POTENCIAL FITORREMEDIADOR DE Canavalia ensiformes L EM SOLO

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POTENCIAL FITORREMEDIADOR DE Canavalia ensiformes L. EM SOLO CONTAMINADO POR cobre e chumbo
RESUMO
A aplicação de fungicidas cúpricos para o manejo das doenças foliares aumenta os teores de cobre (Cu) nos solos, tem sido demonstrado um aumento em áreas contaminadas com cobre e este fato tem colaborado negativamente para o estabelecimento de plantas, sendo necessários estudos de alternativas para reutilização destas áreas. O chumbo (Pb) é um metal potencialmente tóxico, podendo ser acumulado aos solos por meio de fertilizantes fosfatados, resíduos industriais e lodo de esgoto. A fitorremediação é uma metodologia que usa plantas para recuperação de solos contaminados, esse procedimento proporciona vantagens devido à sua natureza permanente, combinada com baixos custos de manutenção, proteção contra a erosão eólica e hídrica e maior estruturação dos solos. Desta forma este estudo tem como objetivo avaliar as variáveis biométricas e as características fisiológicas de plantas de Canavalia ensiformis submetidas a diferentes doses de cobre e chumbo. O experimento será conduzido na (UEMASUL) Universidade Estadual da Região Tocantina do Maranhão, Imperatriz, MA. A implantação será em casa de vegetação, o delineamento em blocos ao acaso, em arranjo fatorial completo de 6x6, seis doses de Pb de: 0, 100 mg kg-1, 200 mg kg-1, 350 mg kg-1, 1.200 mg kg-1e 2.400 mg kg-1 e seis doses de cobre [0 mg kg-1 (sem adição de cobre), 60 mg kg-1, 120 mg kg-1, 180 mg kg-1, 240 mg kg-1, 300 mg kg-1], para cada concentração serão consideradas cinco repetições (uma planta/vaso), totalizando 60 unidades experimentais, a espécie utilizada será Canavalia ensiformes sob os seguintes parâmetros biométricos e fisiológicos. As variáveis avaliadas foram. Altura das Plantas; diâmetro do caule; número de folhas; número de folhas inviáveis; área foliar; clorofila total; massa seca de folha, haste e raiz. Os parâmetros ecofisiológicos que serão avaliados: taxa fotossintética (A, µmol CO2 m -2 s -1), condutância estomática [gs, mol (H2O) m-2 s -1 ], transpiração (E, mmol H2O m-2 s -1) e razão entre as concentrações interna e externa de CO2 (Ci/Ca).
PALAVRAS-CHAVE: Ecofisiologia, feijão-de-porco, solos contaminados, técnicas de recuperação. 
1 INTRODUÇÃO
A fitorremediação é uma prática biológica que se refere ao uso de plantas na descontaminação de solos poluídos, especialmente com metais pesados, reduzindo seus teores aos níveis seguros à saúde humana, além disso, essa técnica pode contribuir na melhoria das características físicas, químicas e biológicas destas áreas (FENG, 2017).
A partir da descoberta de plantas resistentes a metais pesados, nasce a metodologia de tratamento in situ, designada fitorremediação. Feita no próprio local da contaminação, tornou-se um método atrativo e economicamente viável (ANDRADE et al. 2010). 
Como fator positivo, ainda pode ser analisada como uma técnica de baixo custo, socialmente e ambientalmente aceita, que além de promover a remediação ou atenuação do contaminante, pode promover a conservação de espécies vegetais em áreas degradadas (FERNÀNDEZ, 2016). Em países desenvolvidos, como os Estados Unidos, Canadá e Alemanha vêm crescendo cada vez mais, seja por sua grande viabilidade técnica e/ou econômica (BASU, 2018).
A fitorremediação é um método favorável que no Brasil têm trabalhos publicados concentrados em solos contaminados por metais e herbicidas (MARQUES et al., 2011). Ainda há muito que se estudar sobre os mecanismos ecofisiológicos das plantas submetidas ao estresse por metais, pois ainda são poucos os trabalhos envolvendo a fitorremediação com essas espécies.
A adubação verde com leguminosas tem sido uma ótima opção para a recuperação da qualidade física do solo, proporcionando menor resistência do solo para penetração e menor densidade do solo (BONINI, 2012).
O feijão-de-porco (Canavalia ensiformis) se caracteriza por ser uma leguminosa rústica de origem americana e crescimento ereto (EMBRAPA, 1998), que se adapta a solos com baixa fertilidade. Alguns estudos atuais mostram que esta espécie possui capacidade de acumular metais nos seus tecidos (PUGA et al. 2015).
Em solos agriculturáveis, o chumbo pode levar à redução do rendimento das culturas e alterar diretamente o crescimento e desenvolvimento das plantas, ou indiretamente, por influenciar a atividade microbiana do solo (ANDRADE & SILVEIRA, 2004). O Pb altera sobretudo o crescimento das raízes e das plantas, e esse aspecto tem sido usado para avaliar a tolerância de diferentes espécies vegetais ao Pb (DI SALVATORE et al., 2008).
O cobre é um elemento essencial para produtividade das plantas e participa do metabolismo de carboidratos, do nitrogênio, da síntese de lignina e clorofila (Dechen & Nachtigall, 2006). Porém, quando atinge elevadas concentrações no solo, variando de 40 mg kg-1 para solo arenoso e 100 mg kg-1 para solo argiloso (ACCIOLY & SIQUEIRA, 2000), pode ocorrer necrose das folhas, desfolhamento precoce e redução no crescimento do sistema radicular (BELLION et al., 2006). 
Porém determinadas plantas podem tolerar níveis altos desse elemento podendo acumular concentração superior a 1000 mg kg-1 de massa seca, por meio de mecanismos bioquímicos (ACCIOLY & SIQUEIRA, 2000). Neste caso, tornam-se adequadas a elaboração de estudos relacionados às arbóreas e sua tolerância à toxidez do cobre.
Muitas pesquisas foram efetivadas avaliando a influência do chumbo em várias espécies (KOSOBRUKHOV et al., 2004; CHOUDHURY; PANDA, 2005; CENKCI et al., 2010). Contudo, em virtude da complexidade dos efeitos tóxicos e das diversas respostas das plantas ao chumbo e cobre, é importante a realização de pesquisas que envolvam os mecanismos fotossintéticos, a fim de explanar a maneira que as plantas respondem ao estresse ocasionado por estes metais.
Assim sendo o presente trabalho visa responder às seguintes questões científicas: O Canavalia ensiformes tem potencial como fitorremediador de chumbo e cobre? Outra questão é: as respostas de crescimento e fisiológicas em relação as dosagens de chumbo e cobre terão uma resposta positiva na dosagem máxima estabelecida? A hipótese norteadora da pesquisa é que o feijão-de-porco apresenta alto potencial fitorremediador em virtude de ser uma leguminosa que cresce com facilidade em solos contaminados com Pb e Cu, com possibilidade de a espécie ser uma hiperacumuladora.
2. OBJETIVOS
i. Objetivo Geral
O objetivo desta pesquisa será avaliar as respostas biométricas e fisiológicas da espécie Canavalia ensiformis submetida à contaminação artificial do solo com cobre e chumbo, bem como o potencial fitorremediador da Canavalia ensiformes L. .
ii. Objetivos Específicos
· Analisar o comportamento da planta, quanto a seus parâmetros biométricos, quando cultivada em condição de contaminação artificial do solo;
· Avaliar as características ecofisiológicas (fotossíntese, transpiração, condutância estomática, concentração interna de CO2);
· Avaliar absorção, o transporte e o acúmulo de Canavalia ensiformes L.;
· Determinar o fator de bioacumulação (FB) e translocação (FT) da Canavalia ensiformes L para Cu e Pb
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
 3.1. METAIS POTENCIALMENTE TÓXICOS
No Brasil, os níveis de referência para verificação dos teores de metal pesado e de outras substâncias químicas em solos e águas subterrâneas são determinados na Resolução CONAMA nº 420 (Brasil, 2009), o que promove a estimativa de contaminação e a criação de indicadores que controlem e cuidem das áreas expostas a metais e dos seres vivos existentes nela. 
Segundo a Agência para o Registro de Substâncias Tóxicas e Doenças (ATSDR, 2013), vinculada ao governo americano, metais pesados como o As, Hg, Pb e Cd estão entre as 10 substâncias mais tóxicas, sendo o Pb, o segundo lugar dessa lista, carecendo de prioridade no monitoramento ambiental. Ponderando a grande contaminação dos cursos d’água por metais pesados, no Brasil praticamente não há rios ou reservatórios de água próximos aos centros urbanos que nãosejam contaminados com metais pesados (PASCALICCHIO, 2002).
É natural que se localizem pequenas proporções de metais pesados no solo, uma vez que são elementos da estrutura dos minerais, que por meio de seu intemperismo os disponibilizam ao solo. Este processo de transferência de metais pesados ao solo é vagaroso e realizado em baixas concentrações, no entanto, múltiplos são os fatores que podem promover acréscimo nas concentrações destes elementos no solo como a aplicação excessiva de agroquímicos e fertilizantes, rejeitos industriais e atividades de mineração (SOARES, 2004; ALLOWAY, 2013).
Quanto as vias de contaminação dos corpos d’água por metais pesados e difusão da poluição no ambiente, observa-se que as duas predominadoras são: arraste direto para rios e lagos por processos erosivos e percolação no perfil do solo (lixiviação), transmitindo as águas subterrâneas (BARROS et al. 2011).
A contaminação por metal pesado é uma das maiores ameaças para o ecossistema, pois degrada o habitat e apresenta alta potencialidade tóxico para a vida humana, devido a sua constância na natureza (FERRANTE et al., 2017).
3.1.1 Chumbo
O chumbo é um dos elementos potencialmente ameaçadores à saúde humana, sobretudo das crianças, estando em segundo lugar em uma lista de 275 substâncias tóxicas que são consideradas prioritárias para o controle nos Estados Unidos, ficando atrás apenas do arsênio (ATSDR, 2015). Uma das formas de contaminação de cursos de água e solos próximos aos centros urbanos ocorre pela queima de combustíveis que apresentam chumbo em sua composição. Sua presença também é manifesta em inseticidas, fertilizantes, baterias, plásticos, cabos metálicos, tintas, dentre outros produtos que tem devido à sua capacidade de resistir à corrosão e ser um metal resistente (FREITAS et al., 2009; DRUMM et al., 2014).
3.1.2 Chumbo no solo
O chumbo exibe uma baixa mobilidade no perfil do solo, devido à grande capacidade do solo em adsorvê-lo, o que propicia que a maior parte do Pb depositado em sua superfície esteja situada nas camadas mais superficiais. No entanto, se esta capacidade for superada, se ocorrer alterações no pH do solo ou se o metal formar compostos organo-metalicossolúveis, o Pb pode ser lixiviado e sofrer percolação ao longo do perfil, atingindo o lençol freático (ABREU, ABREU e ANDRADE, 1998).
A presença de chumbo no solo pode acontecer de forma natural, devido ao intemperismo de minerais como a galena, anglesita, cerussita, piromorfita e mimetesita, que apresentam o Pb em sua composição (KABATA-PENDIAS e PENDIAS, 2000), ou por ações antrópicas que causem a deposição do metal nos solos. Dentre essas ações pode-se mencionar a deposição atmosférica, provinda de atividades industriais (DRUMM et al., 2014), extrações de mineração (ANDRADE et al., 2009), lodo de esgoto (NOGUEIRA et al., 2008), aplicação de inseticidas e fertilizantes em lavouras (ALLOWAY, 2013).
Os óxidos/hidróxidos e substâncias húmicas têm uma maior capacidade de adsorção do Pb (PIERANGELI et al., 2001), mas, a distribuição do metal pesado no perfil do solo não é algo constante, uma vez que o mesmo pode estar associado a hidróxidos, principalmente os de Fe e Mn, assim como a carbonatos de cálcio e fósforo. Dessa forma, o fosfato acumulado a um solo contaminado com Pb faz com que a concentração do metal em sua fração disponível seja ligeiramente reduzida (KABATAPENDIAS e PENDIAS, 2000).
3.1.3 Chumbo na planta
O Pb, quando absorvido, desempenha influência negativa no processo de crescimento da planta, uma vez que nem todas têm mecanismos de tolerância à absorção do mesmo. Para determinadas plantas, a presença do metal pesado no solo, mesmo em baixas concentrações, pode ocasionar mudanças em sua fisiologia, morfologia e estrutura, influenciando desta forma no crescimento do sistema radicular, na produção de clorofila a e b, inibição da divisão celular dentre outros parâmetros que podem ser considerados indicadores de fitotoxidez da planta (KABATA-PENDIAS E PENDIAS, 2000; SHARMA & DUBEY, 2005).
O chumbo no interior de uma planta não tolerante pode causar mudanças na sua fisiologia, obstruir canais de fluxo de água e nutrientes, o que, por conseguinte, transforma o balanço hídrico da planta, assim como a sua nutrição, causando uma redução em suas funções fisiológicas, dessa forma as taxas de crescimento e respiração são afetadas, refletindo em clorose, diminuição da área foliar e produção de biomassa. O chumbo no interior das células também pode desarranjar os cloroplastos, inibir a síntese de clorofila e carotenoides (SHARMA e DUBEY, 2005).
Nem todas as plantas têm o mesmo mecanismo de distribuição do metal, o que pode variar com a espécie ou com o ambiente em que as mesmas estão plantadas. Plantas que absorvem metais pesados do solo tendem a acumulá-lo em maiores concentrações em suas raízes, em compensação, plantas que estão submetidas à poluição atmosférica têm o acúmulo do metal mais evidenciado em sua parte aérea (MORAES, 2011).
No entanto, têm espécies que possuem mecanismos de tolerância a metais pesados e que os acumulam em seu interior sem que danifique seu desenvolvimento. Souza et al. (2011) notaram, em mucuna-preta que a medida que a concentração de metal pesado no solo era aumentada, ocorria um incremento linear na concentração de chumbo acumulado, tanto na parte aérea quanto no sistema radicular da planta, sem que isso comprometesse a síntese de clorofila a e b, a área foliar e as concentrações de carotenoides.
Abreu et al. (2013) analisaram reduções progressivas nas concentrações de pigmentos em girassóis, à medida que aumentavam as concentrações de chumbo no solo (0; 0,2; 0,4; 0,6 e 8 mL -1 de PbNO3), reduzindo as concentrações de clorofila a clorofila b, carotenoides e clorofila total, respectivamente, em 43, 50, 36 e 45%. Tal fato pode ser explicado pela interferência do Pb na absorção de elementos indispensáveis para a biossíntese da clorofila, como o ferro e o magnésio. 
3.1.4 Cobre
O Cu em conjunto com o ouro e a prata é usado desde os tempos antigos na cunhagem de moedas. Hoje em dia o Cu é necessariamente empregado nas indústrias elétrica e eletrônica. Alguns compostos de Cu são também aproveitados na produção de fungicidas e inseticidas e como catalisadores em diversas indústrias. A atividade mineira contribui intensamente para a contaminação ambiental por Cu, sendo que este metal adere facilmente à matéria orgânica presente nos solos. Uma vez que alguns compostos de Cu são solúveis, estes podem com facilidade ser encontrados na água, contaminando a mesma (ALLOWAY, 2010).
Fungicidas à base de cobre são empregados desde 1800, quando a calda bordalesa foi descoberta por acaso na região de Médoc na França e sua eficiência evidenciada contra a proliferação de fungos como o míldio e oídio (MARTINS et al., 2014). A calda bordalesa é uma mistura composta por sulfato de cobre (CuSO4) e cal (Ca (OH)2) usadas em culturas convencionais e orgânicas de frutas e hortaliças (BAURAND et al., 2016).
O excesso de cobre pode gerar o estresse oxidativo in vivo, cooperando para o surgimento de diversas doenças como aterosclerose e neurodegeneração (CEKO; AITKEN; HARRIS, 2014).
3.1.5 Cobre no solo
O cobre é o terceiro metal mais comum no mundo ficando atrás apenas do ferro e alumínio, sendo consumido em diversas fabricações, da indústria elétrico-eletrônica a máquinas industriais (London Metal Exchange - LME, 2018). No entanto, a produção de rejeitos e resíduos sólidos derivadas da mineração e sua deposição em barragens requerem cuidados com o meio ambiente. 
A alta concentração de cobre na solução do solo pode ser tóxica aos microrganismos, plantas, animais e humanos. O teor natural de cobre em solos é muito alterável, dependendo da rocha matriz e da intensidade dos processos de formação do solo (físico-químico e biológico) sobre a rocha e está predominantemente conexo à fase sólida do solo. As formas solúveis e trocáveis concebem menos que 10% do teor total do cobre em solos e, normalmente são encontrados teores entre1 a 3%. Na litosfera o teor médio total é de 70 mg kg-1, no solo varia de 2 a 100 mg kg-1 e nas águas superficiais as concentrações são menores que 0,020 mg L-1 (KING, 1996; CETESB, 2007).
O cobre, assim como os demais metais pesados, não é biodegradável e apresenta uma dinâmica no solo bastante complexa, alterada diretamente por fatores do meio, principalmente pela quantidade de matéria orgânica, pH e CTC (SODRÉ; LENZI, 2001).
Segundo Kuhn (2011), a contaminação de solos e da água subterrânea pela aplicação de fungicidas cúpricos, como a calda bordalesa, começou a ser amplamente estudada devido à importância da vitivinicultura em vários países do mundo, inclusive no Brasil, e à verificação de que a aplicação de fungicidas cúpricos a longo prazo, pode levar à contaminação dos solos, da água subterrânea e de produtos da uva. Boa parte da calda aplicada em cultivos como fungicida tem como destino o solo, devido ao escoamento causado pela chuva ou à queda das folhas (VENDRUSCOLO, 2013).
Em sistemas agroecológicos, insumos orgânicos como calda bordalesa, calda viçosa, calda sulfocálcica e produtos provenientes do metabolismo secundário vegetal, também podem ser tóxicos ao ambiente (FERREIRA; OLIVEIRA, 2016).
3.1.6 Cobre na planta
O cobre é um micronutriente essencial para as plantas, entretanto também é um metal pesado. Conforme Kabata-Pendias e Pendias (2001), o teor de cobre superior a 100 mg kg-1 no solo é considerado excessivo e pode ocasionar fitotoxidez. Plantas de aveia cultivadas com adição de doses crescentes de Cu exibiram grande redução do crescimento e desenvolvimento na dose de 100 mg de cobre kg-1 de solo (SANTOS et al., 2004). Nos solos da região existem levantamentos que referem teores acima de 1200 mg de cobre total kg-1 de solo (MATSUOKA, 2006).
Os sintomas de deficiência incluem a produção de folhas com cor verde escuro, manchas necróticas que surgem primeiro nas pontas das folhas jovens e se estendem em direção à base da folha ao longo das margens, as folhas também podem ficar retorcidas ou malformadas. Sob deficiência, severa abscisão prematura pode ocorrer. Plantas exibem crescimento atrofiado e seu desenvolvimento radicular é inibido (TAIZ; ZEIGER, 2013).
Eucariotos como fungos, algas e plantas são mais sensíveis à toxidez de cobre, comparadas às bactérias que além da homeostase, oferecem outro mecanismo de resistência que é a expressão de uma família de proteínas queladoras de metais chamadas de metalotioneínas (CAMARGO et al., 2007).
O cobre é absorvido pelas plantas como íon ou como quelato e na maioria das vezes é pouco móvel na planta. A concentração nas plantas não é tão significativa e varia entre 2 a 20 mg kg-1 na matéria seca, conquanto, concentrações mais altas podem ser tóxicas para algumas plantas como citros e leguminosas (KABATA-PENDIAS E PENDIAS, 2001).
A fitorremediação é um processo de biorremediação que usa plantas para extrair metais pesados do ambiente pela absorção, acumulação ou transformação do metal em sua biomassa vegetal, sendo uma ferramenta que pode ser aproveitada para a remediação de áreas contaminadas com metais pesados (Quadro 1).
Quadro 1 – Utilização de plantas para a remediação de áreas contaminadas com cobre.
	Planta
	Cu (II) no solo
	Cu (II) na fitomassa
	Referência
	--------Mg kg-1--------
	Trifolium repens L.
	1000
	850
	Wang et al., 2008
	Elsholtzia splendens N.F.M
	1000
	3200
	Wang et al., 2008
	Trifolium repens L.
	317
	490
	Chen et al., 2006
	Rumex japonicus H.
	1044
	185,6
	Ke et al., 2007
	Brassica juncea L.
	150
	188
	Ma et al., 2009
	Withania somnifera D.
	12,7
	463
	Khatun et al., 2008
	Glycine max L.
	23
	130,9
	Murakami & Ae, 2009
	Oryza sativa L.
	23
	49,1
	Murakami & Ae, 2009
	Avena sativa L.
	207
	1549
	Andreazza et al., 2010b
	Arachis pintoiv K.G.
	207
	800
	Andreazza et al., 2011b
(Adaptado de ANDREAZZA, Robson et al.)
Uma planta com alta capacidade de extração de cobre é a Elsholtzia splendens Nakai ex F.Maek, pois diminuiu em 30% a quantidade de cobre na rizosfera em comparação aos teores iniciais do solo contaminado, adjunto a uma grande produção de fitomassa neste ambiente (JIANG et al., 2004). 
3. 2 FITORREMEDIAÇÃO
A remediação incide na execução de diferentes medidas de contenção e tratamento do material contaminado para saneamento de uma determinada área (SANTOS & NOVAK, 2013). 
A fitorremediação é o procedimento de tratamento do solo contaminado, no qual se faz uso da vegetação, conexa ou não a microrganismos, como agente extrator do metal pesado do solo, ou qualquer outro contaminante. A planta pode remover, estabilizar transferir, ou degradar o elemento encontrado no solo, por meio de subprocessos de fitoextração, fitoestabilização, fitovolatilização e fitodegradação (MA et al., 2011).
Para Santos et al. (2011) as vantagens da fitorremediação residem em: custo inferior as metodologias tradicionais, facilidade em monitorar as plantas em relação a micro-organismos, etc. Já suas desvantagens sobrevêm da possibilidade das plantas empregadas se tornarem plantas daninhas, e da influência do clima e das condições edáficas no crescimento das plantas na área, entre outras. Ainda de acordo com tais autores, é preciso um maior estudo em relação à utilização da técnica mediante e uma ação conjunta de profissionais e com isso habituar-se o melhor procedimento para remedição (remediação) e recuperação de cada tipo de solo.
A fitorremediação pode ser desmembrada nas seguintes estruturas (SALT, 1998; SARWAR et al., 2017, BASU, 2018): 
• Fitoextração: uso de plantas acumuladoras de poluentes para extrair metais ou produtos orgânicos do solo, concentrando-os na parte aérea; 
O princípio da fitoextração baseia-se no uso de plantas para extrair contaminantes do solo, acumulando estes nas raízes e na parte aérea dos vegetais. Fatores como o grau de contaminação do solo, biodisponibilidade do contaminante, capacidade de acumulação das plantas e sua produção de biomassa são de principal importância para um resultado aceitável dessa técnica. A vantagem dessa técnica é o caso de poder ser empregada em grandes áreas apresentando custo reduzido, além de ser uma técnica conservacionista, sem custo energético (ASSIS et al., 2010).
• fitodegradação: uso de plantas adjuntas aos microrganismos para degradar poluentes orgânicos; 
• rizofiltração: uso de raízes de plantas para absorver e adsorver poluentes, especialmente metais, de águas e fluxos de resíduos aquosos; 
• fitoestabilização: uso de plantas para reduzir a biodisponibilidade de poluentes no meio ambiente; 
• fitovolatilização: o uso de plantas para volatilizar poluentes.
Segundo a CETESB (2015), uma área pode ser considerada contaminada quando for confirmada contaminação por qualquer substância, em que seus valores estejam acima dos valores limites de concentração, seja causado pela deposição, acúmulo, acidente ou até mesmo por presença natural do elemento, possuindo assim a necessidade de prevenir ou intervir na área afetada.
Pode-se observar no Quadro 2, a capacidade de absorção de metais pesados por plantas acumuladoras e não acumuladoras.
Quadro 2. Remoção de metais pesados do solo com culturas vegetais.
	Metal
	Conteúdo do solo
	Retirada pelas plantas
	
	Referência
	Acumuladora
	
	kg ha-1
	g ha-1
	%
	g ha-1
	%
	Chumbo
	75
	100
	0,1
	500
	0,6
	Cobre
	45
	100
	0,2
	500
	1,0
Adaptado de: (GARBISU & ALKORTA, 2001).
Apesar de ser uma das melhores metodologias para descontaminação dos solos, a fitorremediação apresenta algumas dificuldades, por ser um processo lento, exigindo que em alguns fatos seja imprescindível mais de um ciclo da cultura para se obter os resultados esperados. É de suma importância que as espécies usadas para este desígnio tenham um potencial fitorremediador, assim, é importante o conhecimento de seu comportamento, bem como as características do solo local e a acessibilidade das raízes da planta ao local contaminado (CARNEIRO et al., 2001; PIRES et al., 2003; ANDRADE et al., 2009).
3.2.1 Plantas fitorremediadoras
Segundo Lasat (2002) plantasfitorremediadoras devem proporcionar alta tolerância ao metal, capacidade de absorção e translocação de altas concentrações do metal da raiz para a parte aérea e exibir alta produção de biomassa. 
Carneiro et al. (2002) trabalharam com diferentes espécies herbáceas em solo contaminado com zinco e cádmio, em que os autores ressaltaram diferentes comportamentos quanto ao potencial fitorremediador, localizando espécies hiperacumuladoras, tolerantes e também espécies bastante sensíveis à presença destes elementos no solo. 
Marques et al. (2000), no entanto, não alcançaram nenhuma das vinte espécies arbóreas trabalhadas, o potencial de acumuladoras, confirmando a necessidade de se conhecer o potencial fitorremediador das espécies antes de destiná-las a fitorremediação.
Para que o mecanismo de remediação seja bom é importante a escolha de espécies capazes a tolerar e imobilizar os metais pesados presentes no solo, sendo de grande importância uma alta produção de massa seca da parte aérea, onde as maiores concentrações de metais pesados devem ser encontradas. Plantas capazes de fitorremediar contaminantes, como os metais pesados, podem imobilizá-los por meio da absorção direta transferindo-os para seu interior, processo de fitoextração (SCRAMIN et al., 2001; ANDRADE et al., 2009).
Tantos artifícios, fazem dos vegetais fantásticos cooperadores da minimização da erosão e a lixiviação dos metais pesados, resguardando o lençol freático e águas superficiais (CAIRES et al. 2011).
Boechat (2014) expõe, a partir de uma célula bacteriana Gram-negativa, a ação de ATPases que são grupos de proteínas complexas no transporte de metais pesados para o lado de fora da membrana celular bacteriana e com função de conduzir a resistência aos metais pesados. Essas proteínas transportadoras evitam o excesso e acumulação de íons metálicos tóxicos e altamente reativos, como o Pb+2, Cu+, Ag+, Zn+2 e Cd+2.
Souza; Silva e Ferreira (2011) destacam como mecanismos que tornam as plantas adaptadas ao estresse por metais pesados: compartimentalização, controle de pH na rizosfera, exsudação de ácidos orgânicos e quelação. Deve-se acrescentar que uma planta pode ter várias estruturas de tolerância.
Segundo Almeida (2012), hoje em dia se utiliza o termo hiperacumuladora de metais para mencionar plantas que acumulam >10.000 mg.kg-1 de Mn e Zn, >1.000 mg kg-1 de Co, Cu, Pb, Ni, As e Se e >100 mg.kg-1 Cd. A hiperacumulação é um fenômeno importante, e a base evolutiva de sua seleção tem sido uma improbabilidade desde seu descobrimento.
Esta particularidade encontra-se adjunta a um mecanismo bioquímico como: produção intercelular de compostos ligantes tais como aminoácidos e seus derivados, ácidos orgânicos e fitoquelatinas; alterações nas formas de compartimentalização; alterações no metabolismo celular; e alterações na estrutura da membrana. Sendo que os ligantes mais avaliados são as fitoquelatinas e as metalotioninas (ALMEIDA, 2012).
3.2.1.1 Feijão-de-porco (Canavalia ensiformis (L.) D.C.)
Dentre as espécies propostas à fitorremediação, o feijão-de-porco vem ganhando ênfase pela sua grande capacidade de tolerar e acumular metais pesados. Romeiro et al. (2007) trabalhando com Canavalia ensiformis cultivada em hidropônia, concluíram que a espécie é hiperacumuladora de chumbo, principalmente no sistema radicular. 
Almeida et al. (2008) também notaram que o feijão-de-porco possui uma alta capacidade em acumular chumbo sem que este afete seu crescimento até a dose de 1000 mg kg -1 , no entanto, os autores ressalvaram que com o aumento das doses de chumbo a raiz da planta foi adquirindo uma coloração escura, atribuída ao fato do metal inibir a divisão e diferenciação celular das raízes.
O feijão-de-porco (Canavalia ensiformis (L.) DC) é uma leguminosa herbácea, anual e de porte ereto, com um crescimento inicial rápido, que exibe um ciclo rápido de 170 a 200 dias, levando de 90 a 100 dias para florescer. É uma espécie bastante rústica a condições climáticas e de fertilidade do solo, além de ser uma espécie que requer uma completa cobertura do solo (RODRIGUES et al., 2004).
Melo (2006), também pôde notar que, mesmo em altas concentrações de arsênio, o feijão-de-porco continuou crescendo e absorvendo o metal, apesar deste acúmulo ser mais manifesto no sistema radicular da planta e a planta exibir sintomas de toxidez. Além do arsênio e chumbo, há também relatos do feijão-de-porco resistindo e absorvendo cádmio, sem que a germinação fosse afetada, entretanto, em concentrações mais elevadas, houve redução no seu crescimento (ROSSI, 2007).
Outra estrutura de tolerância refere-se ao baixo índice de translocação do metal pesado das raízes para a parte aérea, como examinado por Almeida et al. (2008) em Canavalia ensiformes. Esta espécie, ao impedir a mobilidade do Pb para a parte aérea, protegeu-se dos sintomas de fitotoxidade (murchamento, clorose, necrose e queda) e da inibição do crescimento (ALMEIDA et al. 2008).
Por sua vez, Zancheta et al. (2011) concluíram que o feijão de porco expôs, na sua pesquisa, maior concentração, acúmulo e transporte de Cu para a parte aérea, sendo uma espécie com potencial para ser empregada em programas de fitorremediação de Cu.
A medida que a planta adquire defesas para permitir substâncias potencialmente tóxicas, pode conjuntamente, criar sistemas de acúmulo tanto nas raízes, quanto nas folhas e caule (Chaves et al. 2010, Caires 2011). E em várias situações, o acúmulo passa a ser adequado ao aumento das dosagens aplicadas.
3.2.1.1.1 Trocas gasosas
A condutância estomática é pertinente ao número, tamanho e diâmetro de abertura dos estômatos e fatores ambientais. Sob estresse a planta tende a fechar os estômatos como mecanismo de defesa que evita a perda de água, adicionando a resistência do vegetal e reduzindo a condutância estomática (TAIZ & ZEIGER, 2013).
A diminuição da concentração interna de CO2 acontece, por fatores que diminuem a concentração de CO2 para o espaço interno das folhas devido à redução da condutância estomática. Isso ocorre pelo fechamento dos estômatos que são influenciados por fatores ambientais como disponibilidade hídrica, luz e energia. O controle estomático é uma propriedade fisiológica, pela qual as plantas comandam a perda de água, reduzindo a condutância estomática e as trocas gasosas como forma de resposta das plantas a diversos fatores, ou estresses pelos quais a planta possa ser atribuída (BELO, 2016).
4 MATERIAL E MÉTODOS
 4.1 ÁREA DE ESTUDO
O experimento será realizado em condições de casa de vegetação, na Universidade Estadual da Região Tocantina do Maranhão (UEMASUL), MA.
 
4.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
.
A espécie vegetal estudada será a leguminosa herbácea Canavalia ensiformis (L.) D.C. (feijão-de-porco), cujas sementes serão obtidas no Instituto Agronômico (IAC). O experimento será conduzido em casa de vegetação e obedecerá a um delineamento em blocos ao acaso, em arranjo fatorial completo de 6x6. 
Seis doses de chumbo serão aplicadas em mg kg-1 de Pb, de: 0, 100, 200, 350, 1.200 e 2.400. Utilizando-se como fonte de contaminação o acetato de chumbo [Pb (CH3COO)2·3H2O]. Essas doses equivalem aos níveis de alerta, intervenção em área agrícola, residencial, industrial e dobro do nível industrial, segundo valores orientadores verificados pela Cetesb (2019).
Seis doses de cobre [0 mg kg-1 (sem adição de Cu), 60 mg kg-1, 120 mg kg-1, 180 mg kg-1, 240 mg kg-1, 300 mg kg-1], na forma de solução de sulfato de cobre (CuSO4 .5H2 O), sendo diluídas em 50 mL de água para homogeneização no solo por agitação em saco plástico. Para cada concentração serão consideradas cinco repetições (uma planta/vaso), totalizando 60 unidades experimentais.
A análise de solo, será coletada na camada de 0-20 cm de profundidade, será analisado as características físicas e químicas. As sementes serão previamente desinfetadas e colocadas para germinar em sacos plásticos contendo areia lavada e esterilizada e posteriormente transplantadas em vasos de 5L.
As plantas serão mantidas por 60 dias em exposiçãoaos metais pesados, com renovação de solução nutritiva a cada 7 dias. Após isso começam as avaliações dos parâmetros. 
4.2.1 Variáveis Ecofisiológicas
As análises serão feitas sempre pela manhã, entre 8 e 9h, para determinação da resposta fotossintética de plantas submetidas a doses crescentes de chumbo e cobre, será realizada medidas de trocas gasosas utilizando um analisador portátil de gases no infravermelho (IRGA, LI 6400xt, Li-Cor) Os seguintes parâmetros serão analisados: taxa fotossintética (A, µmol CO2 m -2 s -1), condutância estomática [gs, mol (H2O) m-2 s -1 ], transpiração (E, mmol H2O m-2 s -1) e razão entre as concentrações interna e externa de CO2 (Ci/Ca) (SOUSA, 2018). As avaliações serão feitas em todas às plantas de todos os tratamentos (n=60), sendo um folíolo por planta colocada dentro da câmara, sempre na região mediana da folha totalmente expandida
4.2.2 Variáveis Biométricas
Altura das Plantas: Utilizando régua milimétrica, medindo a partir da superfície do substrato até o meristema apical. 
Diâmetro do Caule: Utilizando paquímetro, medindo o caule a 0,5 cm do substrato. 
Número de Folhas: Contagem das folhas totais emitidas pela planta. 
Número de Folhas Inviáveis: Contagem das folhas com mais de 50% de área foliar necrosada.
Área Foliar: Área foliar total da planta (Medidor portátil de área foliar AM 300 ADC Scientifc).
Clorofila Total: Teor de clorofila das folhas coletado usando a média de três folhas do terço médio de cada planta (Medidor Portátil de Teor de Clorofila- SPAD).
Massa Seca de Folha, Haste e Raiz: Massa seca das diferentes partições da planta colocada para secar em estufa de circulação de ar forçada a 65°C até obterem peso constante, posteriormente pesada em balança analítica de precisão (10-3).
As análises para examinar as concentrações de cobre e chumbo serão realizadas por Espectrofotometria de Absorção Atômica por Plasma de Argônio por extração com o ácido dietilenotriaminopentacético de acordo com o método da Embrapa (SILVA, 2009). 
4.2.3 Determinação de pH em H2O e KCl
As amostras dos solos seca ao ar, e passadas em peneira de 2 mm homogeneizadas serão submetidas à análise de pH em água e KCl 1 mol L-1. Serão determinados potenciometricamente em suspensão, empregando 10,0 gramas de cada amostra serão acrescentados 25 mL de água e solo: KCl 1 mol L-1 e solo (relação 1:2,5) e agitando-se por 40 mim. Após agitação a suspensão será deixada em repouso por 1h. Em seguida serão feita as medições do pH nas amostras segundo Raij et al., (2001). As análises serão feitas em triplicata.
4.2.4 Determinação da percentagem de matéria orgânica 
Em cadinho de porcelana previamente calcinado a 550° C e aferido. As amostras secas e peneiradas a 0,35 mm serão submetidas à calcinação por 4 horas, em forno mufla a 550º C. Decorrido o tempo de calcinação, o cadinho será resfriado em dessecador. A percentagem de matéria orgânica será obtida por meio da diferença entre o peso inicial da amostra e o peso após a calcinação (EMBRAPA, 2011). 
4.2.5 Determinação da capacidade de troca catiônica
Para a determinação dos cátions totais trocáveis, CTC, serão pesados 2,50 g das amostras, adicionando-se 25 ml da solução de ácido acético 1,00 mol L-1. Em seguida a suspensão será agitada por 1 h em incubadora com agitação orbital shake, sendo posteriormente então determinado o pH tanto da solução de ácido acético quanto da suspensão contendo a amostra conforme o método utilizado por Cotta et al. (2006). As determinações serão feitas em três repetições. A determinação da CTC das amostras será de acordo com a equação abaixo: 
CTC(cmol c kg-1) = [pH1-pH2] x Kctc
Onde:
pH1= pH da suspensão contendo a amostra;
pH2 = pH da solução de ácido acético;
Kctc = Soma das cargas dos cátions presentes na CTC do solo.
4.2.6 Extração de metais biodisponível no solo antes e após o plantio
Na determinação de metais biodisponíveis serão pesados aproximadamente 10,000g de cada solo secos, em frascos cônicos de polietileno e será 20 ml de solução extratora DTPA (DTPA 0,005 mol. L-1 + TEA 0,1 mol.L-1 + CaCl2 0,01 mol.L-1, pH 7,3). Em seguida a mistura será agitada por duas horas a 220 rpm em agitador mecânico orbital e filtrada imediatamente a suspensão (TAVARES; OLIVEIRA ; SALGADO, 2013). As análises serão feitas em triplicata. 
4.2.7 Extração de metais na Canavalia ensiformes L
A abertura da amostra será adaptada do método descrito por Santos (1999) e Silva et al. (2000). Será pesado do material moído será transferido para um Becker com capacidade de 80 mL. Posteriormente será adicionado ácido nítrico e perclórico numa proporção 3:1(v/v). A mistura será deixada em repouso durante a noite e decorrida esse tempo, procede-se a mineralização da mistura (160° ±5º C). Após um breve resfriamento, serão adicionados 2 mL de H2O2. A digestão será feita até que o conteúdo do balão adquira uma tonalidade clara. Feita a digestão, os extratos ácidos serão esfriados à temperatura ambiente, em seguida serão filtrados em papel de filtro quantitativo (Whatman 44). O filtrado será recolhido em balões volumétricos de 50 mL, e o volume completado com água desionizada. Durante os processos de extração, será realizado um controle branco das soluções extratoras para cada conjunto de amostra analisada no mesmo dia. As análises serão feitas em triplicata.
4.2.8 Análise estatística
Os dados obtidos serão submetidos à análise estatística, utilizando-se análise de variância (ANOVA) no programa R e, as médias comparadas pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. 
5. RESULTADOS ESPERADOS
Se conseguirmos alcançar os objetivos do projeto, propiciará o aumento no número de pesquisas científicas sobre o assunto, uma técnica que poderá ajudar pequenos e grandes produtores.
Publicar artigos científicos, divulgação por meio de boletins de pesquisas, comunicados técnicos e circulares técnicas direcionadas a região e ao público, além de capacitação de produtores, técnicos multiplicadores de assistência técnica com a transferência das tecnologias obtidas por meio dos resultados da pesquisa.
CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO
 Cronograma de trabalho para o período 2019-2020
	Atividades
	2019
	2020
	
	1ºT
	2ºT
	3ºT
	4ºT
	1ºT
	2ºT
	3ºT
	4ºT
	Pesquisa Bibliográfica
	X
	X
	X
	X
	X
	
	
	
	 Implantação do experimento
	
	
	
	
	X
	
	
	
	Aplicação das doses de chumbo e cobre
	
	
	
	
	X
	
	
	
	Análises Biométricas e ecofisiológicas 
	
	
	
	
	X
	
	
	
	Extração e determinação Cu e Pb no solo e na 
	
	
	
	
	
	
	
	
	Tabulação dos dados e estatística 
	
	
	
	
	
	X
	X
	
	Escrita da dissertação
	
	
	
	
	X
	X
	X
	
	Desefa da Dissertação
	
	
	
	
	
	
	
	X
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