Trabalho sobre microscopia - Ciência e Tecnologia dos Materiais

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 Faculdades Oswaldo Cruz
Engenharia Química
 
CIÊNCIA E TECNOLOGIA DOS MATERIAIS
 
 
 
 
MICROSCOPIA
IGOR DO NASCIMENTO PEREIRA - 2418298
 
SÃO PAULO
23 de abril de 2020
 
Faculdades Oswaldo Cruz 
Engenharia Química
TRABALHO SOBRE MICROSCOPIA
Trabalho apresentado como parte dos critérios de avaliação da
disciplina de Ciência e Tecnologia dos Materiais
Curso de Engenharia Química
Professor(a): Maria Adriana	 
SUMÁRIO
1.	INTRODUÇÃO	3
2. OBJETIVO	6
3. Microscopia Óptica – MO	7
3.1 Histórico	7
3.2 Apresentação do microscópio ótico	8
3.4 Preparação da amostra	9
3.5 Resolução	10
3.6 Exemplos de imagens de obtidas por microscopia ótica	11
4. Microscopia Eletrônica de Varredura – MEV	14
4.1 Histórico Microscópio eletrônico de varredura (MEV)	14
4.2 Princípio de funcionamento Elétrons secundários (“Secondary Electron” - SE)	15
4.3 Elétrons retroespalhados (“Backscattering Electron”- BSE)	15
4.4 Preparação de amostras	16
4.5 Exemplos de imagens de amostras obtidas por MEV	18
5. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO – MET	21
5.1 Histórico	21
5.2 Princípio de funcionamento	23
5.3 Preparação de amostras	24
5.4 Exemplos de imagens de amostras obtidas por M.E.T	26
6. MICROSCOPIA DE ENERGIA DISPERSIVA - EDS	28
6.1 Finalidade	28
6.2 Princípio de funcionamento	28
6.3 Preparação da amostra	29
6.4 Exemplos de imagens obtidas de amostras com a técnica EDS	29
7. CONCLUSÃO	31
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS	32
1. INTRODUÇÃO
Com a finalidade de ampliar a capacidade de visão humana foi inventado em 1590 por Hans e Zacharias Jansen, um aparelho com capacidade de ampliar a imagem de pequenos objetos denominado de microscópio, que tem origem mikrós (do grego, pequeno) e scoppéoo (do grego observar, ver através). 
Figura 1 - Microscópio de Zacharias e seu pai Hans.
Fonte 1 - KASVI.
Com o passar dos anos, o holandês Antonie van Leewenhoek, aperfeiçoou o microscópio com a inserção de apenas uma lente, pequena e semiesférica, entre duas placas de cobre. Entretanto diferente do primeiro microscópio, este desenvolvido por Antonie, foi utilizado em pról da ciência visando o entendimento da natureza, estudando principalmente materiais como plantas, sangue, esperma e microrganismos. 
Em 1665, o cientista Robert Hook escreveu um livro com desenhos detalhados de suas descobertas no mundo micro, denominado Micrographia.
Figura 2 - Desenho de Hook, sobre sua observação que o levou a descrever o termo "cell".
Fonte 2 - KASVI.
Com o passar dos anos, obviamente, houve grande avanço tecnológico que impulsionou a criação de microscópios com capacidade de ampliação cada vez maiores. Em 1880, os microscópios ópticos chegaram à resolução de 0,2 micrômetros, o qual limite se estende até os dias atuais. 
Na década de 30, Ernst Ruska cria o primeiro microscópio eletrônico, que possui um poder de resolução muito superior. O microscópio utiliza feixe de elétrons e lentes eletromagnéticas com o propósito de observar o objeto, atingindo uma ampliação de até 1 milhão de vezes, o que o difere do microscópio óptico já que ele utiliza a luz, e em determinado momento o objeto é tão pequeno que a luz sobressai a partícula estudada.
Figura 3 - Ilustração das capacidades de ampliação do olho humano, microscópio optico e microscópio eletrônico.
Fonte 3 - Centro de microscopia UFMG.
Já na década de 80, Gerd Binning e Heinrich Rohrer inventam o microscópio de tunelamento por varredura que fornece imagens tridimensionais de objetos ao nível atômico, o microscópio utiliza tunelamento quântico entre uma amostra e uma ponta da sonda para que a imagem da superfície seja completamente analisada.
Figura 4 - Microscópio de tunelamento.
Fonte 4 - Universidade Federal de Minas Gerais.
Atualmente o ramo da microscopia se divide em três principais ramos: Microscopia Óptica, Microscopia Eletrônica, Microscopia de Sonda de Varredura.
2. OBJETIVO
Este trabalho tem como objetivo introduzir o aluno as quatro principais técnicas de microscopia sendo estas a Microscopia Óptica (MO), Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e Microscopia de Energia Dispersiva (EDS).
3. Microscopia Óptica – MO
3.1 Histórico
Historicamente falando, a campo da macroscópica desenvolveu-se primeiro que o da microscopia. Os primeiros microscópios compostos mais avançados apareceram pela primeira vez no continente Europeu por volta de 1620 d.C. Dentre seus primeiros praticantes destacam-se Galileo Galilei, que descobriu em 1610 poderia fechar o foco do seu telescópio para ver pequenos objetos com aumento. Entretanto foram om a finalidade de ampliar a capacidade de visão humana que foi inventado em 1590 por Hans e Zacharias Jansen, que posteriormente em 1620 o holandês Antonie van Leewenhoek desenvolveu um microscópio simples de ampliação muito superior aos da época, com uma instrumentação óptica da época ordenada e organizada em seu interior, de tal modo que ficou característico com os que são encontrados atualmente.
Figura 5 - Esquema conceitual de um microscópio óptico composto.
Fonte 5 - Wikipédia.
3.2 Apresentação do microscópio ótico
Os microscópios óticos são constituídos por um componente mecânico de suporte e de controle do componente ótico que amplia as imagens. Os microscópios atuais que usam de luz transmitidas partilham os mesmos componentes básicos descritos na Tabela 1 da imagem Figura 6.
Figura 6 - Microscópio Optico 1. Lentes oculares 2. Revólver 3. Lentes objetivas 4. Parafuso macrométrico 5. Parafuso micrométrico 6. Platina 7. Foco luminoso (Lâmpada ou espelho) 8. Condensador e diafragma 9. Braço.
Fonte 6 - Adaptado de Casas Bahia.
Tabela 1 - Relação de componentes básicos estruturais dos microscópios ópticos.
	Componente básico
	Imagem
	Descrição
	Pé ou base
	
	Peça fixa a base
	Coluna ou Braço
	
	Fixo a base, serve de suporte a outros elementos
	Mesa ou Platina
	
	Onde se fixa a lâmina a ser observada. Possui uma janela aonde passam os raios luminosos
	Charriot
	
	Peça ligada a platina que permite mover a lâmina no plano.
	Tubo ou canhão
	
	Cilindro que suporta os sistemas de lentes.
	Revólver ou Óptio
	
	Disco adaptado à zona inferior do tubo, que suporta duas a quatro objetivas de diferentes ampliações
Fonte 7 - Autoria própria.
3.4 Preparação da amostra
As amostras devem conter diâmetro inferior a 2 mm para serem analisadas no microscópio óptico, já que a leitura realizada no equipamento é por meio de lâmina, lamínula e em alguns casos óleo dispersante.
Após passar por um ou mais processos de preparação, o material é colocado sobre uma lâmina retangular de vidro, que serve de suporte, é aplicado sobre a amostra uma gota de óleo com alta pureza e então a amostra é recoberta por uma lamínula extremamente fina de forma retangular, e então o conjunto é observada no microscópio óptico.
Na Tabela 2 foram descritos os métodos de preparação de amostras comumente usados em laboratório, tanto para amostras orgânicas quanto para amostras inorgânicas.
Tabela 2 - Principais técnicas de preparação de amostras para microscopia óptica.
	Técnica
	Descrição
	Material
	Espalhamento
	Uma gota do material é colocada sobre a lâmina e então espalhado uniformemente, para que as partículas se distribuam uniformemente em uma fina camada.
	Material em forma de pó, podendo ser orgânico, inorgânico e material biológico com baixa aglomeração.
	Esmagamento
	Uma gota de material é colocada sobre a lâmina e então é posicionada a lamínula sobre a amostra, posteriormente é pressionada a lamínula de tal modo que aconteça a segregação do material.
	Material aglomerado. Pode ser material orgânico/inorgânico ou material biológico
	Coloração
	O componente orgânico biológico é mergulhado a célula em um corante, que tinge uma ou mais partes da célula.
	Material biológico.
Fonte 8 - Autoria própria.
3.5 Resolução
A qualidade de imagem de um microscópio não depende unicamente da ampliação que sua lente é capaz de utilizar, mas também dopoder de resolução, que basicamente é a capacidade de distinguir pontos situados muito próximos no objeto observado. Em termos gerais, quanto maior essa capacidade, melhor será a definição da imagem.
O poder de resolução de um microscópio óptico tem um limite. Se duas partículas estivem a menos de 0,25 micrômetro um do outro, elas serão vistas apenas como uma partícula maior. Essa distância é o limite de resolução dos microscópios ópticos. O poder de resolução é função do comprimento de onda de luz visível utilizada (número entre 400 e 700 nm). O limite de resolução é obtido com o menor comprimento de onda da luz visível e com a objetiva de maior abertura numérica.
Quando as lentes objetivas de 100x ou mais de capacidade de ampliação são utilizadas, aplica-se uma gota de óleo de imersão com alta pureza sobre a amostra, que ficaram entre a amostra e a lente objetiva. Quando o óleo é aplicado, os raios emergentes da amostra são coletados, aumentando a luz que é captada pela lente, que acaba por melhorar a visualização da amostra.
3.6 Exemplos de imagens de obtidas por microscopia ótica
Os resultados obtidos com a Microscopia óptica com câmera acopladas podem ser por vídeos ou imagens em colorido ou preto e branco. Dependendo do equipamento há possibilidade de obtenção dos resultados por LUZ incidente, onde a luz acaba por incidir sobre a amostra/partícula, e observa-se a luz refletida pela mesma – método normalmente utilizados em amostras opacas – e por Modo de Luz Transmitida, onda a luz incide através da amostra/partícula, sendo observado a luz transmitida por ela.
A Figura 7 e Figura 8, são exemplos de imagens obtidas por microscopia óptica com a técnica de luz transmitida.
Figura 7 - Imagem de microscopia óptica obtida por incidência de luz transmitida na amostra.
Fonte 9 - Laboratório de Caracterização Tecnológica (LCT-EPUSP).
Figura 8 - Imagem de microscopia óptica obtida por incidência de luz transmitida na amostra.Fonte 10 - Laboratório de Caracterização Tecnológica (LCT-EPUSP).
A Figura 9 e Figura 10 são exemplos de imagens obtidas por microscopia óptica com a técnica de luz refletida.
Figura 9 – Imagem de microscopia óptica obtida por incidência de luz refletida na amostra.
Fonte 11 - Laboratório de Caracterização Tecnológica (LCT-EPUSP).
Figura 10: Imagem de microscopia óptica obtida por incidência de luz refletida na amostra.
Fonte 12 - Laboratório de Caracterização Tecnológica (LCT-EPUSP).
4. Microscopia Eletrônica de Varredura – MEV
4.1 Histórico Microscópio eletrônico de varredura (MEV) 
No século 19, as inovações tecnológicas e melhorias de design propiciou os microscópios a ganhar popularidade com cientistas e pesquisadores em todas as áreas da ciência, dentre elas destacam-se a biologia, botânica, zoologia, geologia e ciência dos materiais.
Apesar de ter proporcionado grande evolução nas áreas já citadas, em um determinado ponto, a microscopia óptica já apresentava suas limitações. Partículas/Estruturas com diâmetro inferior meio micrômetro não eram possíveis serem analisadas.
No século 20, mais especificamente na década de 20, foi descoberto que elétrons acelerados no vácuo comportavam-se muito semelhante a luz e pouco tempo depois foi descoberto que eletricidade e campo magnéticos poderiam ser usados para modelar a forma dos caminhos que os elétrons percorriam, de forma muito semelhante a maneira com que as lentes de vidros são usadas para desviar e focar a luz visível. Em 1931 Ernst Ruska e Max Knoll, na universidade de Berlin, combinaram estas características e criaram o primeiro Microscópio de Transmissão eletrônica.
O primeiro microscópio eletrônico de varredura (MEV) para observação de amostras foi construído no ano de 1942 por Zworynki e seus colaboradores nos laboratórios da RCA. Os responsáveis descreveram que a emissão de elétrons secundários poderia ser responsável pelo contraste topográfico de imagens geradas. O coletor foi polarizado positivamente em ralação a amostra, e os elétrons secundários coletados produziram uma queda na voltagem do resistor. Esta queda de voltagem foi enviada para um monitor para produzir uma imagem, porém a resolução da imagem que foi obtida foi de apenas 1 µm, o que deixou a equipe frustrada, já que os microscópios opticos de ponta, conseguiam obter resoluções de 0,5 µm.
Uma série de mudanças foram feitas no período, com o propósito de se conseguir foto com resoluções menores pelo equipamento, dentre elas foram diminuídas o diâmetro do feixe de elétrons e melhorias na parte eletrônica, principalmente com relação sinal-ruído com o uso de elétron-multiplicadora, e a substituição de lentes eletrostática por lentes eletromagnéticas permitiu captar imagens com resolução de 25 nm e em 1965 foi desenvolvido o primeiro MEV comercial pela Cambridge Scientific Instrument.
4.2 Princípio de funcionamento Elétrons secundários (“Secondary Electron” - SE)
 Os elétrons secundários no microscópio eletrônico de varredura resultam da interação entre o material a ser estudado e o feixe eletrônico. Apesar dessa interação, a definição em si de elétron secundário é praticamente numérica, tal que elétrons emitidos com energia inferior a 50 eV recebem esta classificação, e produzem imagens com alta resolução entre 3 e 5 nanômetros. O contraste na imagem é gerado pelo relevo da amostra, que é inclusive, o principal modo de formação de imagem no MEV. 
Os elétrons secundários, gerados pelas interações elétron-átomo da amostra possuem um livre caminho médio de 2 a 20 nm, por isso, apenas aqueles gerados junto a superfície da amostra podem ser reemitidos para os detectores do equipamento.
4.3 Elétrons retroespalhados (“Backscattering Electron”- BSE) 
Os elétrons retro espalhados, assim como secundários, apresentam está definição de acordo com a energia que acumulam que varia entre 50eV até o valor da energia do elétron primário. Por possuírem muita energia, próxima a dos elétrons primários, sofrem espalhamento elástico e, portanto, são os que formam a maior parte do sinal ERE. 
Os elétrons retro espalhados de alta energia, são produtos diretos de colisões entre a superfície da amostra e o feixe de elétrons, logo fornecem apenas imagens do exterior da amostra. Já os sinais de BSE é produto das interações ocorridas em camadas mais profundas da amostra e provenientes de uma região do volume de interações. A imagem gerada pelos elétrons retroespalhados e secundários fornecem diferentes informações em relação ao contraste que apresentam.
Figura 11 - Ilustração do esquema de interação entre elétrons e amostra.
Fonte 13 - Adaptado de KESTENBACH, 1994.
4.4 Preparação de amostras 
Para a preparação da amostra, são realizadas algumas etapas para que o material a ser estudado apresente um ambiente propício para se obter as melhores imagens, e obviamente, realizar uma boa análise do material. Com o objetivo de facilitar a visualização, foi criado um fluxograma meramente ilustrativo que indica quais são as etapas necessárias para se preparar a amostra para a análise.
Figura 12: Fluxograma de etapas de preparação da amostra para análise no MEV.
Fonte 14 - Autoria própria.
A primeira etapa do preparo das amostras é o corte e manuseio, onde para se ter uma visualização mais fiel á realidade da amostra, é importante que nessa etapa do processo de preparação de amostras que o manuseio seja extremamente cauteloso para evitar qualquer tipo de danos a amostra. O corte realizado deverá ser grande, isto é, o corte deverá deixar a amostra com dimensão mínima. No geral, o tamanho da amostra a ser analisada varia de acordo com cada equipamento, entretanto recomenda-se que as amostras apresentem diâmetros inferiores a 200mm, já que com tamanhos maiores podem limitar o movimento da plataforma de posicionamento da amostra.
A segunda etapa do preparo de amostras é a estabilização da amostra, por meio de fixação química, sem alterar características física da amostra ao mesmo tempo que as torna condutoras de eletricidade. Nessa etapa do processo, o fixador é alterado deacordo com as necessidades da amostra, isto é, seu pH, sua molaridade e sua concentração variam de acordo com o material a ser analisado. Geralmente a amostra permanece submersa no estabilizador por horas e até dias, dependendo do material.
Após a estabilização (fixação da amostra), a amostra é desidratada com algum solvente orgânico, geralmente sendo este álcool etílico ou acetona, que posteriormente são substituídos por gás carbônico liquefeito, na câmara do aparelho de ponto crítico. O gás carbônico líquido é aquecido de maneira gradual até passar completamente para a fase gasosa. O gás expande dentro da câmara e, essa expansão, faz a pressão subir até acima de sua pressão crítica, correspondente a 73 atm. Durante essa transição, a densidade da fase líquida se iguala à densidade da fase gasosa. Assim, a tensão superficial é zero e o espécime é seco sem a ultrapassagem de nenhum limite de fases. Após à despressurização lenta da câmara até à pressão atmosférica, o espécime é removido seco da câmara, sem alterações em sua forma.
Posteriormente a amostra é montada no “stub”, e posicionada considerando a melhor orientação em relação ao feixe de varredura e o coletor de elétrons secundários. Posteriormente a montagem, será realizado a cobertura da amostra com uma fina camada de metal, para que haja um aumento na condutividade da superfície da amostra , este metal tem de ser um metal bastante condutor, geralmente opta-se pelo ouro ou ao ouro-paládio. A deposição do metal ocorre pelo método de “sputtering”. Terminada o processo de metalização, a amostra está pronta para ser visualizada no MEV.
O processo de conservação de amostra é opcional, normalmente opta-se por realizar a análise da amostra assim que o processo de deposição do metal estiver finalizado, entretanto caso seja necessário pode-se realizar a conservação da amostra que consiste basicamente em guarda-las em um dissecador.
4.5 Exemplos de imagens de amostras obtidas por MEV
Para exemplificar a utilização do microscópio eletrônico de varredura na observação de superfícies metálicas e superfícies semicondutoras serão apresentados alguns exemplos. A Figura 13 mostra uma imagem obtida na análise de microscopia eletrônica de varredura utilizando a técnica de Elétrons Secundários para determinação de morfologia de uma amostra.
Figura 13 - Exemplo de imagem obtida com MEV - Morfologia (Elétrons Secundários -SE).
Fonte 15 - Laboratório de Caracterização Tecnológica (LCT-EPUSP).
 
Na Figura 14, foi obtido por meio de análises de Microscopia eletrônica de varredura a imagem da superfície de um aço inoxidável AISI 316, cuja sua concentração conta com 2,5% de molibdênio em sua composição, no início do processo de corrosão. Neste caso em específico a amostra apenas foi cortada, limpa e seca em estufa para remover e evitar retenção de umidade nos poros causados pela corrosão.
Figura 14 - Imagem obtida por MEV de uma superfície de aço inoxidável AISI 316 no início do processo de corrosão.
Fonte 16 - (Dedavid, B;Gomes, C; Machado, G. Microscopia Eletrônica de varredura - Aplicações e preparação de amostras, pg. 54).
A Figura 15 apresenta a identificação de minerais por Backscattering, de modo qualitativo, onde por meio do contraste de número atômico, é possível associar a imagem gerada com um tipo de minério utilizando o Microscópio Eletrônico de Varredura.
Figura 15 - Identificação de minerais por BSE (Backscattering - contraste de número atómico).
Fonte 17 - Laboratório de Caracterização Tecnológica (LCT-EPUSP).
5. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO – MET
5.1 Histórico
Em 1858, Plucker constatou que o desvio de elétrons era possível com a utilização de campos magnéticos. Em 1981, foi admitido por Riecke que os raios catódicos podiam ser focados por campos magnéticos, o que permitia o uso de lentes simples. Posteriormente essa teoria foi confirmada por Hans Busch com seu trabalho publicado em 1926, que mostrou que as equações aplicadas á ótica, caso fossem admitidos pressupostos, ser aplicada também a elétrons.
Apesar disto, ainda não se conheciam completamente o comportamento dos elétrons, acreditando-se que se tratava de partículas carregadas de matéria. No ano de 1924 foi publicado um trabalho “Broglie Hypotesis” que viria a mudar este conceito da época, já que Broglie afirmou que partículas podem atuar como ondas e em 1927, Davisson e Germer realizavam experimentalmente a difração de elétrons, que confirmavam a afirmação de Broglie. O avanço da Microscopia eletrônica de transmissão possibilitou o estudo de micro-regiões da ordem de 1 micrômetro por difração de elétrons. 
Em 1932, foi sugerido por Ruska, a construção de um novo microscópio eletrônico para visualização direta de amostras inseridas no microscópio. Com este dispositivo e a amostra sobre uma folha de alumínio, conseguiu tanto uma imagem difrativa como uma normal da amostra. Durante esse período o interesse público no projeto do microscópio eletrônico aumentou, já que outros grupos estavam ajudando no avanço tecnológico do MET, tais como os de Albert Prebus e James Hilljer, autores do primeiro MET, como mostra a Figura 16, dos Estados Unidos da América em 1938.
Figura 16 - O primeiro MET, originalmente instalado no I.G. Farben-Werke.
Fonte 18 - Wikipédia
Durante a segunda guerra mundial, houve um retrocesso no que se refere ao processo de aprimoramento do microscópio eletrônico de varredura, já que durante a guerra, um bombardeio aéreo destruiu os laboratórios da Siemens, onde os pesquisadores trabalhavam, e houve uma baixa de pesquisadores no local.
Depois da Segunda Guerra Mundial, Ruska voltou a ativa na Siemens, onde acabou por construir o primeiro microscópio capaz de ampliações na ordem de cem mil vezes. A primeira conferência internacional sobre o tema de Microscopia eletrônica de Transmissão foi organizada em 1942.
A Tabela 3 descreve algumas características principais das técnicas de microscopia vistas até o presente momento no trabalho.
Tabela 3 - Algumas das características dos tipos de microscopia.
	Característica
	M.O
	M.E.V
	M.E.T
	Tensão de aceleração (kV)
	X
	3 a 50
	50 a 1000
	Faixa útil de aumento
	1 a 3.000 X
	10 a 50.000X
	1.000 a 3.000.000X
	Resolução (Angstrom)
	3.000 Å
	30 Å
	3 Å
	Profundidade de foco com 1000X
	0.1 µm
	100 µm
	10 µm
	Densidade máxima de discordâncias medida (cm/cm³)
	105 (Cavidades de corrosão)
	106 (Cavidades de corrosão)
	1012 (lâmina fina)
.
Fonte 19 - Adaptado de PADILHA.
5.2 Princípio de funcionamento
O microscópio eletrônico de transmissão consiste de um conjunto de lentes eletromagnéticas e um feixe de elétrons, que são controlados pelas lentes, dispostos em uma coluna com uma pressão de 0,00005 mmHg, como mostra a 
Figura 17.
Figura 17 - Disposição de componentes óticos em um MET básico.
Fonte 20 - Wikipédia
No geral, um microscópio eletrônico de transmissão possui entre 5 e 6 lentes magnéticas, além de várias bobinas eletromagnéticas de deflexão e aberturas localizadas ao longo do caminho que o feixe eletrônico percorre. Dentre os componentes, vale destacar os três seguintes devido sua importância com a difração eletrônica: lente objetiva, abertura objetiva e abertura seletiva de difração.
Os elétrons passam da amostra para o microscópio pela superfície inferior com uma distribuição de intensidade e direção controladas. Em seguida, a lente objetiva, forma a primeira imagem desta distribuição angular dos feixes difratados. Com a finalização desta etapa, as lentes restantes servem como ferramentas de aumento de imagem ou diagrama de difração para uma possível observação no monitor ou chapa fotográfica. A imagem gerada é uma projeção bidimensional da amostra, em campo claro ou escuro, ou ainda de difração de elétrons, dependendo do modo de operação do equipamento.
Por mais que existam aparelhos de MET com capacidade de tensão de aceleração de elétrons com capacidade de 1000 kV, a tensão de aceleração depende do tipo de material utilizado nos estudos. No geral para estudos de materiais inorgânicosutiliza-se aceleração de até 200 kV e para materiais orgânicos naturais na faixa entre 60 kV e 80 kV.
5.3 Preparação de amostras
A preparação das amostras para análise no Microscópio Eletrônico de varredura não é um processo simples ou fácil. A amostras do MET devem ser cortadas ter de espessura entre 500 nanômetros (Equivalente a 5000 Angstrom), a 50 nanômetro (Equivalente a 500 Angstrom), caso ultrapassem esse tamanho a radiação de nêutrons ou de raios X podem interagir rapidamente com o material e alterar suas propriedades físicas para estudo. O tamanho máximo do corte e a tensão de aceleração dos elétrons variam de acordo com cada tipo de material e suas propriedades físicas como mostra a Tabela 4.
Tabela 4 - Espessura máxima transmissível a elétrons acelerados com uma tensão de 100 kV para diversos elementos.
	Elemento
	Número Atômico
	Densidade (g/cm³)
	Espessura Máxima de corte (Å)
	Carbono
	6
	2,26
	>5000
	Alumínio
	13
	2,7
	5000
	Cobre
	29
	8,96
	2000
	Prata
	47
	10,50
	1500
	Ouro
	79
	19,30
	1000
Fonte 21 - PADILHA, (MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO, pg 3).
Após a realização do corte, a amostra deverá ser polida e limpa nos dois lados e durante esta etapa a amostra não deve ter suas características físicas alteradas, por exemplo, por meio de deformações plástica ou difusão de hidrogênio.
Antes de se realizar a análise do material em sí, deve ser preparado alguns corpos de prova e estes podem ser de dois tipos: lâminas finas do próprio material ou réplicas de sua superfície. 
O preparo de lâminas finas de metais e ligas seguem a seguinte sequência: corte de lâminas de 0,8 a 1,0 mm de espessura, afinamento por polimento mecânico até 0,10-0,20 mm de espessura e polimento eletrolítico final. As lâminas finas de materiais poliméricos e de outros materiais orgânicos são obtidas por microtomia, onde uma navalha corta películas finas e com espessura controlada. Em geral, o material orgânico é resfriado em nitrogênio líquido (ultramicrotomia) para minimizar a deformação durante o corte. 
O afinamento final das lâminas de materiais cerâmicos é geralmente feito por desbaste iônico. Três tipos de réplica são normalmente utilizados para obtenção de amostras de MET: de plástico, de carbono e de óxido. evapora e deixa um filme, que pode ser retirado e que representa o "negativo" da superfície. Na réplica de carbono, este material é evaporado na superfície da amostra. Esta técnica pode ser utilizada também para arrancar partículas de precipitados da amostra, a chamada réplica de extração. Na réplica de óxido, usada principalmente para ligas de alumínio, o filme de óxido é obtido por anodização de uma superfície previamente polida eletroliticamente. Nos três tipos de réplica, o contraste tem origem nas variações de espessura. No caso de partículas extraídas, um contraste adicional aparece, pois as partículas, se forem cristalinas, difratam elétrons.
5.4 Exemplos de imagens de amostras obtidas por M.E.T
No MET a imagem que se é observada é a projeção de uma determinada espessura do material, havendo uma diferença com relação ao observado numa superfície. O contraste nas imagens formados no Microscópio Eletrônico de Transmissão tem diversas origens, tais como diferença de densidade, diferença de espessura ou de coeficiente de absorção de elétrons, difração e campos elásticos de tensão.
Em um estudo realizado com o microscópio eletrônico de transmissão, foram estudadas falhas nas estruturas do retículo cristalino em escala atômica, como mostra a Figura 19. 
Figura 18 - Micrografia de transmissão de elétrons de deslocamentos, os quais são falhas na estrutura do retículo cristalino na escala atômica.
Fonte 22 – Adaptado de Wikipédia.
Em outro estudo de caso utilizando-se o microscópio eletrônico de transmissão, foi observado a estrutura celular interna das células do carcinoma adenoide cística (CAC), que é basicamente é uma neoplasia (nódulo) maligna de glândula salivar, como demonstra a Figura 20. 
Figura 19 - Estrutura celular interna das células do carcinoma adenoide cística.
Fonte 23 - Wikipédia.
6. MICROSCOPIA DE ENERGIA DISPERSIVA - EDS
6.1 Finalidade 
A espectroscopia de raios X com dispersão de energia (XEDS, EDS ou EDX) é uma técnica analítica usada para a caracterização química de uma mostra. A técnica pode ser usada para determinar a composição Elemental de pontos individuais ou para mapear a distribuição de elementos em uma área específica. Por trabalhar com áreas ou pontos específicos, pode ser usada para obter informações sobre a composição de partículas específicas, morfologia ou isolar áreas específicas com filtros ou em depósitos. 
A técnica de EDS tem uma alta capacidade analítica que pode ser combinada com outras técnicas para aumentar seu escopo de aplicações, dentro destas combinações de técnicas destacam-se as combinações entre EDS e microscopia eletrônica de escaneamento (SEM) ou Microscopia eletrônica de transmissão e escaneamento (STEM).
6.2 Princípio de funcionamento 
A técnica de microscopia de energia dispersiva (EDS) utiliza os raios x que são emitidos da amostra durante o bombardeamento de elétrons para caracterizar a composição Elemental da amostra em volume numa escala de micrometros ou nanômetros.
Na técnica, um raio de elétrons é emitido por toda a superfície da amostra e gera Fluorescência de raios X pelos caminhos dos átomos. A energia dos raios X característicos gerados, é consequência dos elementos que a produzem. O equipamento de energia dispersiva, utiliza um detector que mede o a quantidade de raios X emitidos e compara com a energia dos raios x gerados pela amostra, e então compara com os raios X característicos de cada tipo de elemento químico conhecido.
A técnica de EDS pode tanto ser usada para determinação de quais elementos químicos estão presentes na amostra (análise qualitativa), quanto estimar suas abundancias relativas (análise quantitativa). 
A primeira etapa para analisar uma amostra cuja concentrações e elementos presentes são desconhecidos é a análise qualitativa. Comumente os elementos em maior quantidade (considera-se acima de 10%) na amostra são identificados com elevada precisão, entretanto quando os elementos estão presentes em quantidades pequenas (entre 1 e 10%) ou apenas quantidades traços (inferior a 1%), erros de interpretação podem ocorrer em consequência das interferências.
Antes de efetuar a análise quantitativa, é necessário que se tenha efetuado uma análise qualitativa muito criteriosa para identificar os constituintes presente na amostra, já que por mais criteriosa que tenha sido a análise quantitativa da amostra, o método perde toda sua validade se os elementos não tiverem sido avaliados adequadamente. Na análise quantitativa, a concentração de um tipo específico de elemento presente na amostra é medida de acordo com a intensidade dos picos. Já que cada elemento tem uma única estrutura atômica, que permite um tipo específico de pico em sua emissão eletromagnética no espectro. A possibilidade de determinar a composição química a nível micrométrico é a grande vantagem da análise por energia dispersiva
6.3 Preparação da amostra
Neste caso específico do trabalho, por estarmos falando sobre Microscopia de Energia Dispersiva (EDS), e as amostras teoricamente são analisadas em um microscópio eletrônico, a preparação da amostra para EDS é preparada do mesmo modo como as amostras são preparadas para a técnica de microscopia eletrônica de varredura (MEV) descrita no item 4.4 Preparação de amostras
6.4 Exemplos de imagens obtidas de amostras com a técnica EDS
Diferente das técnicas anteriores, as imagens obtidas por Microscopia de Energia Dispersiva (EDS), são na verdade gráficos com picos. Estes picos, representam a concentração de cada composto encontrado na amostra, sendo proporcional a quantidade presente.
Á figura 21, apresenta uma análise qualitativa e quantitativa de uma hélice de barco danificada.
Figura 20 - Análise Qualitativa e Quantitativa de uma hélice de barco danificada.
Fonte 24 - Department ofMechanical Engineering, Institut Teknologi Nasional.
Após ter sido realizado o corte e ter sido submetida a análise qualitativa para a identificação dos componentes presentes na amostra, por meio da análise quantitativa foi evidenciado que a composição química da hélice do barco consistia de 6,5% Si, 0,16% Fe, 0,8% Cu, 0,2% Mn, 0,3% Mg, 1,2% Zn.
7. CONCLUSÃO
Concluímos que de modo geral, o surgimento de cada técnica foi impulsionado pela necessidade humana de se obter resultados mais precisos em conjunto com o aprimoramento dos conhecimentos da ciência da natureza em cada época, somando-se com as limitações das técnicas previamente desenvolvidas. A cada nova técnica desenvolvida, conhecimento foi adquirido, interpretado e aplicado pela humanidade, o que possibilitou a criação de novas ciências e impulsionou outras, tais como ciência dos materiais e microbiologia. 
Dentre as técnicas descritas neste trabalho, diferente do que se é dito, não é possível afirmar que uma técnica de microscopia é superior as outras e pode ser aplicada em todos os casos , isto é, a escolha da técnica de microscopia mais adequada para a caracterização tecnológica de materiais tem de estar alinhada com o tipo de informação que se deseja obter do exemplar. De modo simplificado, cada técnica tem tanto seu escopo de aplicação quanto limites bem definidos.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 
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