Imuno Clínica - Biologia Molecular em Imunologia - PCR Ray

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Imunologia Clínica
Biologia Molecular em Imunodiagnóstico:
 reação em cadeia da Polimerase
Professor: Raimundo Nonato Faria
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Seções
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Elementos gráficos, tabelas e gráficos
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Definições
DNA (Ácido desoxirribonucleico): estrutura no qual é armazenada a informação genética de um organismo.
RNA (Ácido ribonucleico): em eucariotos, é um intermediário que atua ativamente no fluxo de informações do DNA no processo de expressão genética.
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Ácidos Nucléicos
O DNA e o RNA são polímeros lineares classificados como ácidos nucléicos.
O DNA se apresenta como dois filamentos unitários, formando uma dupla hélice.
O RNA é uma fita simples. Embora ele seja um instrumento para expressar proteínas, alguns vírus o utilizam como material genético.
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Ácidos Nucléicos – Estrutura
Os ácidos nucléicos (DNA e RNA) são formados por unidades fundamentais denominadas nucleotídeos.
Os nucleotídeos possuem um arcabouço fixo, formado por um grupo fosfato e um açúcar (pentose).
Além disso, há uma base nitrogenada que vai diferenciar os nucleotídeos. Existem 4 diferentes bases nitrogenadas tanto para DNA como RNA.
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Nucleotídeos – Fosfato
O fosfato é um grupamento inorgânico que permite ligações químicas.
Nos ácidos nucléicos, ele serve como elo entre as pentoses, formando o arcabouço fixo da estrutura.
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Nucleotídeos – Pentoses
RNA
DNA
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Nucleotídeos – Ligação fosfodiéster
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As bases nitrogenadas podem ser classificadas:
Purinas: possuem dois anéis em sua estrutura
Adenina (A)
Guanina (G)
Pirimidinas: possuem 1 anel em sua estrutura
Timina (T) exclusiva do DNA
Uracila (U) exclusiva do RNA
Citosina (C)
Nucleotídeos - Bases Nitrogenadas
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Nucleotídeos - Bases Nitrogenadas
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Nucleotídeos - Resumo
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Ácidos Nucleicos – Pares de Bases
A chave para a estrutura da dupla fita de DNA são os denominados pares de bases.
Em 1950 foi descoberto por Watson e Crick que estes pares de base são específicos, e mantidos por pontes de hidrogênio.
Adenina e timina (A-T): duas pontes de hidrogênio
Guanina e Citosina (G-C): três pontes de hidrogênio
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Ácidos Nucleicos – Pares de Bases
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Ácidos Nucleicos – Pares de Bases
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Ácidos Nucleicos – Pares de Bases
Além da estrutura do DNA, a especificidade das bases nitrogenadas são importantes para outras funções celulares, como a replicação do DNA ou formação de uma fita complementar de RNA.
Se submetido à altas temperaturas (> 90ºC), ocorre a desnaturação do DNA, ou seja, a separação das fitas de DNA por quebra das pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas.
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Reação em Cadeia da Polimerase
O PCR é uma técnica desenvolvida em 1980 por Kary Mullis (Nobel em 1993).
O método tem função de amplificardeterminado segmento do DNA ou gene (na ordem de 1 bilhão de vezes), isto garante alta sensibilidade analítica.
A partir do PCR, houve grande desenvolvimento da clonagem e sequenciamento do DNA (Projeto Genoma Humano).
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Reação em Cadeia da Polimerase
Com o PCR, foram desenvolvidas outras técnicas como:
RT-PCR: RT é referência à enzima trasncriptase reversa, que permite a amplificação de RNA (importante em diagnóstico de vírus).
RAPID (random amplification of polymorphic DNA): relação epidemiológica e filogenética entre indivíduos.
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PCR em Imunologia
A amplificação genética permitiu o desenvolvimento de métodos imunológicos.
São especialmente importante em doenças em que a cultura microbiana é difícil ou de crescimento lento.
Ensaios que demoravam dias para terminar, passaram a ser concluídos em horas.
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PCR em Imunologia
Como a sensibilidade analítica do método é muito alta (amplificação na ordem de bilhão de vezes), é possível detectar a doença em pacientes em que a carga do agente etiológico é muito baixa.
Isto torna-se especialmente importante na fase da janela imunológica, sendo que o PCR consegue identificar algumas infecções em que outros métodos falham.
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PCR em Imunologia
As principais aplicações do PCR em imunologia são:
Kits para detecção de doença: HIV, HPV, CMV, hepatites B e C, além de outras infecções bacterianas, fúngicas e por protozoários, além de neoplasias.
Produção de antígenos recombinantes: quando utilizada em conjunto com técnicas de DNA recombinante (amplificação de genes que codificam proteínas, que depois serão inseridos em vetores de expressão). 
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PCR – Funcionamento
A amostra do paciente, que pode conter o DNA do agente pesquisado, é adicionado em uma solução que contém:
Desoxinucleotídeos: matéria-prima para síntese de DNA; 
Dois diferentes primers: são fragmentos de DNA que indicam onde começa e termina a polimerização.
taq-DNA polimerase: é uma enzima de polimerização de DNA termo resistente;
Tampão com magnésio.
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Termociclador
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Reação em Cadeia da Polimerase
1ª Etapa (94ºC) Desnaturação: ocorre o rompimento das pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas, e desta forma, há a desnaturação do DNA.
2ª Etapa (56ºC) Hibridização ou anelamento: Os primers específicos pareiam com as fitas de DNA molde, no local de início e término da região a ser copiada.
Para evitar a renaturação do molde, é necessário colocar os primers em altíssima concentração em relação ao DNA molde.
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Reação em Cadeia da Polimerase
3ª Etapa (72ºC) Polimerização ou extensão: Esta é a temperatura ideal de para a atividade da enzima taq-DNA polimerase, que copia as fitas molde a partir dos primers previamente pareados.
Estas etapas são repetidas de 30 a 35 vezes. 
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Reação em Cadeia da Polimerase
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Reação em Cadeia da Polimerase
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Reação em Cadeia da Polimerase
PCR convencional:
A análise é em geral considerada qualitativa.
É retirada uma alíquota da solução final e transferida para um gel de agarose.
Após separação eletroforética, é possível fazer a leitura dos resultados.
Pela necessidade de transferir os amplicons para o gel, há maior risco de contaminação. 
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Reação em Cadeia da Polimerase
PCR em tempo real:
Além dos reagentes utilizados no PCR convencional, são adicionados fluorocromos em cadeias de DNA na fase de amplificação.
Um sistema detector de fluorescência é acoplado ao termociclador.
Como o tubo não precisa ser aberto para transferência ao gel de agarose, o risco de contaminação é menor.
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Reação em Cadeia da Polimerase
PCR em tempo real:
A detecção de fluorocromos permite o monitoramento da detecção, quantificação e amplificação do DNA durante a fase exponencial do PCR.
A análise é consideradaqualitativa e quantitativa, além de apresentar maior sensibilidade, reprodutibilidade e precisão em relação ao PCR convencional.
Atualmente existem métodos 100% automatizados do PCR em tempo real.
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Muito Obrigado!!
Microsoft Excelência em Engenharia
Confidencial da Microsoft
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