Anticorpos Monoclonais: Mecanismos de Defesa

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Anticorpos monoclonais
Mecanismos de agressão e defesa aplicados
Prof. Nicholas Morais Bezerra
Objetivos de aprendizagem
O que é um anticorpo, onde ele é produzido e qual é a diferença de anticorpos monoclonais para policlonais?
Como podemos produzir de forma artificial anticorpos policlonais?
Onde pode ser usado os anticorpos monoclonais?
O anticorpo
	Os anticorpos que	surgem	num animal em resposta a um único antígeno complexo são heterogêneos. São formados vários clones diferentes de células B que diferenciam-se em plasmócitos, cada um deles expressando e secretando, respectivamente, um tipo de anticorpo, capaz de reagir com um diferente epítopo no antígeno complexo.
Estes anticorpos são denominados policlonais.
linfócitos/plasmócitos
...
anticorpos
antígeno
Anticorpos policlonais
	Os	anticorpos	que	surgem	a	partir	de		um		único clone de células, como, por exemplo, num	tumor de plasmócitos (mieloma) são homogêneos,	isto é, são	iguais entre si.
São ditos anticorpos monoclonais.
Plasmócitos derivados de um único linfócito B produzem anticorpos monoclonais, portanto idênticos entre si.
Anticorpos
Policlonal
Monoclonal
Anticorpos que são coletados
do soro de animais inoculados
Reconhece múltiplos sítios antigênicos do material inoculado
Um hibridoma individual de linfócito B é
clonado e cultivado em meio de cultivo
Reconhece um sítio antigênico do material inoculado
Método de produção de anticorpo monoclonal
(tecnologia dos hibridomas)
	O método envolve fusão celular (ou hibridização de células somáticas), entre um linfócito B normal produtor de anticorpo e uma linhagem de mieloma. 
	Seguindo-se subsequentemente a seleção de células fusionadas que secretem anticorpo da especificidade desejada , derivada do linfócito B normal. 
	Tais linhagens celulares imortalizadas, produtoras de anticorpos e derivados de fusões, são chamadas hibridomas. 
	Os anticorpos que elas produzem são anticorpos monoclonais
Anticorpos monoclonais e policlonais
Concepção geral da técnica – Obtenção de anticorpos
[7]
Primeiramente, o animal a ser selecionado deve ser livre de patógenos e geneticamente selecionado. 
Para a produção em escala comercial, animais como camundongos, coelhos e aves, normalmente galinhas, são utilizados. No entanto, os camundongos são os mais utilizados.
Imuniza-se o animal com epítopo desejado.
Retira-se os linfócitos B, principalmente do baço.
Pure single Ab
After immunization, the mouse spleen contains B cells producing specific antibodies.
Each B cell produces only one kind of antibody, which binds to its specific antigen.
Conventional antiserum is the mixture of all antibodies produced by B cells from spleen.
If a single B cell was picked up and cultured, then it will produce only one kind of antibo
But B cell can not survive well in the culture.
Myeloma cell can be cultured in the test tube, but can not produce useful antibody.
Each hybridoma line can produce pure single antibody, called monoclonal antibody.
If B cell is fused with myeloma, the fused cell might be cultured and produce antibody. dy.
1
3
2	4
m	m m m
1
2
3
4
1	2
3	4
Monoclonal antibodies
Cell fusion
Spleen cells
+
Myeloma
x
Antiseum
Antigen
Immunization
A mixture of all Ab
31 2 4
BA LB/c
1	2
3	4
31 2 4
B cell
Funde-se os linfócitos B obtidos com células do mieloma (hibridoma) com auxílio de um surfactante Polietileno glicol.
Células do mieloma tem enzimas deficientes. A carência dessas enzimas leva a célula à morte em meio HAT.
Células fusionadas são capazes de sobreviver a esse meio por suprirem a sua carência enzimática pela fusão com os linfócitos B.
Os linfócitos B não fusionados morrem após um certo período visto que as células do mioloma são “imortalizadas”.
Concepção geral da técnica – Seleção dos hibridomas
Mistura de células do baço incluindo algumas produtoras de anticorpos anti -X
Linhagem tumoral de mieloma mutante, imortalizada e não cresce em meio seletivo	(HAT). É incapaz de produzir anticorpos.
Fusão in vitro
Mistura de células fusionadas e não fusionadas.Seleção in vitro em meio de cultivo - HAT
 O sucesso dessa técnica depende do desenvolvimento das linhagens de mieloma que cresçam em meio normal de cultura mas não cresçam em um meio seletivo (HAT - hipoxantina, aminopterina e timidina), porque lhes faltam genes funcionais, necessários para a síntese de DNA pela via de salvação (genes que codificam as enzimas TK e HGPRT). 
 Esses genes estão presentes nas células normais, de modo que somente os híbridos e os linfócitos B continuam a crescer no meio seletivo.
Com a identificação da cultura celular fusionada as células são diluídas de forma que tenha apenas uma célula por poço.
Cada célula isolada irá proliferar-se formando colônias individuais.
Após duas semanas há anticorpos secretados suficientes .
As amostras são transferidas para placas de 24 poços.
Concepção geral da técnica – Clonagem dos hibridomas
.
Preparada a diluição no cultivo de modo que em cada poço fique só uma célula mãe /clone.
Somente células fusionadas híbridas (hibridomas) crescem.
Pesquisa de anticorpo anti- X nos sobrenadantes para posterior expansão dos clones positivos
Técnicas que definem colônias que secretam anticorpos de alta especificidade.
Testes de seleção devem ser realizados com o antígeno em sua forma original, na qual o anticorpo foi desenvolvido.
Concepção geral da técnica – Teste de seleção de anticorpos
Pontos positivos e negativos
Positivos:
 Muitas amostras analisadas rapidamente
Não requer muitos equipamentos
Reagentes e marcadores de fácil acesso
Negativos: reações cruzadas.
Indireto: 50% falsos negativos
 Direto: <1% falsos negativos, baixa sensibilidade
Onde pode ser usado os anticorpos monoclonais??
Imunodiagnóstico: o diagnóstico	de	muitas	doenças infecciosas e degenerativas, depende da detecção de antí- genos e/ou	anticorpos específicos na circulação ou nos tecidos, usando anticorpos monoclonais em imunoensaios.
anticorpos
monoclonais
soro do paciente contendo antígeno com vários epitopos idênticos
aglutinação
partículas de latex adsorvidas com os monoclonais
Exemplo: reação de aglutinação em latex
Para a imunodosagem de hormônios, marcadores tumorais e de outras proteínas séricas, sempre se usa anticorpos monoclonais
Análise funcional de moléculas da superfície celular e secretadas: na pesquisa imunológica, os anticorpos monoclonais que se ligam a moléculas da superfície celular e estimulam ou inibem funções celulares.
CD3
TCR
CD2 CD28
CD5
CD7
CD4
CD8
Th
Tc
CD64
MFR
CD32
CD16
HLA-D
CD35 CD11b
LFA-1
Macrófago
Imunoterapia
Tratamento de tumores com MoAc
Diagnóstico por imagem e terapia de tumores: anticorpos monoclonais específicos para tumores sãousados para	a detecção de tumores por técnicas de imagens.
Somente a célula tumoral é afetada pela toxina
Radioimunoterapia
Célula Tumoral
Anticorpos conjugados com radioisótopos
Radioimunoterapia
www.stjosephs-marshfield.org/
Radioimunodiagnóstico
Objetivos de aprendizagem
O que é um anticorpo, ondeele é produzido e qual é a diferença de anticorpos monoclonais para policlonais?
Como podemos produzir de forma artificial anticorpos policlonais?
Onde pode ser usado os anticorpos monoclonais?
Obrigado pela atenção!