MINUTOS 72 HORAS 6,75a 4,52a 7,20a 21,80a 3,53b 29,95a
QUÍMICO IMEDIATO 6,50a 5,60a 7,20a 24,60a 7,10b 27.27a
²CV% 21,06 26,53 26,53 14,78 15,56 13,13
a b c
Fig.3 - Características visuais similares das plantas submetidas ao controle térmico e obtidas no meio com esterilização química, (a) inoculação após 24
horas, (b) inoculação após 48 horas, (c) inoculação após 72 horas.
27

5- CONCLUSÕES

 Na esterilização química a espera 10 minutos para vedação do frasco com o meio
nutritivo, esterilizado com NaClO não reduziu a toxidez inicial no explante e não
influenciou no desenvolvimento das plantas em relação as obtidas com vedação
imediata dos frascos, obtendo melhores resultados quando a inoculação do
explante ocorreu 24 horas após o preparo do meio. Entretanto a toxidez do cloro
durante o estabelecimento da cultura in vitro, não influenciou no desenvolvimento
da Gérbera hibrida cv. Essandre durante a aclimatização.

6- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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benthamii Maiden & Cambage x Eucalyptus dunnii Maiden. Revista Árvore, v. 33, n. 1,
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BRONDANI G.E.; OLIVEIRA L.S.; BERGONCI T.; BRONDANI A.E.; FRANÇA
F.A.M.; SILVA, A.L.L.; GONÇALVES A.N.2013) Chemical sterilization of culture
médium: a low cost alternative to in vitro establishment of plants. Scientia Forestales,
Piracicaba, v. 98, n. 14, p. 257-267, 2013.

CARDOSO, J.C. Esterilização química de meio de cultura no cultivo in vitro de antúrio.
Pesquisa agropecuária brasileira, v. 44, p. 785-788, 2009.

DONINI, L.P. Preparo de lâminas foliares de aráceas ornamentais: desinfestação
com diferentes concentrações de hipoclorito de sódio. Arquivos do Instituto Biológico,
v. 72, n. 4, p. 517-522, 2005.MURASHIGE, T. & SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with
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v. 15, p. 1995-1998, 2016.
TEIXEIRA, S.L.; CAMPANATI M.; TEIXEIRA M.T.; ALMEIDA, R.F. Esterilização
de meios nutritivos para cultura de tecidos vegetais, pela combinação de esterilizantes
químicos e forno de microondas. Revista Ceres, v. 52: p. 343-349, 2005.

Fig.3
c c
25
28

TEIXEIRA, S.L.; SOUSA, R.T.S.; TEIXEIRA, M.T. Esterilização de meios nutritivos
para cultura de tecidos vegetais em forno de microondas. Revista Ceres, v. 52, n. 302, p.
499-507, 2005
TEIXEIRA, S.L.; SOUSA, R.T.S.; TEIXEIRA, M.T. Esterilização de meios nutritivos
para cultura de tecidos vegetais em forno de microondas. Revista Ceres, v. 52, p. 499-
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TEIXEIRA S.L.; RIBEIRO J.M.; TEIXEIRA M.T. Influence of NaClO on nutrient
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TEIXEIRA, S.L.; RIBEIRO, J.M.; TEIXEIRA, M.T. Utilização de hipoclorito de sódio
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Florestal, v. 21, p. 77-82, 2011.

RIBEIRO, J.M.; TEIXEIRA, S.L.; BASTOS, D.C. Cultivo in vitro de Sequoia
sempervirens L. em meio de nutritivo esterilizado com hipoclorito de sódio. Ciência
Florestal, v. 21, n. 1, p. 77-82, 2011.

ROSSIN, A.C. Desinfecção. In: Técnica de Abastecimento e Tratamento de Água
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SREBERNICH, S.M. Utilização do dióxido de cloro e do ácido peracético como
substitutos do hipoclorito de sódio na sanitização do cheiro-verde minimamente
processado. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v. 27, n. 4, p. 744-750, 2007.

TOPOONYANONT, N.; DEBERGH, P.C. Reducing bushiness in micropropagated
Gerbera. Plant cell, tissue and organ culture, v. 67, n. 2, p. 133-144, 2001.
WEBER, B.N.; WITHERELL, R.A.; CHARKOWSKI, A.O. Low-Cost potato tissue
culture with microwave and bleach media preparation and sterilization. The Potato
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WHITE, P. R. A handbook of plant tissue culture. Lancaster:Costel, 273p, 1943.

26
29

CAPITULO II

Fontes de contaminação em cultura de tecidos na esterilização química
e térmica

28 30

RESUMO

O presente trabalho baseou-se nos protocolos de controle térmico e esterilização química
com uso de hipoclorito de sódio, em que foram realizadas adaptações afim de determinar
as fontes de contaminação no controle térmico autoclavado e tratamento químico com
hipoclorito de sódio (NaClO). Os tratamentos corresponderam a esterilização na água,
vidrarias e meio, alternando os procedimentos, com objtivo de identificar as fontes
contaminantes do cultivo in vitro. O meio esterilizado quimicamente com NaClO e
termicamente apresentaram respostas positivas na inibição da ação de microrganismos.
O mesmo ocorreu com as vidrarias e água esterilizadas com NaClO, sem necessidade de
adição do cloro ativo no meio. Quando não se esterilizou o meio no autoclave ocorreu
100% de contaminação. As plantas inoculadas no meio onde a esterilização química
ocorreu apenas nas vidrarias e água foi similar ao das plantas no meio esterilizado em
autoclave (meio, agua e vidraria).

PALAVRAS CHAVES
Cultura de tecidos; Assepsia; Concentração mínima inibitória.

1- INTRODUÇÃO

A cultura de tecidos é a área da biotecnologia que compreende vários métodos de
propagação vegetal em laboratório, amplamente utilizada como ferramenta de estudo do
metabolismo, fisiologia, desenvolvimento e reprodução de plantas com propriedades
desejáveis, tais como resistência a pragas e acúmulo de substâncias ativas de interesse
comercial (LAKSHMANAN et al., 2005).
Além dos aspectos do melhoramento genético de plantas, a cultura de tecidos tem
sido aplicada na micropropagação, que tem como principal objetivo a aceleração dos
métodos convencionais de propagação vegetativa (DONATO et al., 2005, LIMA &
MORAES 2006, XIÃO et al., 2011).
A contaminação microbiana é o fator determinante para o êxito ou não desta
prática, sendo responsável por perdas significativas em biofábricas e laboratórios de
pesquisa (DANTAS et al., 2002, DONATO et al., 2005). O estudo das contaminações
microbianas na cultura de tecidos atende uma forte demanda relacionada aos processos
de boas práticas de laboratório e contribui para preencher algumas lacunas encontradas
na área de biotecnologia vegetal referente aos problemas de contaminação in vitro
(SCHERWINSKI & PEREIRA, 2010)
Na literatura é possível ter acesso a vários protocolos de esterilização com a
finalidade de reduzir a incidência de contaminação microbiana, seja com o método de
29 31

esterilização térmica - autoclave ou métodos alternativos como método de micro-ondas,
uso de hipoclorito de sódio e antibióticos.
Essa contaminação deve-se principalmente, à presença de microrganismos
epifíticos, oportunistas ou patogênicos, que penetram nos tecidos ou podem estar
presentes no explante, se desenvolvendo no meio de cultura devido a desinfestação
ineficiente, ou ainda, pela entrada de microrganismos após o estabelecimento do explante
devido ao manuseio incorreto durante as subculturas (LONDE et al., 2007, PANICKER
et al 2007).
De acordo com Brondani (2013), o processo de desinfestação objetiva a
eliminação de microrganismos epifíticos e contaminantes que venham acometer o cultivo
asséptico dos explantes. Os processos de desinfestação variam em função do tipo e origem
do explante, época e ambiente em que foram coletados.
Torna-se crescente o uso do hipoclorito de sódio na assepsia da água, vidrarias e
meio de cultura, por ser um produto químico de fácil aquisição e baixo custo, (ESTRELA
et al., 2002), sendo uma alternativa viável à substituição da esterilização térmica.

2- OBJETIVO

Identificar a presença de contaminação na esterilização térmica e química na água,
vidraria e no meio de cultura.

3- MATERIAIS E MÉTODOS

O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Biotecnologia da Universidade do
Estado da Bahia UNEB, Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais, Campus III. Os
tratamentos que compuseram o experimento estão descritos na tabela 1:
Tabela 1- Descrição dos tratamentos do experimento.
Tratamentos
T1- Controle térmico Água, vidrarias e meio autoclavados
T2- Controle químico Água, vidrarias e meio esterilizados com NaClO
T3- Controle térmico Água, vidrarias autoclavados e meio sem autoclavar
T4- Controle químico Água, vidrarias esterilizados com NaClO e meio sem esterilização
T5- Controle térmico Água, vidrarias sem autoclavar e meio autoclavado
T6- Controle químico Água, vidrarias sem esterilizar e meio esterilizado com NaClO

30 32

A água, vidrarias e meio foram esterilizados conforme o tratamento. No controle
térmico a água e as vidrarias foram autoclavadas por 40 minutos a temperatura de 120 °C
com 1Kgf cm², enquanto o meio foi esterilizados nas mesmas condições de temperatura
por 20 minutos.