ELISA e Imunofluorescência em Análises Clínicas

Prévia do material em texto

ELISA (ensaio imunoenzimático)
Profº Tércio Lemos de Morais
Direto ou Indireto?
ELISA
DIRETO
INDIRETO
Antígenos
Anticorpos
Elisa Direto (sanduíche)
Dentre os diversos tipos de ELISA, destaca-se o
“ELISA SANDUÍCHE”. Nesse método, o anticorpo de
um antígeno particular é, inicialmente, adsorvido no
“well”. Depois, o antígeno (soro, urina ou outra
solução contendo o antígeno) é adicionado e se liga ao
anticorpo. Finalmente, um segundo e diferente
anticorpo conjugado à enzima é adicionado. Nesse
caso, a intensidade da reação é proporcional à
quantidade de antígeno presente. Logo, permite
mensurar até pequenas quantidades de antígeno.
No ELISA direto (sanduíche) um anticorpo conjugado
se liga ao antígeno pesquisado.
Elisa Indireto
• O ELISA indireto é uma técnica utilizada para
detecção de anticorpo, sendo assim, utiliza-se uma
placa contendo, aderida na parte solida, antígenos
para a patologia a ser analisada e seguem-se as
seguintes etapas:
1º Coloca-se o soro do paciente nos poços presentes na
placa. Se existir presença de anticorpos, esses se ligarão
aos antígenos presentes na placa formando um
complexo: antígeno (ligado à placa) – anticorpo;
2º Após esse processo é realizada uma lavagem da placa
(essa lavagem é feita usando um tampão de lavagem),
para retirar os anticorpos não ligados;
3º Adiciona-se depois um anti-anticorpo conjugado
(anticorpo secundário), assim se formará um complexo:
antígeno (ligado à placa) – anticorpo – anti-anticorpo
conjugado;
4º Realiza-se outra lavagem, para se retirar o excesso
de anti-anticorpo conjugado, que não formou o
complexo citado acima;
5º Adiciona-se um substrato para a enzima (no caso da
enzima ser a peroxidase, utiliza-se como substrato o
peróxido de hidrogênio e cromógenos). O substrato
adicionado, ao se ligar à enzima do complexo, forma
um produto colorido;
6º Por fim adiciona-se uma solução de parada, ou seja,
uma solução que interrompa a ação da enzima para que
assim a solução não fique com uma coloração muito
forte e atrapalhe a leitura do teste.
No ELISA indireto, um anti-anticorpo conjugado se
liga ao anticorpo pesquisado.
O ELISA constitui a base do teste para infecção
por HIV. Nesse teste, proteínas virais (os
antígenos) adsorvem nos “poços” (wells) da placa
de ELISA. Em seguida, é adicionado soro do
paciente contendo anticorpos que se ligam aos
antígenos. Finalmente, anticorpos ligados à
enzima ligam-se aos anticorpos humanos,
propiciando a reação enzimática com mudança de
cor.
Materiais e Equipamento Utilizados
PLACAS DE ELISA
Pipetas e ponteiras
Lavador de Placas
Leitor de Elisa (espectrofotômetro)
Soluções e Reagentes
• Soluções de 
lavagem;
• Reagente com o Ac 
conjugado a enzima;
• Substrato;
• Solução de parada.
Cuidados
• Data de validade e estocagem dos
REAGENTES;
• Processamento e estocagem das AMOSTRAS;
• Evitar contaminação no PREPARO DE
SOLUÇÕES;
• CALIBRAÇÃO de pipetas e demais aparelhos;
• LIMPEZA.
Imunofluorescência
Profº. Ms. Dr Tércio Lemos Morais
Direta ou Indireta?
• Existem dois tipos distintos de
Imunoflorescência. São elas:
✓Imunofluorescência Direta
✓Imunofluorescência Indireta
imunofluorescencia para Chagas
Exame FAN (Fator Antinuclear)
• É um teste habitualmente solicitado para os
pacientes que estão com suspeita de uma doença
de origem autoimune.
• O FAN (fator antinuclear) é feito com amostras
de sangue do paciente com suspeita de doença
autoimune (o indivíduo tem anticorpos contra
suas próprias células).
O que é o FAN?
• O FAN (fator antinuclear) é um grupo de auto-
anticorpos descoberto na década de 1940 em pacientes
com lúpus eritematoso sistêmico.
• O FAN são anticorpos contra os núcleos das nossas
células.
• O FAN não é um único anticorpo, ele é um conjunto de
anticorpos contra diferentes estruturas das células.
• Existem vários tipos de FAN, cada um deles associado a
um tipo de doença autoimune diferente.
• É importante salientar que 10% a 15% da
população sadia pode ter FAN reagente em
valores baixos sem que isso indique qualquer
problema de saúde.
Exame FAN
• Para entender os resultados do FAN é preciso saber 
como o exame é feito:
▫ O exame de FAN é feito com amostras de sangue do
paciente com suspeita de doença autoimune.
▫ No laboratório consegue-se identificar todos os anticorpos
circulantes neste sangue. Com um corante fluorescente o
laboratório marca cada um destes anticorpos. Depois,
mistura-se este sangue em um recipiente com uma cultura
de células humanas (chamadas de Hep2).
Resultado do FAN
• Se houver anticorpos contra
estruturas das células humanas,
estes irão se fixar às mesmas,
tornando-as fluorescentes.
• Se o auto-anticorpo for contra o
núcleo das células, a imagem no
microscópio será de vários núcleos
fluorescentes.
• Se auto-anticorpo for contra o
citoplasma das células, vários
citoplasmas ficarão brilhando, e
assim por diante.
• Se não houver auto-anticorpos,
nenhuma parte das células ficará
fluorescente, caracterizando um
FAN não-reativo.
FAN Reagente
FAN – Fator Anti-Nuclear
• A partir de agora, você já pode ter uma ideia dos
resultados do FAN. Vamos citar alguns
exemplos:
Tipos de FAN reagentes 
• Os padrões mais comuns do FAN e suas prováveis
patologias, são:
▫ Nuclear pontilhado Centromérico:
Esclerodermia ou Cirrose biliar primária.
▫ Nuclear homogêneo: Lúpus, Artrite Reumatoide,
Artrite Idiopática Juvenil, Síndrome de Felty ou
Cirrose Biliar Primária.
▫ Nuclear tipo membrana nuclear contínua:
Lúpus ou Hepatite autoimune.
▫ Nuclear pontilhado fino: Síndrome de Sjögren
Primária, Lúpus Eritematoso Sistêmico ou Lúpus.
• Nuclear pontilhado fino Denso: Inespecífico,
pode estar presente em várias doenças auto-
imunes e também na Cistite Intersticial, Dermatite
Atópica, Psoríase ou Asma.
• Nuclear pontilhado grosso: Doença Mista do
Tecido Conjuntivo, Lúpus Eritematoso Sistêmico,
Esclerose Sistêmica ou Artrite Reumatoide.
• Nucleolar pontilhado: Esclerose Sistêmica.
• Citoplasmático pontilhado reticulado:
Cirrose Biliar Primária ou Esclerose Sistêmica.
• Citoplasmático pontilhado fino: Polimiosite
ou Dermatomiosite.
• A sensibilidade do FAN nas principais doenças 
autoimunes é a seguinte:
▫ Lúpus: 95 a 100%.
▫ Esclerodermia: 60 a 80%.
▫ Doença mista do tecido conjuntivo: 100%.
▫ Polimiosite e dermatomiosite: 61%.
▫ Artrite reumatoide: 52%.
▫ Síndrome de Sjögren: 40 a 70%.
▫ Lúpus induzido por drogas: 100%.
▫ Lúpus discoide: 15%.
▫ Tireoidite de Hashimoto: 46%.
▫ Hepatite autoimune: 100%.
▫ Colangite autoimune primária: 100%.
FAN FALSO POSITIVO
• Como qualquer exame laboratorial, o FAN também pode
apresentar falsos positivos. 10% da população saudável
pode ter FAN falso positivo, principalmente mulheres e
idosos. Algumas doenças ou medicamentos também
podem causar um FAN reagente sem que isso signifique
a presença de uma doença autoimune. Entre as doenças
que podem causar um FAN positivo, as mais comuns
são:
▫ HIV
▫ Mononucleose
▫ Linfoma
▫ Tuberculose
▫ Medicamentos (hidralazina, isoniazida e procainamida.)
O que fazer após um FAN positivo?
• Uma vez que se tenha um FAN positivo,
• Deve-se solicitar a pesquisa de auto-anticorpos
específicos para tentar definir exatamente com
qual doença autoimune estamos lidando;
• O FAN sugere a presença de um auto-anticorpo,
mas não define qual.
• Finalizando, o fator antinuclear é um exame
inicial na investigação das doenças autoimunes.
O FAN sozinho não fecha nenhum diagnóstico.
Perguntas Elisa
1) Qual o principio da técnica de elisa?
2) Quais as diferenças entre elisa direto e
indireto?
3) Cite todos os itens necessários para realização
do elisa e a função de cada um.
4) Qual a importância das lavagens durante a
realização do elisa?
5) Quais as etapas para realização do elisa
indireto?
Perguntas - Imunofluorescência
1) Qual o princípio da técnica de
imunofluorescência?
2) Quais as diferenças entre imunofluorescência
direta e indireta?
3) Cite todos os itens utilizadospara realização
da imunofluorescência e suas funções?
4) Que tipo de microscópio se usa para avaliar o
resultado? Por quê?
5) O que é FAN? Como é feito?