APOSTILA - COLETA E COLORAÇÃO CITOL ONCOLOGICA

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Coleta e Coloração – Citologia Oncótica
 Profª Anna Carolina R Duarte
A ciência que estuda as células esfoliadas, natural ou artificialmente é denominada Citologia. Este estudo pode ser utilizado como método para avaliarmos a normalidade ou o estado patológico de um órgão ou tecido (Citopatologia). A citopatologia abrange os exames de citologia oncologica (oncotica ou papanicolaou) e citologia hormonal (endócrina ou funcional)
Em 1943, Dr. George Nicholas Papanicolaou e outros colaboradores publicaram nos Estados Unidos, um trabalho científico, onde observaram a presença de células cancerosas ou malignas em esfregaços obtidos de amostras do colo uterino com tumores malignos, sendo que algumas destas pacientes não apresentavam qualquer suspeita clínica. Desta forma o exame ou teste foi consagrado com um instrumento adequado na detecção e prevenção do câncer.
Objetivos da citologia oncologica: Triagem (screening) populacional (negativo, suspeito, positivo para células neoplasicas malignas), Objetivos de diagnostico, Objetivos de monitoramento terapeuticos (radio e quimioterapia, cauterização)
Objetivos da citologia hormonal: Avaliação indireta qualitativa e semi-quantitativa da função ovariana e/ou dos hormônios esteróides através de índices citológicos que são obtidos de um estudo citomorfológico de células epiteliais descamadas de epitélios hormonio-dependentes.
A citologia oncologica ou exame de prevenção ou papanicolaou ou exame citológico ou colpocitologico pode ser realizada em qualquer tipo de material biológico que contenha células epiteliais descamadas de forma natural (derrames) ou artificial (esfoliação, lavado, escovado e punção) de um tecido e com a sua morfologia conservada (fixada).
I - TIPOS DE AMOSTRA OU DE MATERIAIS BIOLÓGICOS PARA O EXAME DE CITOLOGIA ONCOLÓGICA
1) Esfoliação de tecidos cervico-vaginais - Material da Vagina e/ou Colo uterino (ectocervix e endocervix)
2) Esfoliação de tecido das mamas (Secreção Mamária ou Punção de Nódulos)
3) Esfoliação de tecidos do trato urinário (Urina ou Lavado Vesical)
4) Derrames cavitários (Liquido Pleural, Ascítico e Sinovial).
5) Esfoliação, Lavado e Escovado de tecidos do trato respiratório (Escarro, Lavado e/ou Escovado Brônquico).
6) Lavado e escovado de tecidos do trato digestivo (Suco gástrico, Lavado ou escovado gástrico, esofágico e colonico).
7) Liquor
8)Punção de Tireóide
9) Punção de Cistos
II - IMPORTÂNCIA DOS DADOS CLÍNICOS
	DADO CLINICO
	IMPORTÂNCIA PARA O EXAME DE CITOLOGIA ONCOLOGICA
	IDADE
	 Demonstra os graus de risco de uma paciente com relação a infecções e câncer e o possível perfil hormonal (reprodutivo ou menopausa)
	D.U.M. /MENOPAUSA/ GESTAÇÃO/LACTAÇÃO (MARCAR O PERÍODO)
	 Demonstra o perfil hormonal da paciente e sua relação com os tipos celulares a serem visualizados no exame
	CIRURGIAS GINECOLÓGICAS (HISTERECTOMIA TOTAL OU PARCIAL)
	 Demonstra possíveis cirurgias pôr tumores malignos ou benignos e controle de tratamento, tipos celulares que poderão estar ausentes e ajuda muito durante a coleta do material.
	USO DE MEDICAÇÃO HORMONAL E/OU TERAPIA DE REPOSIÇÃO HORMONAL (TRH)
	 Demonstra possíveis alterações nos tipos celulares com relação à condição clinica da paciente e o uso destas medicações
	DATA DO ULTIMO EXAME DE C.O.
	Demonstra possíveis exames para controle terapêutico de infecções, lesões suspeitas ou câncer.
III - PREPARO PRÉVIO DA PACIENTE PARA AS COLETAS DE CITOLOGIA ONCOLÓGICA CERVICO-VAGINAL
Este preparo é necessário para que a colheita não sofra interferências na sua qualidade e quantidade do material colhido, refletindo diretamente na qualidade do diagnostico citomorfológico.
1)PACIENTE NÃO DEVE COLHER O EXAME DURANTE O SEU PERIODO MENSTRUAL 
Um material excessivamente hemorrágico dificulta uma boa visualização do quadro citomorfológico. Deve-se tomar o cuidado para não confundir com quadros de metrorragias, onde neste caso a colheita deve ser realizada.
2) NO DIA ANTERIOR AO EXAME À PACIENTE NÃO PODE FAZER USO DE DUCHAS VAGINAIS OU QUALQUER TIPO DE HIGIENE INTÍMA.
Estes procedimentos dificulta o diagnóstico de possíveis agentes infecciosos, devido a sua retirada temporária.
3) NÃO USAR MEDICAMENTOS VAGINAIS (ÓVULOS, CREMES OU SUPOSITÓRIOS) DURANTE NO MINIMO 48 HORAS ANTES DO EXAME.
Estas medicações interferem na coloração dos esfregaços, criando artefatos técnicos e diminuem a flora vaginal, principalmente os agentes infecciosos.
4) ABSTINÊNCIA SEXUAL (COITO VAGINAL) NO MINÍMO 24 HORAS ANTES DO EXAME.
Interferência do sêmen (liquido seminal + espermatozóides) na coloração e no conteúdo esfregaço, e a paciente geralmente após um ato sexual irá realizar uma higiene intima.
IV - COLHEITA DO MATERIAL CÉRVICO-VAGINAL
Na sala de colheita devemos ter os seguintes materiais: espéculos de tamanhos variados e esterilizados (metal), espátula de ayre, escova endobrush, lâminas, fixador (liquido ou spray), gazes, recipientes para o transporte das lâminas, luvas (látex ou plástico), mesa ginecológica, foco e papel lençol.
Deve-se conseguir um relaxamento da paciente com bons diálogos e ser o mais delicado possível com a mesma, principalmente durante a colocação do especulo e coleta.
Explicar a paciente cada etapa do exame e comunicar o que ela poderá vir a sentir (desconforto, dor, vergonha).
Confirmar dados clínicos mínimos para um bom exame citológico: idade e data da última menstruação (d.u.m.).
Questionar a paciente se possuem atividade sexual, ou se já realizou algum tipo de cirurgia ginecológica (histerectomia ou períneo), dados importantes antes da colocação do especulo.
A)POSICIONAMENTO DA PACIENTE NA MESA GINECOLOGICA:
Paciente deve ser colocada na posição ginecológica ( posição litotomica): coxas acentuadamente fletidas sobre a bacia, os joelhos afastados, enquanto os pés ou as dobras dos joelhos apóiam-se em suportes especiais existentes na mesa.
Tomar o cuidado de deitar a paciente de forma que a borda das nádegas se situe ligeiramente para fora da mesa; para facilitar o acesso ao canal vaginal.Cobrir com lençol as coxas e joelhos da paciente. Os braços devem ficar estendidos do lado de fora ou cruzados sobre o tórax, nunca sobre a cabeça (contração de músculos abdominais).
Focalizar a iluminação do foco para a púbis da paciente
B) COLOCAÇÃO DO ESPÉCULO
 Vestir as luvas antes de iniciar este procedimento
Utiliza-se geralmente o especulo de duas valvas ou lâminas (especulo de collin), os quais podem ser de metal ou plástico (descartáveis).Convém sempre se familiarizar com a maneira de abrir e fechar as lâminas do especulo. Escolha um especulo de tamanho apropriado, geralmente podemos utilizar especulo de tamanho pequeno para as pacientes nulíparas ou que não tiveram parto vaginal (normal), ou em mulheres muito magras ou em menopausadas, e especulo grande para as pacientes multíparas ou obesas.
A colocação de um especulo no máximo pode ser desconfortável para a paciente, no caso de sensação de dor ou de muito ardor pode significar um processo inflamatório nas paredes vaginais.
Os grandes e pequenos lábios, juntamente com os pêlos pubianos devem ser afastados com a mão esquerda, expondo a abertura vaginal. Evitando-se que o especulo puxe os pêlos pubianos ou belisque os lábios
O especulo com as laminas fechadas e com a borboleta ou parafuso voltado para a direita e lateralmente (posição vertical) deve ser introduzido em um ângulo de 45 graus para baixo, com uma pressão exercida em direção a parede vaginal posterior.
Após o especulo ter penetrado no canal vaginal, rodar as laminas para uma posição horizontal, borboletas voltadas para a esquerda e para baixo e começar abri-lo de forma lenta, separando as paredes vaginais, expondo o colo uterino (cervix uterina).
 Caso haja dificuldade em visualizar o colo, retirar o especulo ligeiramente e posicioná-lo de modo mais anterior.
C) COLHEITA DO MATERIAL
Caso nocolo uterino haja uma grande quantidade de secreção, tirar o excesso com o auxilio de gazes, evitando-se um esfregaço muito espesso e com grande quantidade de exsudato inflamatório (leucócitos).
- COLETA ECTOCERVICAL ----> a extremidade chanfrada da espátula de ayre deve ser encaixada no orifício do colo e fazer um giro completo de 360 graus, raspando toda região da junção escamocolunar (j.e.c.).A presença de “feridas” (ectropico ou zona de transformação) pode originar pequenos sangramentos durante a coleta 
- COLETA VAGINAL -----> com a extremidade arredondada da espátula de ayre raspar as paredes vaginais ou coletar do fundo de saco vaginal posterior
A coleta ectocervical e vaginal em casos muito excepcional pode ser realizada com auxilio de um abaixador de língua, mas não e o indicado.
- COLETA ENDOCERVICAL -----> a escova endobrush de ser introduzida no orifício do colo uterino, atingindo desta forma o canal endocervical, através de movimentos rotatórios obter o material. Pode haver um pequeno sangramento (epitélio colunar simples).
O uso de swab com extremidades de algodão, não e aconselhado por dois motivos: escassez na celularidade e contaminação do esfregaço com fibras de algodão.
RETIRADA DO ESPÉCULO VAGINAL
Fecha-se as laminas do especulo e faz-se a sua retirada do canal vaginal, ESTE PROCESSO SOMENTE DEVERA SER REALIZADO AO FINAL DA FIXAÇÃO DOS ESFREGAÇOS
V - CONFECÇÃO DO ESFREGAÇO
O material colhido destas regiões (ecto, endocervix e vagina) devem ser delicada e de forma homogeneamente espalhados sobre a superfície de uma lâmina em áreas diferentes, em sentido longitudinal. Evitando-se os movimentos de vai e vem ou rotatórios.
Deve também ser evitado material em grande quantidade espalhado em pequenas áreas (esfregaços espessos), e material escasso, difusamente espalhado pela lamina (esfregaços ralos).
O esfregaço ideal apresenta uma camada de material algo transparente, homogeneamente distribuído, evitando conglomerado de células em áreas diferentes.
Em pacientes menopausadas (epitélio atrofico), podemos utilizar uma espátula umedecida com solução fisiológica que facilita e aumenta a esfoliação das células.
VI - FIXAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DO MATERIAL
Os bons fixadores são aqueles que preservam fielmente os componentes celulares, penetrando no interior das células aumentando a sua corabilidade (desidratação e desnaturação do protoplasma). Os fixadores utilizados nos esfregaços cervico-vaginais são: álcool 95% , fixadores de camada (polietileno glicol + álcool etílico------> spray).
A fixação deve ser imediata, após no mínimo 15 minutos o material já esta pronto para ser corado. Os materiais que são fixados no ar irão prejudicar em muito a análise citomorfologica, devido à degeneração nuclear e citoplasmática, com perda da diferenciação nuclear e citoplasmática.
O material apos a sua fixação deve ser identificado com o nome da paciente, número de registro, idade e d.u.m.
Falhas mais freqüentes de coleta cervico-vaginal
•Colo uterino não visualizado durante a coleta
•Raspagem cervical insuficiente
•Zona Transformação ou Junção escamo colunar não raspada
•Espalhamento muito espesso ou pobre em celulas
•Esfregaço hemorragico
•Esfregaço purulento
•Esfregaço ressecado antes da fixação
•Má fixação
•Esfregaços contaminados por um lubrificante ou creme vaginal
VII - COLHEITA DO MATERIAL PARA O EXAME DE CITOLOGIA HORMONAL, CITOLOGIA ENDÓCRINA, INDICE DE MATURAÇÃO OU DE FROST, CITOLOGIA HORMONAL SERIADA (C.H.S.)
A avaliação citohormonal pode ser realizada através de uma amostra isolada (citologia hormonal isolada ou índice de maturação) ou através de amostras seriadas no ciclo menstrual da paciente.No caso da amostra isolada verificar a data da coleta solicitada pelo médico, dentro do ciclo menstrual da paciente, nas amostras seriadas deve ser realizado as coletas nos seguintes períodos:
7 dia do ciclo menstrual, mesmo a paciente estando menstruada.
14 dia do ciclo menstrual
21 dia do ciclo menstrual
28 dia do ciclo menstrual
As datas determinadas para estas coletas podem variar no máximo 2 dias para menos ou para mais, devendo sempre o citologista ser informado sobre tais mudanças.
As pacientes que tiverem menstruação a partir da segunda coleta deve ser cancelado as demais coletas, e informar o citologista sobre o término das coletas devido ao inicio de um novo ciclo menstrual ou cancelamento das coletas pela paciente.
As avaliações citohormonais devem conter os seguintes dados clínicos: idade, d.u.m. e uso de medicação hormonal.
As coletas devem ser sempre realizadas nas paredes vaginais.Sugere-se que as pacientes antes da coleta tenha as mesmas precauções que são solicitadas na citologia oncologica.
VIII - COLETA DE SECREÇÕES MAMÁRIAS
 Aplicação da superfície de uma lamina diretamente sobre a gota de secreções no mamilo obtida por expressão manual das mamas
A lamina deve ser movida sempre no sentido lateral, da direita para a esquerda ou vice-versa, espalhando-se a secreção sobre a lamina.
 Verificar quando a solicitação for bilateral, coletar amostras em laminas diferentes e identificar como mama direita e mama esquerda respectivamente.
 As pacientes que apresentarem grandes quantidades de secreção, pode ser colhido duas amostras.
 Fixar imediatamente em álcool ou fixadores de camada e identificar a paciente 
IX – LABORATORIO DE CITOPATOLOGIA
Area para um laboratorio que processa 50.000 exames/ano: aproximadamente 100m2
Recepção – 6 m2, Processamento tecnico – 24 m2, Diagnostico – 16 m2 ou 9 m2 (bem iluminada, ventilada e evitando-se o barulho de equipamentos e restringindo o fluxo de pessoas), Administração – 9 , Secretaria – m2, Arquivo de laminas – 9 m2 , Sanitarios – 9 m2
Bancadas, pisos e paredes de revestimentos impermeaveis, laváveis, de cores claras e neutras.
Material permanente: Microscopio biocular, Centrifuga convencional e/ou citocentrifuga, Capela de exaustão (NR-32)
RECEPÇÃO DAS AMOSTRAS: atendimento do paciente, quando da realização da colheita no proprio laboratorio, Esfregaços preparados pelo clinico, Material liquido (liquidos cavitarios, lavados, urina) e pastoso (escarro e secreções de fistula ou abscessos)
REGISTRO DO EXAME NO LABORATORIO
Amostras citologicas e requisição medica
Cadastro em sistemas eletronicos ou manuais
SISCOLO (Datasus) ou Sistemas de informatica particulares (Ex: Worklab)
PROCESSAMENTO TECNICO
Centrifugação – Especimes liquidas ou secreções)
Confecção de Esfregaços:
Método do Deslizamento (T. Lowhagen) – Qualquer tipo de material
Método do Esmagamento – Especimes mucoides
FIXAÇÃO DOS ESFREGAÇOS
Preservar as caracteristicas citomorfologicas e reter certos elementos citoquimicos, essenciais na etapa de coloração
Os fixadores citologicos devem apresentar as seguintes caracteristicas: Penetrar rapidamente nas células, Minimizar a retração e a distorção da celula, substituindo a agua celular; Preservar a morfologia celular, Inativar enzimas autoliticas, Tornar a membrana celulares permeaveis aos corantes, Facilitar a adesão celular a lamina 
TIPOS DE FIXAÇÃO
Úmida – Imersão imediata do esfregaço ainda úmido na solução fixadora, as celulas não são expostas a fixação pelo ar
Fixadores utilizado: Alcool 95% 
Desnatura as proteinas e os acidos nucleicos, tornado-os insoluveis e estaveis
Agente desidratante – Retração celular
2) Fixadores de Cobertura – Fixam as celulas e quando secam promovem a formação de uma pelicula protetora sobre o esfregaço
Fixadores utilizados: Carbowax 4000 (polietileno glicol)
3)Fixadores a seco - Deixar secar a temperatura ambiente
Recomendado para colorações que utilizam corantes derivados de Romanoviski
IX - CONCEITOS GERAIS DE COLORAÇÃO
A coloração torna possível o estudo e a visualização das características físicas e das reações dos tecidos e outros constituintes celulares, porque os tecidos diferentes e também os componentes celulares, exibem afinidades diferentes para a maioria dos corantes ou tintas, devido as variações da estruturafísico-química e na composição das células e tecidos.
As colorações podem ser especificas (histoquímica), diretas(ação de soluções simples de corantes) e indiretas (ação do corante intensificada pôr um outro agente – mordente). O mordente pode ser incorporado na solução corante ou pode ser usado separadamente e, geralmente, tem o efeito de formar uma ligação entre a molécula do corante e o elemento tecidual.
. As reações químicas podem ser relativamente não especificas, pôr exemplo coloração de nucleoproteínas acidas pôr corantes básicos, ou pôr grupos específicos (Ex. PAS) ou altamente especificas (Ex. Azul da Prússia para íon ferro). 
A adsorção envolve a atração e a fixação na superfície, de pequenas moléculas pôr grandes moléculas.
Sabe-se que a grande maioria dos corantes tem cor, porque a sua configuração molecular apresenta geralmente ou um anel paraquinonoide ou então um ou mais grupamentos azo. Estas estruturas apresentam uma configuração eletrônica que leva a uma absorção de certos comprimentos de onda de luz. Estes grupamentos responsáveis pela cor na maioria dos corantes receberam o nome genérico de cromóforos (cromo=cor e foros=transportador) e, de regra, quanto maior o número de grupamentos cromóforos em um corante mais intensa é a sua cor. A introdução de um grupo cromóforo numa molécula não corada transforma-la-á em corada, passando a ser chamada de cromógeno, a qual é corada, mas não é um corante.
O processo das reações químicas dos corantes para se ligarem aos tecidos ou células ocorre devido á presença de radicais ionizáveis na molécula dos corantes, o quais podem ser catiônicos ou aniônicos, sendo também chamados de auxocromos (auxo=auxiliar e cromo = cor). Os radicais aniônicos são geralmente o cloreto, sulfato, o sulfônico e carboxila. O principal grupo catiônico é o aminico = NH2+, estes corantes são chamados de corantes básicos, quando é formado pôr grupos auxocromos aniônicos são chamados de corantes ácidos. Existe também o corante neutro que consiste na mistura de corantes ácidos e básicos (Ex. Corantes de Romanowski).
Os corantes ácidos ou básicos se prendem pôr interação eletrostática aos radicais de sinal oposto presentes nos componentes tissulares.
Os principais componentes ácidos das células e tecidos (substancias basofilas, devido à afinidade paro os corantes básicos) são os ácidos nucléicos (DNA-devido aos radicais fosfato), os polissacarídeos ácidos e as proteínas acidas. As proteínas podem ser acidas ou básicas, de acordo como a predominância de aminoácidos ácidos ou básicos.
Os principais componentes básicos dos tecidos (substancias acidófilas, devido à afinidade para os corantes ácidos) são as proteínas ricas em aminoácidos básicos, as proteínas dos grânulos eosinofilos dos leucócitos e as proteínas mitocôndrias.
As colorações podem ser progressivas, onde o processo deve ser mantido ate que a intensidade de coloração desejada nos diferentes elementos teciduais ou celulares sejam obtidos. 
As colorações podem ser regressivas, os tecidos ou células são supercorados e o excesso de corante é depois removido seletivamente até que seja obtida a intensidade desejada, ou seja, o excesso de corante é removido, ele é clareado ou retirado de certos constituintes celulares antes dos outros, ou enquanto outras estruturas celulares permanecem ainda fortemente coradas. Este processo de remoção seletiva do excesso de corante é denominado diferenciação.
A) BATERIA DE COLORAÇÃO DE PAPANICOLAOU (1954).
Esta coloração idealizada pôr George Nicholas Papanicolaou e Stockard em 1942 é universalmente utilizada em citopatologia. O método de Papanicolaou consiste na coloração citoplasmática e nuclear com corantes específicos, e segundo o autor, visa três objetivos:
a) definição dos detalhes nucleares, proporcionando perfeita analise das alterações inflamatórias e neoplasicas.
b) transparência citoplasmática, de particular importância devida às espessuras celulares diferentes e freqüente superposição celular na amostra.
c) diferenciação das células, ou seja, utilização da capacidade das células de fixar corantes ácidos ou alcalinos permitindo tonalidades diferentes de cores, que facilitam o diagnostico citológico.
 A qualidade da coloração depende da qualidade da preservação celular e fixação do espécime, dos reagentes/soluções usadas, protocolo de coloração e da montagem e também da eficácia da iluminação microscópica. Deve ser chamado a atenção para as reações de cor que não são estáveis e são afetadas pôr alterações no ph, alterações inflamatórias e mesmo pela espessura dos agrupamentos celulares.
Além da coloração de Papanicolaou, podem-se empregar nos esfregaços colorações especiais ou impregnações metálicas para melhor esclarecimento diagnostico. Dentre a mais usadas, destacam-se as de May Gruenwald-Giemsa, Ziehl Neelsen, Acido Periódico de Schiff (PAS), Prata Metenamina de Grocott, Mucicarmim de Best e Gram.
 Desde a sua introdução, o método sofreu varias modificações através de diversos autores, o próprio Papanicolaou publicou duas delas em 1954 ( Técnica regressiva de coloração) e 1960(Técnica progressiva de coloração).
 São usados três corantes no método: Hematoxilina, Eosina-Alcool (EA) e Orange G, no geral a hematoxilina tem a função de corar os núcleos e os outros os citoplasma das células.
Os banhos que se seguem antes dos corantes são realizados no solvente do corante, ou seja, a hematoxilina aquosa, as laminas são lavadas em água, seguindo o Orange e o EA, as laminas são lavadas em álcool. A água utilizada depois da hematoxilina tem a função de remover a hematoxilina não ligada. A água que vem depois do diferenciador tem a finalidade de interromper a ação do acido clorídrico.
Os banhos de álcool 95% apos a coloração pelo Orange e EA-36 tem a finalidade de remover a solução de Orange que não esta ligado ao citoplasma. 
Os últimos banhos com álcool absoluto tem a função de remover totalmente a água dos esfregaços (desidratação). Esta etapa prepara o esfregaço para a imersão posterior em xilol, o passo final da coloração que é o clareamento ou diafinização do esfregaço, que determina a transparência celular. O xilol é usado como solução de clareamento porque não é corado, é quimicamente não reativo, além de ter um índice de refração de 1,494 (aproximadamente o do vidro em torno de 1,515). Desta forma o índice de refração do esfregaço aumenta, tornando-o transparente.
O primeiro banho com xilol tem a função de remover o álcool e o segundo banho com xilol possibilita o aumento da transparência da preparação citológica, preparando-a para a fase final que a montagem.
Fatores que influenciam na coloração de Papanicolaou: Tipo de Fixador utilizado, Tipo da Formula da hematoxilina e dos corantes Citoplasmaticos, Duração do tempo nos corantes, Numero de esfregaços em cada corante, ph e conteudo quimico da agua corrente usada, ph das soluções e corantes, idade dos corantes usados, presença de particulas de corantes em soluções não filtradas, tecnica de coloração inconsistente e possivel contaminação de soluções desidratantes
Os corantes utilizados na bateria de coloração podem ser comprados comercialmente prontos ou preparados no laboratório a partir de sais primários (abaixo segue instruções). O alcool etílico absoluto P.A., pode ser substituído pelo álcool etílico absoluto comercial. 
1) PRINCIPIOS DA COLORAÇÃO PELA HEMATOXILINA
A hematoxilina é um corante natural extraído do cerne da arvore chamada Haematoxylon campechianum, nativa do México, mas atualmente é produzida comercialmente na Jamaica. O extrato natural obtido dos pedaços de toras cortados desta arvore é o hematoxilo, o qual não é um corante ativo, é necessário ser inicialmente oxidado ao principio ativo a Hemateina.
A oxidação espontânea ocorre muito lentamente em solução aquosa ou alcoólica, levando três a quatro meses. O processo de oxidação é conhecido como amadurecimento e pode ser efetuado quase que instantaneamente pôr oxidantes químicos, tais como óxidode mercúrio, iodato de sódio, permanganato de potássio, peróxido de hidrogênio e hipoclorito de cálcio. A coloração pôr uma pela hematoxilina madura é uma mistura de hematoxilina, hemateina, produtos de oxidação ativa da hemateina e do hematoxilo.
Sem um mordente, a hemateina é um corante âmbar fraco, os mordentes são essenciais para a coloração de hematoxilina, pois são responsáveis pela indução da cor do corante. O mordente forma uma ligação da hemateina com os ácidos nucléicos e proteínas nucleares, revelando a cromatina nuclear. Os mordentes são geralmente representados pôr íons metálicos geralmente sulfato de alumínio e potássio ou simplesmente alúmen, sulfato de amônio férrico e sulfato de amônia e alumínio. Estes sais se combinam como hidróxidos ao corante, deslocando um átomo de hidrogênio do mesmo e suas valências remanescentes servem para ligar o complexo mordente-corante aos componentes da célula ou tecido, principalmente aos grupos fosfato dos ácidos nucléicos.
A coloração pela hematoxilina é do tipo regressivo, a remoção da hematoxilina do citoplasma é feita pela aplicação de acido clorídrico (HCl), cujas concentrações recomendadas variam (0,2%, 1%, 0,25% e 0,5%). A aplicação do HCl retém o corante apenas no núcleo, depois desta fase o citoplasma das células ficam totalmente descorados. A água destilada que vem a seguir tem a finalidade de interromper a ação do acido clorídrico.
Existem varias preparações possíveis e aceitáveis para a hematoxilina, cujas diversas variações acabaram recebendo o nome de seus autores. A mais difundida no método de Papanicolaou é a de Harris, cujo preparação segue logo abaixo, mas existem outras bastante utilizadas, como a de Carazzi (não é usado à etapa da diferenciação), Mayer, Lillie-Mayer e Gill.
 PREPARO DA HEMATOXILINA DE HARRIS
Dissolver em balão volumétrico, 100 g de Alúmen de Potássio em 1.000 ml de água destilada sobre Bico de Bunsen.
Dissolver 5 g de hematoxilina em 50 ml de álcool etílico absoluto.
Juntar as duas misturas.
Levar à chama até ferver.
Juntar 2,5 g de óxido de mercúrio(oxidação artificial) lentamente, fora da chama.
Levar a chama ate que a solução assuma uma cor púrpura escuro.
Resfriar rapidamente.
Filtrar logo em seguida, impedindo que o oxido de mercúrio continue oxidando, ou toda vez que usar.
Alguns autores orientam a colocar 20 a 40 ml de acido acético glacial para garantir a seletividade do material nuclear e ajuda a prevenir a oxidação do corante, também é sugerido acrescentar de 50 ml de álcool etílico á solução final, pois ajuda a impedir a formação de grumos.
Possiveis Problemas com a Coloração Hematoxilina:
· Nucleo Cora fracamente (pálido)
· Nucleo Cora Fortemente
· Depositos de Hematoxilina no esfregaço
PREPARO DO DIFERENCIADOR 
Diluir em proveta, 10 mL de ácido clorídrico em 990 mL de álcool 70 %.
2) PRINCIPIOS DA COLORAÇÃO PELO ORANGE G OU ALARANJADO G
Consiste de uma solução alcoólica do corante aniônico Orange G e acido fosfotungstico, este atuando como mordente. O Orange G apresenta-se sob a forma de uma pequena molécula que é capaz de penetrar nas hemácias e nas células com queratina ou precursores de queratina, dando uma coloração laranja intenso e brilhante. Evidencia também os grânulos de querato-hialina das células superficiais.
PREPARO DO CORANTE ORANGE G (ALARANJADO G)
1)Solução Estoque
10 g de Orange G
100 mL de água destilada
Agitar e usar depois de uma semana.
2) Solução do Corante Orange G para uso
Medir na proveta, 50 mL da solução estoque, e diluir em balão volumétrico ou Becker com 900mL de álcool etílico a 95 %.
Pesar 1,5 g de ácido fosfotungstico, diluir em balão volumétrico ou Becker em 50 mL de álcool etílico a 95 % e juntar as duas soluções.
Pronto para uso depois de filtrado.
3) PRINCIPIOS DA COLORAÇÃO PELO E.A. (EOSINA ALCOOL).
É um corante policromico composto pela eosina, lighe green (verde luz) e pardo de Bismarck, associados ao acido fosfotungstico. A formula original do corante desenvolvido por Papanicolaou, é conhecido por um código numérico, o EA-36. Existem duas formulas de EA, 50 e 65. Estas modificações interferem na intensidade da cor verde da coloração. O EA-65 tem metade do light green do EA-36, enquanto o quantidade de eosina e pardo permanecem idênticas. Qualquer formula pode ser usada para os diferentes espécimes citológicos, dependendo da preferência pessoal.
O EA é capaz de corar as estruturas da maioria das células metabolicamente ativas, em rosa pela ação da Eosina coram células superficiais, nucléolos, eritrócitos e cílios, ou em verde (cianofilia) ou azul pela ação do light green as células parabasais, intermediarias, colunares, e trichomonas.
Inicialmente acreditava-se que o ácido fosfotungstico atuasse como mordente na reação de coloração, mas esta visão foi modificada e hoje o pensamento é que atue como um corante de competição que ajuda na coloração pelo light green. 
Hoje alguns autores discutem a ação do pardo de Bismarck, alguns acham que este corante não adiciona nenhuma cor característica ao citoplasma, desta forma tem sido eliminado na elaboração de algumas formulas. Outros autores acham que este corante deve ser incluído como um corante de fundo.
Outra duvida é em relação ao uso de uma solução saturada de carbonato de lítio que adicionada à solução de uso do EA.
Vários fatores, entretanto, tais como a secagem ao ar, o pH da secreção e a espessura do esfregaço poderão alterar as reações da coloração do citoplasma.
Possiveis Problemas com a Coloração Citoplasmatica
· Citoplasma muito pálido
· Não há coloração diferencial do Citoplasma
PREPARO DO CORANTE E.A. -36 (CLASSICO).
1)Soluções Estoque do EA -36
Estoque A - verde luz
 (
10 g
água destilada 
 (
100 mL
Estoque B - pardo Bismarck
 (
10 g
água destilada
 (
100 mL
Estoque C - eosina amarelada (
10 g
água destilada
 (
100 mL
Preparo do Corante EA-36 para uso
Pipetar 4,5 mL de Solução Estoque A = Diluir em balão volumétrico ou Becker com 250 mL de álcool etílico 95 % 
Pipetar 5,0 mL de solução Estoque B = Diluir em balão volumétrico ou Becker com 250 mL de álcool etílico 95 %
Pipetar 22,5 mL de Solução Estoque C = Diluir em balão volumétrico ou Becker com 250 mL de álcool etílico 95 %
Pesar 2 g de ácido fosfotungstico, diluir em balão volumétrico ou Becker em 250 mL de álcool etílico a 95 %.
Juntar todas as soluções em um só frasco
Pronto para uso depois de filtrado
4) CLAREAMENTO OU DIAFINIZAÇÃO DOS ESFREGAÇOS
E a fase final da coloração que determina a transparência celular, e a etapa entre a desidratação e a montagem. A solução usada deve ser compatível tanto com o álcool como com o meio de montagem, tornando as células transparentes. O xilol, solvente orgânico, é usado com freqüência. Não é corado e é quimicamente não reativo, além de ter um índice de refração aproximado do vidro, aumentando o índice de refração do esfregaço, tornando-o transparente. O primeiro banho com xilol tem a função de remover o álcool e o segundo banho com xilol possibilita o aumento da transparência da preparação citológica, preparando-a para a fase final que a montagem.
O xilol quando contaminado com água, desenvolve uma reação química que lhe dá uma aparência leitosa, as laminas que estiverem em contato com este xilol hidratado ficaram opacas, para evitar esta perda de qualidade dos esfregaços, estes laminas devem voltar para as cubas de álcool absoluto.
O xilol hidratado deve ser trocado assim como a cuba de álcool absoluto anterior a deste xilol, as laminas devem passar novamente pelo processo de desidratação e clareamento.
5) MONTAGEM DA LAMINA CORADA
Quando um esfregaço corado, não é montado e for examinado ao microscópio, muito poucos detalhes podem ser observados devido a grande diferença entre o índice de refração da lamina de vidro e os componentes das células e o ar, para uma melhor visualização das estruturas celulares, estas devem estar impregnadas por um meio transparente que tenha o índice de refração próximoao do vidro. O meio de montagem é necessário também para proteger os esfregaços corados de danos físicos e do descoramento ou deterioração da coloração como resultado da oxidação e também da dessecação do material.
O meio de montagem ideal deve Ter um índice de refração próximo ao do vidro, deve ser miscível com o xilol, não será reativo e não mudara sua cor em ph, tornar-se-á duro sem formar grânulos ou rachaduras. 
Os meios de montagem representados por uma resina sintética geralmente usadas, são o Balsamo do Canadá e o Entellan. Alguns utilizam verniz como meio de montagem.
Durante a montagem deve ser evitar a formação de bolhas, aparecimento de pigmentos marrons (cornflakes) sobre a superfície celular (evaporação do xilol e aprisionamento de ar entre a lamina e lamínula) e de áreas turvas (excesso de umidade – desidratação não foi adequada).
Possiveis Problemas na montagem:
· Excesso de Resina
· Montagem muito Lenta - Cornflakes (pigmentos marrons)
B)COLORAÇÃO DE SHORR
O corante nuclear desta coloração é o Biebrich Escarlate, tendo uma afinidade por proteínas desnaturadas, por isto o núcleos picnóticos tem uma afinidade forte corando-se de vermelho e os vesiculosos de pardo. Este corante não é indicado para a coloração de núcleos neoplásicos. 
Os citoplasmas das células coram-se de verde, e as superficiais eosinófilas de alaranjado, igualmente na técnica de PAPANICOLAOU . 
PREPARAÇÃO DO CORANTE DE SHORR 
Etanol 50% -100 ml 
Biebrich escarlate -50 mg 
Fast Green -75 mg 
Orange G -250 mg 
Ácido Fosfotungstico -500 mg 
Ácido Fosfomolibdico -500 mg 
Ácido Acético Glacial -1 ml 
X- MANUTENÇÃO DA BATERIA DE COLORAÇÃO DE PAPANICOLAOU
· Troca dos corantes após a coloração de 2000 laminas ou depois de um período de tempo de 6 a 8 semanas (corantes preparados no laboratório) ou quando durante a microscopia for observado falhas na coloração citoplasmática e nuclear
· Manter os corantes em recepientes e cubas escuras
· Manter vedadas as cubas da bateria de coloração
· Filtração regular dos corantes e soluções
· Trocar periodicamente a solução diferenciadora
· Trocar diariamente os álcoois usados para limpeza após os corantes
· Observar diariamente a precipitação que pode ocorrer na hematolixina e retirar com auxilio de um papel filtro este material
PROFISSIONAIS QUE ATUAM NA CITOPATOLOGIA
	Profissional
	Formação básica
	Habilitação
	Especialização
	Responsabilidade
	Medico
	Terceiro grau
	Residência medica em anatomia patológica (histopatologia\necropsia\
citopatologia) –
 conselho federal ou regional de medicina
	-SBP
-SBCP
- IAC
	1) Leitura e assinatura dos exames anatomopatológicos
2) Leitura dos casos suspeitos e/ou positivos e assinatura dos exames citopatologicos negativo, suspeito e positivo
	Farmacêutico
	Terceiro grau
	Conselho federal ou regional de farmácia
	- Sbac/Sbcc
- Iac (citotecninologista)
- Sbcp(citotècnico)
	Leitura e assinatura dos exames citopatologicos negativos, suspeitos e positivos
	Biomèdico
	Terceiro grau
	- Aperfeiçoamento de no minino 500 hrs em entidade educacional:
- Habilitação pelo conselho federal ou regional
	- Sbac/ Sbcc
- Abbm
- Iac (citotecnologista)
- Sbcp (citotecnico)
	Leitura e assinatura dos exames citopatologicos negativos, suspeitos e positivos
	Citotècnico
	Segundo grau ou terceiro grau
	Formação teórica e pratica de no mínimo 1 ano : 
- Adolfo lutz
- Servidor publico estadual
- Fund. Onconcentro
	- Sbpc
- Iac
	Leitura e seleção para o patologista dos casos suspeitos e positivos, não pode assinar laudos
	
	
	
	
	
OBSERVAÇÃO: 
 S.B.P – Sociedade Brasileira de Patologia
S.B.C.P. – Sociedade Brasileira de Citopatologia
S.B.A.C. – Sociedade Brasileira de Analises Clinicas
S.B.C.C. – Sociedade Brasileira de Citologia Clinica
I.A.C. – Academia Internacional de Citologia
A.B.B.M – Associação Brasileira de Biomedicina 
REFERENCIAS BIBIOGRAFICAS
1. Lima, Conceição Queiroz , O laboratório de Citopatologia – Aspectos Técnicos e Operacionais – EDUFA – 2000
2. KOSS, Leopold G., Diagnostic Cytology and its Histopathologic Base, Philadelphia, J.B. Lippincott Company, 1990
3. TAKAHASHI, Masayoshi, Atlas Colorido de Citologia do Câncer, São Paulo, Ed. Manole, 1982
4. KOSS, Leopold G., Citologia Ginecológica e suas bases Anatomoclínicas, São Paulo, Ed. Manole, 1997
5. CARVALHO, Grimaldo, Citologia Oncológica, São Paulo, Livraria Atheneu, 1993
6. MCKEE, Grace T.; Citopatologia, Rio de Janeiro, Ed. Artes Médicas, 1997
Este material pode ser reproduzido, deste que citado a sua fonte.