Apostila_saneamento II

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Departamento de Engenharia 
Núcleo de Engenharia Ambiental e Sanitária 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MANUAL DE ANÁLISES 
LABORATORIAIS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2 
 
ÍNDICE 
 
PROCEDIMENTO HABITUAL DE SEGURANÇA APLICADO AOS LABORATÓRIOS DA 
ENGENHARIA AMBIENTAL E SANITÁRIA....................................................................................... 
 
3 
PRINCIPAIS VIDRARIAS UTILIZADAS.............................................................................................. . 4 
FÓRMULAS IMPORTANTES................................................................................................................. 7 
TABELA PERIÓDICA............................................................................................................. ................. 8 
UNIDADES DE MEDIDAS...................................................................................................................... 9 
DEFINIÇÕES................................................................................................................... .......................... 10 
PRIMEIROS SOCORROS................................................................................................................ ......... 11 
CONCEITOS BÁSICOS DE MEDIÇÃO......................................................................................... ......... 11 
REQUISITOS PARA PRESERVAÇÃO DE AMOSTRAS...................................................................... 14 
RECIPIENTE DE COLETA ........................................................................................................ ............. 15 
LAVAGEM DE RECIPIENTES....................................................................................................... ........ 15 
LOCAL E FORMA DE COLETA................................................................................ ............................. .15 
PH – CONCENTRAÇÃO DO ÍON HIDROGÊNIO................................................................................. 17 
COR................................................................................................. ........................................................... 18 
TURBIDEZ..................................................................................................................... ........................... 20 
CONDUTIVIDADE.................................................................................................................................. 21 
CLORETOS..................................................................................................................... .......................... 23 
FERRO TOTAL.................................................................................................................. ....................... 24 
ACIDEZ.................................................................................... ................................................................. 26 
ALCALIDADE TOTAL............................................................................................................. ............... 28 
ALCALINIDADE RIPLEY E ÁCIDOS VOLÁTEIS............................................................................... 31 
DEMANDA BIOQUÍMICA DE OXIGÊNIO (DBO)............................................................................... 33 
OXIGÊNIO DISSOLVIDO (OD).............................................................................................................. 36 
DQO MÉTODO COLORIMÉTRICO..................................................................................................... .. 35 
DQO MÉTODO TITULOMÉTRICO........................................................................................................ 39 
DUREZA....................................................................................................................... ............................. 41 
NITRATO........................................................................................................................... ........................ 44 
NITRITO............................................................................................... ..................................................... 45 
AGENTES TENSOATIVOS (DETERGENTES)..................................................................................... 46 
COLIFORMES TOTAIS E FECAIS......................................................................................................... 48 
SÓLIDOS TOTAIS, FIXOS E VOLÁTEIS............................................................................................. . 54 
NITROGÊNIO TOTAL (ORGÂNICO + AMONIACAL) - MÉTODO KJELDHAL.............................. 58 
FÓSFORO TOTAL .............................................................................................................. .................... 60 
FOSFATO.................................................................................................................................................. 62 
ÓLEOS E GRAXAS............................................................................................................... ................... 63 
CONTAGEM DE BACTÉRIAS HETEROTROFICAS............................................................................ 64 
CLOROFICA a.................................................................................................................. ......................... 67 
BIBLIOGRAFIA............................................................................................................................ ............ 69 
APÊNDICE - PREPARO DE REAGENTES................................................................................... ......... 72 
 
 
 
 
 
3 
 
PROCEDIMENTO HABITUAL DE SEGURANÇA APLICADO AOS 
LABORATÓRIOS DA ENGENHARIA AMBIENTAL E SANITÁRIA 
 
 Use sempre óculos de segurança e avental (jaleco), de preferência de algodão, 
longo e de mangas longas. 
 Não use saias, bermudas ou calçados abertos. Pessoas que tenham cabelos longos 
devem prendê-los. 
 Não trabalhe sozinho, principalmente fora do horário de expediente. 
 Não fume, coma ou beba nos laboratórios. Lave bem as mãos antes de deixar o 
recinto. 
 Ao ser designado para trabalhar em um determinado horário, é imprescindível o 
conhecimento da localização dos acessórios de segurança. 
 Antes de usar reagentes que não conheça, consulte a bibliografia adequada e 
informe-se sobre como manuseá-los e descartá-los. 
 Não retorne reagentes aos frascos originais, mesmo que não tenha sido usado, e 
evite circular com eles pelo laboratório. 
 Não use nenhum equipamento sem que tenha sido treinado ou autorizado a 
utilizar. 
 Certifique-se da voltagem, amperagem e potência tensão dos equipamentos antes 
de conectá-los a rede elétrica. Quando não estiver em uso, os aparelhos devem 
permanecer, além de desligados, desconectados da tomada. 
 Use sempre luvas de isolamento térmico ao manipular material quente. 
 Nunca pipete líquidos com a boca; use bulbos de borrachas (peras) ou trompas de 
vácuo. 
 Cada resíduo gerado deve ser descartado nos frascos apropriados rotulados. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4 
 
 
PRINCIPAIS VIDRARIAS UTILIZADAS 
 
 
 
 
 
5 
 
 
 
 
 
 
6 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
7 
 
FÓRMULAS IMPORTANTES 
 
 
TIPO DE 
CONCENTRAÇÃO 
FÓRMULA UNIDADE 
Concentração Comum 
 
 
g/mL 
Molaridade 
 
 e 
 
mol/L 
Número De Mol 
 
 
mol 
Título 
 ou 
 
adimensional 
Percentual 
 
 
 
% 
Concentração, título e 
densidade 
 
 
 
g/mL 
Densidade, Concentração E 
Título 
 
 
 
g/mL 
Fração Molar 
 
 
adimensional 
Normalidade 
 
 
N 
Equivalente-grama 
 
 
g 
Diluição 
 
- 
Mistura de solução de 
mesmo soluto 
 
 
 
- 
Mistura de solução de 
solutos diferentes 
 
 
 
- 
8 
 
 
9 
 
UNIDADES DE MEDIDAS10 
 
DEFINIÇÕES 
 
a) Acidente de trabalho 
 
• Conceito legal: Aquele que ocorre pelo exercício do trabalho a serviço da Empresa, 
provocando lesão corporal, perturbação funcional ou doença que cause morte, perda ou 
redução (permanente ou temporária) da capacitação para o trabalho, incluindo-se os 
acidentes de trajeto (percurso de residência para o trabalho ou vice-versa), além dos 
dispositivos contidos na Lei 6367 de 19/10/1976, e Decreto no 79037 de 24/12/1976. 
 
• Conceito técnico: ocorrência inesperada ou não que interrompe ou interfere no processo 
normal de uma atividade e da qual poderá resultar danos físicos (corpo humano) materiais 
e econômicos à Empresa. 
 
b) Segurança do Trabalho 
 
• Conjunto de medidas técnicas, educacionais e psicológicas empregadas no 
reconhecimento, avaliação e controle dos riscos que possam advir do trabalho, com 
conseqüências de caráter agudo. 
 
c) Condição insegura 
 
• Condição física que compromete a segurança existente no local, na máquina, no 
equipamento ou nas instalações e que conduz à ocorrência de acidentes. 
 
d) Dispositivos de Proteção Individual (EPI) 
 
• Meio ou dispositivo de uso pessoal destinado a preservar a incolumidade da pessoa no 
exercício de suas funções, quando as medidas de segurança de ordem geral são 
insuficientes ou impróprias para a atividade específica. 
 
e) Líquido combustível 
 
• Líquido com ponto de fulgor igual ou superior a 70o C e inferior a 93,3o C. 
 
f) Líquido inflamável 
 
• Líquido com ponto de fulgor inferior a a70ºC e pressão de vapor absoluta menor do 
lque 2,6.105 Pa (2,8kgf/cm2) a 37,7ºC. 
 
g) Corrosivo 
 
• Substância química que provoca danos a pele, olhos e tecidos do trato respiratório e 
digestivo quando inalados ou ingeridos. Podem provocar, também, deterioração de 
materiais e instalações. Como exemplos, temos os ácidos e álcalis em geral, metais 
alcalinos, cianetos etc... 
 
h) Oxidante 
11 
 
• Substância química que supre oxigênio para as reações químicas, podendo iniciar e 
alimentar reações de combustão. Exemplos: óxidos, peróxidos, nitritos, nitratos, 
bromatos, cromatos, percloratos, permanganatos etc... 
 
i) Explosivo 
 
• Substância química que ao ser exposta a variações térmicas ou reação química libera 
grande quantidade de energia sob a forma de calor e/ou gases em expansão, provocando 
explosões. Exemplos: cloratos, peróxidos, metais 
alcalinos etc... 
 
 
PRIMEIROS SOCORROS 
 
Os riscos mais comuns de acidentes em laboratórios químicos são: cortes, 
queimaduras, derramamento de produtos químicos e intoxicação com substâncias 
nocivas. 
Os primeiros socorros devem ser ministrados o mais próximo possível do 
momento do acidente, sendo que, dependendo da gravidade, o acidentado deverá ser 
encaminhado ao hospital mais próximo, imediatamente. Abaixo, procedimentos básicos a 
serem ministrados em caso de acidentes: 
 
• Por ingestão de substância química: não provocar vômito quando tratar-se de ingestão 
de ácidos ou bases; deve-se no primeiro caso (ingestão de ácidos) ministrar leite de 
magnésia e água para beber, e no segundo caso (ingestão de bases) ministrar cerca de 30 
ml de vinagre diluídos em 250 ml de água, seguido de suco de laranja ou limão. 
 
• Por inalação de vapores corrosivos: remover a pessoal do local, dispondo-a num 
ambiente ventilado • Por queimaduras: no caso de queimaduras com ácidos, deve-se lavar 
com água em abundância e, em seguida, com Bicarbonato de sódio a 5%; em tratando-se 
de queimaduras com bases, deve-se lavar com água em abundância e, em seguida, com 
vinagre. Quando a região afetada for os olhos, deve-se utilizar o lavador de olhos para 
proceder a lavagem. 
 
• Por cortes: deve-se lavar com água e sabão o local da lesão e, em seguida, ministrar 
solução à base de Iodo. 
 
 
 
 
CONCEITOS BÁSICOS DE MEDIÇÃO 
 
O resultado de uma análise química é função direta do cuidado, da manipulação e 
da correta aplicação da metodologia analítica, no qual pequenos descuidos podem 
significar grandes erros, sobretudo, em determinação de parâmetros em amostras com 
concentração da ordem de miligrama por litro. 
Dessa forma, é necessário o preparo técnico para se proceder a uma análise, e o 
uso de equipamentos e vidrarias apropriadas e em boas condições. 
12 
 
Uma das mais comuns fontes de erros encontra-se no preparo ou na manipulação 
das vidrarias volumétricas empregadas nas análises, são erros primários, que, uma vez 
evitados, podem significar um aumento do grau de confiabilidade do resultado. Entre os 
procedimentos que auxiliam a evitar esses tipos de erros, pode-se citar: 
 
• Temperatura: a capacidade de uma vidraria volumétrica varia com a temperatura, 
logo, deve-se utilizá-las sempre em temperaturas próximas à aferição. Da mesma forma, a 
densidade do líquido também varia com a temperatura, portanto, deve-se utilizá-los 
somente em temperatura ambiente; 
 
• Limpeza da vidraria: presença de material gorduroso pode aumentar o erro na leitura 
devido a má formação do menisco, além do que, tal “sujeira” pode servir como 
interferente, alterando o valor do resultado da análise. 
 
• Ajuste do menisco: deve-se tomar muito cuidado com o erro de paralaxe: o menisco 
deve estar posiciona de maneira que sua parte inferior tangencie horizontalmente a parte 
superior da linha do líquido, tendo a linha da visão no mesmo plano. 
 
 
• Ajuste da capacidade volumétrica: tanto em provetas, balões volumétricos ou buretas, 
deve-se tomar os cuidados mencionados nos itens anteriores, à fim de se evitar a 
ocorrência de desvios no resultado final. 
 
• Pipetas volumétricas e graduadas: deve-se utilizar uma pêra para sucção, devendo-se 
passar alguns milímetros acima da linha de graduação final, em seguida, deve-se secar a 
ponta da pipeta com papel higiênico, e ajustar o menisco. Feito isso, pode-se transferir o 
volume para outro frasco. Existem dois tipos de pipetas: 
 Pipetas volumétricas de sopro: possuem dois traços horizontais na porção 
superior, e no momento da transferência do líquido pipetado para outro frasco, deve-se 
“expulsar” o volume restante que permanece na ponta da pipeta, uma vez que ele, nesse 
tipo de pipeta, é considerado parte integrante do volume total pipetado; para tanto, deve-
se utilizar a pêra de sucção para “soprar” esse volume para o frasco. 
Pipetas volumétricas comuns: apresentam apenas um traço horizontal na porção 
superior, deve ser desconsiderado o volume restante na ponta da pipeta a final do 
escoamento, ou seja, não deve-se “soprar” esse volume para o frasco; para tanto, deve-se 
apenas encostar a ponta da pipeta até o término do escoamento e permanecer por alguns 
segundos após esse momento. 
 
• Limpeza da vidraria: toda a aparelhagem de vidro ou de plástico empregada na análise 
ou na preparação de reagentes deverá ser perfeitamente limpa, livre de substâncias 
estranhas ao processo, caso contrário, os resultados não ofereceram uma boa 
confiabilidade. Para tanto, existem várias técnicas de limpeza de vidrarias, às quais se 
destacam: 
 
13 
 
 Detergentes: Após a lavagem da vidraria com o detergente, é essencial que se 
enxague com água em abundância para se remover os resquícios do detergente, e em 
seguida, enxaguar com água destilada. 
 
 Solução de ácido nítrico 1:1: trata-se de uma solução indicada para a limpeza de 
vidrarias impregnadas pela análise de metais, ou no preparo de frascos para coleta de 
amostras para análise de metais. 
 
Preparo da solução de lavagem: 
1. Deve-se misturar 500ml de ácido nítrico 500ml de água destilada 
2. Acondicionar em frasco devidamente rotulado. 
Observações: cada material deverá ter sua análise adequada à análise para qual será 
destinado; deixar a vidraria em molho por muito tempo em solução ácida de lavagem 
pode danificar as marcas de identificação e graduação originais de fábrica.14 
 
REQUISITOS PARA PRESERVAÇÃO DE AMOSTRAS 
 
 
É de fundamental importância respeitar os procedimentos e prazos para a 
preservação de amostras, para garantir a qualidade dos resultados analíticos. Os requisitos 
para os parâmetros analisados mais frequentemente estão listados a seguir (do Standard 
Methods). 
 
Parâmetro Frasco1 
Volume 
mínimo de 
amostra em 
mL 
Forma de Preservação2 
Tempo de 
armazenagem máximo 
recomendado / 
permitido 
Alcalinidade P, V(B) 200 Refrigerar 24 h / 14 d 
DBO P, V 1000 Refrigerar 6 h / 48 h 
DQO P, G 100 
H2SO4 até pH < 2 e 
refrigerar 
7 d / 28 d 
Cloretos P, V 50 Nenhuma 28 d 
Clorofila P, V 500 30 d no escuro 30 d 
Cor P, V 500 Refrigerar 48 h / 48 h 
Condutividade P, V 500 Refrigerar 28 d / 28 d 
Dureza, Ca, Mg P, V 100 HNO3 até pH < 2 6 meses / 6 meses 
Fosfato V(A) 100 
Fosfato dissolvido – 
filtrar imediatamente; 
refrigerar 
48 h 
Metais 
(Fe, Mn, Na) 
P(A), 
V(A) 
500 
Metal dissolvido – 
filtrar imediatamente; 
HNO3 até pH < 2 
6 meses / 6 meses 
Nitrogênio 
Kjeldahl Total P, V 500 
H2SO4 até pH < 2 e 
refrigerar 
7 d / 28 d 
Nitrato + Nitrito P, V 200 
H2SO4 até pH < 2 e 
refrigerar 
48 h / 48 h 
Oxigênio 
dissolvido 
DBO, 
V 
300 Analisar imediatamente 8 h / 8 h 
pH P, V 50 Analisar imediatamente 2 h 
Sólidos P, V 
200 
 
Refrigerar 7 d 
Sólidos 
sedimentáveis 
 1000 
Turbidez P, V 100 Refrigerar no escuro 24 h / 48 h 
1Frasco: P – plástico (polietileno ou equivalente); V – vidro; P(A) ou V(A) – enxaguado 
com HNO3 50%; V(B) – borossilicato. 
2 Refrigerar = estocar a 4 ºC, no escuro 
 
15 
 
RECIPIENTE DE COLETA 
 
 Vidro: pode ser de borossilicato ou outro tipo de vidro quimicamente inerte, com 
tampa esmerilhada, à prova de vazamento. Devem ser usados, em alguns casos frascos de 
vidro âmbar; 
 Plástico: pode ser de polietileno, polipropil eno ou policarbonato (ABNT, 1987). 
 
LAVAGEM DE RECIPIENTES 
 
 Lavar e escovar o frasco e a tampa com detergente neutro e escovar o frasco 
internamente; 
 Enxaguar o frasco e a tampa três vezes com água de torneira; 
 Em análise microbiológica os frascos devem ser limpos e esterilizados (estufa 170  
10ºC por, no mínimo, 1 h); 
 Enxaguar o frasco e a tampa três vezes com água destilada e/ou deionizada; 
 Deixar os frascos e as tampas invertidos para escoar a água (ABNT, 1987). 
 
 
LOCAL E FORMA DE COLETA 
 
 2 a 3 litros são suficientes para a maioria das análises físicas e químicas; 
 As amostras podem ser coletadas no meio do riacho a uma profundidade média. 
 No momento da coleta enxaguar o recipiente de 2-3 vezes na água a ser coletada 
(exceto para análise de óleos e gorduras); 
 Mergulhar o recipiente de boca para baixo e virá-lo lentamente no sentido contra-
corrente (ABNT, 1987). 
 
 
Forma de coleta 
 
 Deve-se evitar amostragem em: 
 Locais de estagnação; 
 Margens internas de curvas; 
 Áreas de refluxo; 
 Zonas de mistura do efluente com o corpo d’água receptor. 
 
16 
 
 
Zona de mistura Curva interna de rio 
 
 Para coleta de amostras em registros e torneiras deixar a água escoar pela tubulação 
por pelo menos 2 a 3 minutos antes da coleta; 
 Coleta em lagos e represas devem ser planejadas de forma a representar toda área 
alagada e a diferentes profundidades (ABNT, 1987). 
 
 
 
 
Planejamento de coleta de amostras em lagos e reservatórios. 
Fonte: ABNT, 1987. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
17 
 
pH – CONCENTRAÇÃO DO ÍON HIDROGÊNIO 
 
A determinação do pH está associada à acidez ou à alcalinidade da água. A 
concentração de íons de hidrogênio em solução é calculada pela Equação 1.1. 
 
 pH = log {1/ [H+]} (1.1) 
 
Os valores de pH variam em uma escala de 0 a 14, sendo o intervalo de 0 a 7 
referente a pH ácido e o intervalo de 7 a 14 referente a pH básico. Essa variação está 
associada à quantidade de íons hidrogênio presente na água. Quando o pH=7, a 
solução/amostra é neutra. O conhecimento do potencial hidrogênio de uma água permite 
o monitoramento do poder de corrosão, da quantidade de reagentes necessário à 
coagulação, do crescimento de microorganismos, do processo de desinfecção, que tem a 
finalidade de reduzir o nível de microorganismos e se a água em relação ao pH se 
enquadra dentro das legislações pertinentes. 
De acordo com a legislação federal (Resolução nº 357 do CONAMA, de março de 
2005), que permitem moderados afastamentos do valor de pH = 7,0, tomado como 
referência, o valor de pH é também um resultado importante para a composição dos 
chamados “índices de qualidade de águas”. Os critérios de proteção à vida aquática fixam 
o pH entre 6 e 9 para Ministério da Saúde esses valores são de 6,0 e 9,5, esses valore são 
recomendados para o abastecimento público segundo a Portaria 518/2004 do Ministério 
da Saúde. 
 
Materiais e reagentes 
 
Peagâmetro 
Béquer de 100 mL 
Água destilada 
Papel absorvente 
Soluções de tampões-padrão (pH 4, 7 e 10) 
 
Procedimento 
 
O peagâmetro é o equipamento laboratorial mais utilizado para se determinar o 
valor do pH. Esse aparelho é calibrado por meio de soluções padrões, feitas pelo 
laboratorista e, deve ser manuseado de acordo com as instruções de cada fabricante. 
 
 Ligue o aparelho e deixe-o em aquecimento por 20 minutos. 
 Para calibrar o aparelho, enxaguar os eletrodos (ou eletrodo combinado) com água 
destilada em excesso, secar com papel absorvente e imergi-los na solução tampão 
padrão pH 7,0. Deixar equilibrar e ajustar o controle do coeficiente linear. Remover os 
eletrodos, enxaguá-los com água destilada em excesso, secar com papel absorvente e 
imergi-los na solução tampão pH 4,0 ou 10,0. Deixar equilibrar, e ajustar o controle do 
coeficiente angular. Repetir o ajuste de controles até que a leitura do aparelho acusa 
uma diferença menor que ± 0,1 unidade de pH do valor da solução tampão. 
 Fazer a leitura das amostras, sempre lavando o eletrodo com água destilada e 
enxugando-o com papel absorvente, após a medida de pH de cada amostra. 
 
 
18 
 
COR 
 
Os constituintes responsáveis pela coloração da água são os sólidos dissolvidos que 
originam da decomposição da matéria orgânica (vegetais, ácidos húmicos e fúlvicos), o 
ferro e o manganês e outros provenientes da constituição das rochas e ainda de resíduos 
industriais e agroindustriais, de depósitos de lixo e de esgotos domésticos. 
Esse parâmetro quando anormal pode diminuir a confiabilidade dos consumidores. 
Além disso, a água contendo a matéria orgânica dissolvida pode gerar produtos 
potencialmente cancerígenos (trihalometanos, ex.: clorofórmio) e podem apresentar 
toxidez e ainda doenças de veiculação hídrica. 
A cor natural da água se deve a uma variedade grande de substâncias e, portanto, 
tem-se adotado um padrão arbitrário para sua quantificação. A mistura de cloroplatinato 
de potássio (K2PtCl6) e cloreto de cobalto (CoCl2) resulta numa solução de cor parecida 
com a produzida pelas substâncias naturais dissolvidas na água. A cor produzida por 1 
mg L-1 Pt, na forma de K2PtCl6, é definida como uma unidade de cor, ou unidade Hazen 
(UH). A tonalidade da cor é, tipicamente, ajustada pela adição de CoCl2. De uma solução 
padrão estoque de 500 UH, prepara-se uma série de diluições, em tubos iguais 
(conhecidos como tubos Nessler). A cor das amostras pode ser quantificada por 
comparação visual com esses padrões de trabalho. 
Para análises de rotina, costuma-se utilizar um sistema proprietário de discos de cor 
padronizados para a comparação visual. É importante padronizar os discos contra a 
solução de Pt, uma vez que os mesmos podem sofrer alterações de cor com o tempo. Para 
um trabalho mais preciso, a cor pode ser lida em espectrofotômetro, a 465 nm. 
As amostras para análise de turbidez devem ser coletadas em frascos de plástico ou 
vidro. Recomenda-se que as análises sejam realizadas num período máximo de 24horas, 
as amostras devem ser guardadas no escuro. 
 
Materiais e reagentes 
 
Aparelho de comparação visual ou espectrofotômetro a 380nm 
Tubos tipo Nessler ou cubetas de vidro 
Papel absorvente 
Solução padrão de cloroplatinato de potássio / cloreto de cobalto 
Ácido sulfúrico 
Hidróxido de sódio 
Centrífuga 
 
Solução padrão (500 UC ou UH) – Dissolver 1,246 g K2PtCl6 (equivalente a 500 mg Pt) e 
1,00 g CoCl2.6H2O (equivalente a 250 mg Co) em água destilada e 100 ml de ácido 
clorídrico (HCl) concentrado e diluir até 1000 ml com água destilada. Esta solução 
padrão estoque contém 500 unidades de cor (UH). Proteger os padrões contra evaporação 
e contaminação quando não estão sendo utilizados. 
 
Procedimento 
 
 Medir o pH da amostra. Para fins de pesquisa, ajustar o pH a 7,6 pela adição de ácido 
sulfúrico (H2SO4) ou hidróxido de sódio (NaOH), em concentração suficiente para evitar 
um aumento de mais de 3% no volume da amostra. 
 
Comparação espectrofotométrica 
19 
 
Curva de calibração - Para a comparação espectrofotométrica, preparar uma série de 
diluições em balões volumétricos, conforme segue (sugestão): 
 
Cor (UH) Volume (mL) solução padrão (500 UH) Volume H2O (mL) 
25 2,5 47,5 
50 5,0 45,0 
100 10,0 40,0 
250 25,0 25,0 
500 50,0 0 
 
 Zerar o espectrofotômetro, ajustado a 380 nm com água destilada (branco). 
 Transferir uma alíquota de cada padrão para a cubeta de vidro limpa. Verificar a 
ausência de bolhas de ar e ler a absorbância a 380 nm. 
 Construir a curva de calibração de concentração dos padrões de cor versus 380 nm. 
 Encher a cubeta com as amostras, evitando a introdução de bolhas de ar. Ler a 380 e 
converter a cor, por interpolação da curva padrão. 
 Reportar resultados de cor em números integrais, com a precisão a seguir: 
 
UH Precisão, unidades 
1-50 1 
51-100 5 
101-250 10 
251-500 20 
 
Obs.: Deve-se distinguir entre cor aparente e cor verdadeira. No valor da cor aparente 
pode estar incluída uma parcela devido à turbidez da própria água. Quando esta é 
removida por centrifugação, obtém-se a cor verdadeira. 
 
 
 
 
 
Para cor verdadeira 
 
Obs.: Centrifugar a amostra, ler a absorbância em espectrofotômetro e obter a cor 
verdadeira pela equação ajustada à curva padrão. 
 
 
 
 
 
 
20 
 
TURBIDEZ 
 
A turbidez representa o grau de interferência da passagem da luz através da água 
conferindo-a uma aparência turva. Os constituintes responsáveis são os sólidos suspensos 
originados de partículas de rochas, argila, silte, materiais orgânicos provenientes do lixo, 
despejos domésticos e/ou industriais, erosão, algas e outros microrganismos. Esse 
parâmetro pode trazer inconvenientes sanitários diretos e é esteticamente desagradável na 
água potável. Os sólidos suspensos podem servir de abrigo para microrganismos 
patogênicos (diminuindo a eficiência da desinfecção). O excesso de turbidez pode 
prejudicar a fotossíntese em mananciais. 
A determinação da turbidez pelo método nefelométrico é adotado nas atividades 
de controle de poluição de água e de verificação do parâmetro físico nas águas 
consideradas potáveis. O método é baseado na comparação da intensidade de luz 
espalhada pela amostra em condições definidas, com intensidade da luz espalhada por 
uma suspensão considerada padrão. 
Quanto maior a intensidade da luz espalhada maior será turbidez da amostra 
analisada. O turbidímetro é o aparelho utilizado para a leitura, este aparelho é constituído 
de um nefelômetro, sendo a turbidez expressa em unidades nefelométricas de turbidez 
(UNT). 
O nefelômetro consta de uma fonte de luz, para iluminar a amostra e um detector 
fotoelétrico com um dispositivo para indicar a intensidade da luz espalhada em ângulo 
reto ao caminho da luz incidente. 
As amostras para análise de turbidez devem ser coletadas em frascos de plástico 
ou vidro. Recomenda-se que as análises sejam realizadas num período máximo de 24 
horas, as amostras devem ser guardadas no escuro. 
 
Material 
 
Turbidímetro 
Tubo para amostra, de vidro incolor 
Papel absorvente 
 
Procedimento 
 
 Calibrar o aparelho. 
 Colocar a amostra a ser analisada no tubo, evitando a formação de bolhas, até quase o 
gargalo. Fechar o tubo e limpá-lo com papel absorvente macio. 
 Inserir o tubo na câmara e fechá-la. 
 Fazer a leitura e anotar o valor em UNT. 
 
 Turbidez menor que 40 unidades 
Agitar bem a amostra a fim de dispersar os sólidos. Após o desaparecimento das bolhas de ar, colocar a 
amostra no turbidímetro. 
 Turbidez maior que 40 unidade 
Diluir a amostra com um ou mais volumes de água isenta de turbidez, de modo que, as leituras estejam 
dentro da faixa desejada. 
 
TURBIDEZ (UNT) = A X F 
A = leitura da amostra e F = Fator da diluição 
 
21 
 
CONDUTIVIDADE 
 
Condutividade é a medida da habilidade de uma solução aquosa de transportar 
corrente elétrica, dependendo das quantidades, características e concentrações dos íons 
presentes e da temperatura. 
Condutivímetro: aparelho usado para medir condutividade. 
Célula de condutividade: duas placas ou cilindro concêntrico (eletrodo) com 
geometria bem definida. Gera a diferença de potencial que vai ser lida pelo aparelho e 
convertida em resultado, apresentado no display. Deve estar conectada ao 
condutivímetro. 
O método proposto é baseado na medição direta da condutividade da amostra. O 
impulso elétrico é gerado pelo condutivímetro, transmitido para a célula de 
condutividade, e retorna ao aparelho. A diferença entre o potencial gerado e o recebido 
será processada e o valor informado como condutividade. 
 
Materiais 
 
Béquer 
Pisseta com água destilada 
Condutivímetro 
Papel absorvente 
 
Procedimentos 
 
 Ligar o aparelho no botão liga/desliga e deixá-lo por 10 minutos para estabilizar. 
 Calibrar o aparelho. 
 Após terminar a calibração, introduzir o eletrodo dentro do líquido a ser medido. 
 Anotar o valor da condutividade do líquido indicado. 
 Lavar o eletrodo com água deionizada e secar com papel absorvente macio. 
 
Obs.: Na troca de amostra para uma posterior leitura, deve-se lavar o eletrodo com água 
destilada para evitar contaminações. Terminado o procedimento lava-se o eletrodo 
novamente, secando-o com o papel absorvente antes de guardar o aparelho. A unidade de 
leitura é µS/cm (microsiemens/cm). 
 
Obs. Para se determinar a Salinidade da amostra, basta multiplicar o valor encontrado na 
condutividade por: 
 
 
Condutividade em μS cm-1 x 0,64 mg L-1 
 
Condutividade em mS cm-1 x 0,40 mg L-1 
 
 
 
 
 
 
 
22 
 
CLORETOS 
 
 Métodos disponíveis para a determinação de cloretos incluem as titulações 
argentométrica, potenciométrica e com nitrato de mercúrio. Os cloretos podem ser 
determinados também por cromatografia de íons. Existem também analisadores 
automáticos que utilizam um método colorimétrico em que o íon mercúrico contido no 
titulante, tiocianeto de mercúrio, forma um complexo estável com cloreto. Isso libera o 
tiocianeto, que reage com o íon férrico para formar o tiocianeto de ferro, um composto 
intensamente colorido. 
O método Mohr consiste na titulação da amostra com nitrato de prata (AgNO3), na 
presença do indicador cromato de potássio (K2CrO4). A reação entre o AgNO3 e o cloreto 
presente na amostra leva à formação do precipitado cloreto de prata (AgCl): 
 
Ag+ + Cl-  AgCl(s) 
 
Não havendo mais cloreto, o AgNO3 passa a reagir com K2CrO4 (cor amarela) 
formando o precipitado cromato de prata (Ag2CrO4), indicando o ponto final da titulação: 
 
2Ag+ + CrO4
2-  Ag2CrO4(s) cor avermelhada 
 
Deve-se realizar uma prova em branco para corrigir possíveis erros na 
determinação do ponto de viragem, devido à possível contaminação da água destilada 
usada para a lavagem das vidrarias e preparo de reagentes. 
As substâncias normalmente encontradas em águas potáveis não causam 
interferência. Brometo, iodeto e cianetosão quantificados como cloreto. O nitrato de 
prata reage preferencialmente com os sulfetos presentes na amostra, formando um 
precipitado preto (Ag2S): 
2AgNO3 + H2S  Ag2S + 2HNO3 
2AgNO3 + Na2S  Ag2S + 2NaNO3 
 
Utiliza-se o H2O2, que reage com os sulfetos em meio básico, para eliminar esta 
interferência: 
2H2O2 + H2S + 4OH
-  H2SO4 + 4H2O 
2H2O2 + Na2S + 4OH
-  Na2SO4 + 4H2O 
 
Os produtos dessa reação se dissolvem no meio e estabilizam a reação. 
Posteriormente, faz-se necessária a correção do pH do meio, que deve estar entre 6,5 e 
10,5. 
Em meio ácido, o cromato de potássio reagirá com o H+ presente na amostra e 
dará origem ao cromato ácido que não atua como indicador: 
 
CrO4
2- + H+  (HCrO4)
- 
 
Em meio básico a prata reagirá preferencialmente com o OH- presente na amostra 
e dará origem ao hidróxido de prata de acordo com a reação: 
 
Ag+ + OH-  AgOH 
 
23 
 
Quando a amostra apresentar cor e turbidez, podendo interferir de modo a não se 
conseguir detectar o ponto de viragem, adiciona-se uma suspensão de Al(OH)3, que é 
removido por de filtração. 
O ortofosfato em concentração maior que 25 mg l-1 precipita como fosfato de 
prata. Ferro em concentração maior que 10 mg l-1 pode mascarar o ponto final da 
titulação. 
 
Padronização 
 
 Diluir 10 mL da solução padrão de cloreto de sódio a 50 mL com água deionizada; 
 Ajustar o pH entre 7 e 10 com solução de ácido sulfúrico ou hidróxido de sódio; 
 Adicionar 0,5 mL da solução indicadora de cromato de potássio; 
 Titular com solução padrão de nitrato de prata até o aparecimento de coloração 
vermelho-tijolo (característica do ponto final da titulação). 
 Calcular a molaridade através de: 
 
M2 = M1 x V1 
 V2 
 
M1= Molaridade do NaCl 0,141M 
V1= Volume de NaCl (10 mL) 
M2= Molaridade real do nitrato de prata - AgNO3 
V2= Volume de nitrato de prata gasto na titulação 
 
Materiais e reagentes 
 
Erlenmeyer (125 mL) 
Indicador cromato de potássio 
Nitrato de prata (0,0141M) 
Bureta (50 mL) 
 
Procedimento 
 
Em um erlenmeyer coloca-se 50 mL de amostra e adiciona-se 1 mL de cromato de 
potássio e mistura-se bem. A solução ficará amarela. Titular com nitrato de prata 
0,0141M até a solução apresentar uma coloração marrom-tijolo. Anotar o volume gasto 
para titular a solução (V1). 
 
Cálculo 
 
A concentração de cloreto é dada por: 
 
Quantidade de cloretos (mg L-1) = (Va-Vb) x M2 x 35450* 
 mL da amostra 
 
Va= mL de solução de nitrato de prata gastos para titular a amostra 
Vb= mL de solução de nitrato de prata gastos para titular a prova em branco 
M2= molaridade da solução de nitrato de prata. 
*massa molecular do cloro a fim de obter mg/L 
 
24 
 
FERRO TOTAL 
 
 O Ferro em excesso, pode causar sabor e odor na água, mas nesse estágio, o 
consumidor já terá uma evidência de contaminação, pois haverá uma modificação visível 
na coloração da água. O excesso de ferro na água pode causar sérios prejuízos, como 
manchas em roupas claras, em louças sanitárias entre outros. Esta norma prescreve o 
método colorimétrico do ferro/tiocianato para a determinação de ferro total, ferro solúvel, 
ferro férrico e ferro ferroso em amostras de águas naturais, águas minerais e de mesa, de 
abastecimento, residuárias domésticas e industriais. 
Nos processos de determinação de Fe(II), é utilizado geralmente o sulfato ferroso 
amoniacal ou sal de Mohr, (NH4)2Fe(SO4)2.6H2O¸ uma vez que este sal apresenta maior 
resistência a oxidação. O sistema ferro/tiocianato, em meio ácido, permite a exploração 
espectrofotométrica para a determinação de Fe (II), por esta razão é propício o uso do íon 
tiocianato como complexante. 
 
Materiais e reagentes 
 
Chapa quente 
Proveta (50 mL) 
Erlenmeyer 
Água destilada 
Solução padrão de ferro 
Ácido clorídrico, HCl, concentrado, p.a 
Cloridrato de hidroxilamina 
Tiocianato de potássio KSCN 10% 
Solução de permanganato de potássio KMO4 0,1 
UV-Vis 
 
Construção da curva-padrão (Solução-estoque de ferro) 
 
 Adicionar lentamente 20 mL de ácido sulfúrico concentrado p.a., H2SO4, a 100 mL de 
água destilada e dissolver 0,7022 g de sulfato ferroso amoniacal hexaidratado p.a 
(NH4)2Fe(SO4)26H2O. 
 Após total dissolução, adicionar gotas de solução de permanganato de potássio 0,1 M 
até que persista uma leve coloração rósea. 
 Diluir até 1000 mL com água destilada. 
 Preparar soluções de várias concentrações de ferro, fazendo diluições da solução-
padrão em balões volumétricos conforme as Tabelas 1 Nota: 1 mL contém 0,10 mg de Fe. 
 
Concentração de Fe 
(mg/L) 
mL de solução (padrão) e elevar a 100 mL com 
água destilada 
0,0 0,0 
0,2 2,0 
0,4 4,0 
0,6 6,0 
0,8 8,0 
1,0 1,0 
510 nm 
25 
 
Ferro total 
 
 Pipetar volumetricamente 100 mL de amostra, ou uma alíquota diluída a 100 mL e 
transferir para frasco de Erlenmeyer de 250 mL. 
 Adicionar 4 mL de ácido clorídrico concentrado p.a. e 2 mL de reativo de 
hidroxilamina, e aquecer até a ebulição. Para assegurar a total dissolução do ferro, 
manter a ebulição até que o volume seja reduzido a 15 mL - 20 mL. 
 Esfriar até temperatura ambiente em seguida adicionar 1 mL de KSCN 10%, e 
transferir para um balão volumétrico de 100 mL. 
 Fazer a leitura da intensidade de cor entre 5 min a 10 min, sem exposição a luz solar, a 
510 nm. 
 
Ferro ferroso (2+) 
 
 Coletar a amostra em frasco de vidro com selo d’água, sem deixar bolhas no interior 
do frasco, previamente adicionado de 2 mL de ácido clorídrico concentrado para cada 
100 mL da amostra e em seguida adicionar 1 mL de KSCN 10%. 
 Transferir para um balão volumétrico de 100 mL, fazer a leitura da intensidade de cor 
entre 5 min a 10 min, sem exposição a luz solar, a 510 nm. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
26 
 
ACIDEZ 
 
Acidez total representa o teor de dióxido de carbono livre, de ácidos minerais, de 
ácidos orgânicos e sais de ácidos fortes, os quais na hidrólise produzem íons de 
hidrogênio para a solução. 
Águas naturais, em geral, têm uma reação alcalina, porém, acidez não é 
necessariamente indesejável. A importância na determinação da acidez se prende ao fato 
de que sua variação brusca pode caracterizar o lançamento de algum resíduo industrial. 
Como já citado, a maioria das águas é considerada alcalina, embora possa conter 
gás carbônico, ou seja, a água pode apresentar ao mesmo tempo acidez e alcalinidade. 
O gás carbônico será o responsável pela acidez das águas naturais. Já a acidez 
mineral e acidez orgânica são resultantes de resíduos industriais. A acidez apresenta 
como inconveniente a corrosividade, em função deste fato, ressalta-se que uma água 
utilizada na indústria deve apresentar um pH acima de 8,3, pois acima deste pH não 
existe mais gás carbônico, reduzindo sua agressividade. 
 
 
Materiais e reagentes 
 
Erlenmeyers 250 mL 
Provetas graduadas de 100 mL 
Béqueres de 50 mL 
Pisseta 
Suporte de bureta 
Funil 
Hidróxido de sódio 0,01M 
Fenolftaleína 
 
Procedimento 
 
 Colocar no erlenmeyer (de 250 mL) 100 mL da amostra de água, medidos em uma 
proveta. 
 Juntar 3 a 4 gotas de fenolftaleína. 
 Titular com hidróxido de sódio 0,01M padronizado até viragem ao róseo, permanente 
por 30 segundos no mínimo. 
 Se a água ficar rósea ao adicionar a fenolftaleína sua acidez é nula. 
 
 
Cálculo 
 
Vamostra
mLVM
LmgCaCoAcidez
1000100)(
)/( 3

 
 
 
M = Molaridade do hidróxido de sódio 
V = Volume de NaOH gasto na titulação (mL) 
Vamostra = volume de amostra (mL) 
100 = se refere a massa molar do CaCO3 
1000 = Para obter resultados em mg. 
 
27 
 
Reações envolvidas 
 
Dissociação do gás Carbônico em água 
 
CO2(g) + H2O(l) → H2CO3(aq)↔ H
+
(aq) + HCO3
1-
(aq) 
 
 
Reação do acido carbônico com NaOH 
 
H+(aq) + HCO3
1-
(aq) + Na
+ + OH- → Na+ (aq) + HCO3
1-
(aq) + H2O(l) 
 
 
Reação do bicarbonato de sódio com NaOH 
 
Na+ (aq) + HCO3
1-
(aq) + Na
+ + OH- → Na
+
 (aq) + CO3
2-
(aq) + H2O(l) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
28 
 
ALCALINIDADE TOTAL 
 
A alcalinidade da água é representada pela presença de íons hidróxido, carbonato 
e bicarbonato. A importância do conhecimento das concentrações destes íons permite a 
definição de dosagens de agentes floculantes, fornece informações sobre as características 
corrosivas ou incrustantes da água analisada. 
Todos os íons causadores da alcalinidade têm características básica, sendo assim, 
reagem quimicamente com soluções ácidas, ocorrendo a reação de neutralização. 
Para determinação final da reação de neutralização iremos utilizar um indicador. 
Na analise de alcalinidade utilizaremos dois indicadores, com pontos de viragem em 
função das diversas formas de alcalinidade. 
pH > 9,4 → hidróxido e carbonatos 
8,3 < pH < 9,4 → carbonatos e bicarbonatos 
4,4 < pH < 8,4 → apenas bicarbonatos 
Para quantificação dos íons OH- e CO3
2-, o indicador mais utilizado é a 
fenolftaleína, sua faixa de pH de atuação é de 8,3 a 9,8, em pH menor que 8,3, não 
apresenta coloração (incolor) enquanto acima de 8,3 assume a cor rosa. 
Na quantificação dos íons HCO3
-, podem ser utilizados os seguintes indicadores: 
Metilorange: faixa de pH de atuação varia de 3,1 a 4,6, acima de 3,1 apresenta coloração 
vermelha e abaixo de 3,1 assume a cor laranja. 
Vermelho de metila: faixa de pH de atuação varia de 4,4 a 6,2, acima de 4,4 apresenta 
coloração amarela e abaixo de 4,4 assume a cor vermelha. 
Indicador misto: constituído de vermelho de metila e de verde de bromocresol, 
solubilizados em álcool etílico ou isopropílico, que passa da cor azul a cor salmão. 
Os indicadores quando adicionados à amostra apresentam colorações que indicam 
a presença ou não de um ou mais tipos de alcalinidade. 
Ao adicionarmos fenolftaleína à amostra, surgindo uma coloração rosa, significa a 
possibilidade da presença de hidróxido, ou carbonato, ou hidróxido/carbonato 
simultaneamente na amostra de água. A alcalinidade à fenolftaleína será quantificada 
utilizando um ácido de concentração conhecida, que adicionado quantitativamente à 
amostra neutralizará a alcalinidade presente, mudando a cor de rosa para incolor. 
Se após a adição de fenolftaleína a amostra se mantiver incolor, afirmamos que a 
alcalinidade à fenolftaleína é igual a zero. 
Após o teste de alcalinidade a fenolftaleína, iremos testar a presença de 
alcalinidade ao metilorange, caso a amostra tome a coloração laranja ou avermelhada a 
alcalinidade é zero. Se a amostra apresentar coloração amarela, iremos avaliar a 
alcalinidade ao metilorange com o mesmo ácido utilizado na quantificação da 
alcalinidade à fenolftaleína. 
Ao se iniciar a adição de solução ácida, irá ocorrer primeiro a reação com o íon 
mais básico e a seguir com os mais fracos. 
Caso se deseje expressar os resultados segundo os íons básicos causadores da 
alcalinidade, utilize, nos cálculos, a seguinte tabela: 
 
Resultado da 
titulação 
ALCALINIDADE 
Hidróxidos Carbonato Bicarbonato 
F = 0 0 0 T 
F < 1/2xT 0 2xF T – 2xF 
F = 1/2xT 0 2xF 0 
F > 1/2xT 2F – T 2(T - F) 0 
F = T T 0 0 
29 
 
Obs.: F = Volume gasto na titulação da alcalinidade à fenolftaleína 
M1 = Volume gasto na titulação da alcalinidade à metilorange; T = Volume total = F + 
M1 
 
Materiais e reagentes 
 
Erlenmeyers de 250 mL 
Provetas de 100 mL 
Bureta de 25 mL ou 50 mL 
Suporte de bureta 
Funil 
Béquer de 50 mL 
Tubo de ensaio 
Ácido sulfúrico 0,01M 
Solução indicadora de fenolftaleína 
Solução indicadora de metilorange ou vermelho de metila 
 Solução de tiossulfato de sódio 0,1M 
 
Procedimento 
 
 Adicione 100 mL da amostra a ser analisada em um erlenmeyer de 250 mL e junte 
aproximadamente 3 gotas de fenolftaleína. 
 Faça uma prova em branco, colocando em outro erlenmeyer 100 mL de água destilada 
e aproximadamente 3 gotas de fenolftaleína. 
 Caso a primeira amostra se tornar rósea, titule-a com ácido sulfúrico 0,01M 
padronizado, até o descoramento do indicador. Anote o volume gasto de ácido com 
“F”. 
 Adicione a cada frasco 3 gotas de metilorange. À prova em branco adicione 1 gota de 
ácido 0,1M (esta adquirirá uma cor vermelho-laranja, que servirá como padrão). 
 Se a amostra se tornar amarela, prossiga a titulação com o ácido 0,01M, até que a cor 
da mesma se iguale à da prova em branco. Anote o volume gasto de ácido com “M1”. 
 
Obs.: Se a amostra for clorada, remover o cloro residual pela adição de 0,10 mL (duas gotas da 
solução de tiossulfato de sódio 0,1 M para cada 100 mL de amostra. 
 
 
Denomine o volume total de ácido sulfúrico 0,01M usado de “T” (volume gasto 
de ácido 0,01M com a titulação usando a fenolftaleína + volume gasto na titulação do 
metilorange). 
 
Cálculo 
 
amostraV
mLVtMc
LmgCaCodeAlcalinida
1000100)(
)/( 3

 
 
Onde 
 
 Vt = V1+ V2 = volume total de solução 0,01M de H2SO4 consumido nas titulações. 
 V1 = volume em mL de solução 0,01M de H2SO4 necessário à titulação da água, usando fenolftaleína como 
indicador. 
30 
 
 V2 = volume em mL de solução 0,01M de H2SO4 necessário à titulação da água, usando metilorange como 
indicador. 
 Mc = Molaridade do ácido sulfúrico corrigido pela padronização ou usar na fórmula MxFc (Molaridade vezes o 
fator de correção) 
 Vt = Volume de ácido gasto na titulação (mL) 
 Vamostra = volume de amostra (mL) 
 100 = se refere a massa molar do CaCO3 
 1000 = Para obter resultados em mg. 
 
 
Reações envolvidas 
 
 
Ácido das águas minerais forma-se na reação do gás carbônico com a água: 
 
Reação do bicarbonato de sódio com H2SO4 
2Na+ (aq) + 2HCO3
1-
(aq) + 2H
+ + SO4
2-
 →Na2SO4(aq) + 2CO2(g) + 2H2O(l) 
 
Reação do carbonato de sódio com H2SO4 
2Na+ (aq) + CO3
2-
(aq) + 2H
+ + SO4
2-
 →Na2SO4(aq) + CO2(g) + H2O(l) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
31 
 
ALCALINIDADE DE RIPLEY E ÁCIDOS VOLÁTEIS 
 
 
Alcalinidade 
 
1. Medir 50 mL da amostra e colocar em um béquer. 
2. Medir e anotar o pH da amostra. 
3. Caso o pH estiver acima de 5.75, titular sob agitação magnética com ácido 
sulfúrico 0,05M até pH 5,75 (manter o eletrodo na amostra quanto titula, próximo 
a parede do béquer para evitar que o mesmo se quebre). 
4. Anotar o volume gasto de H2SO4 (V1). 
5. Continuar titulando até pH 4,30. 
6. Anotar o volume gasto de H2SO4 (V2). 
 
 
V3 = V1 + V2 
 
 
Alcalinidade parcial = V1. MH2SO4 .50000 (mg L
-1, como CaCO3) 
V amostra 
 
 
 
Alcalinidade intermediária = V2. MH2SO4 .50000 (mg L
-1, como CaCO3) 
V amostra 
 
 
 
Alcalinidade total = V3. MH2SO4 .50000 (mg L
-1, como CaCO3) 
V amostra 
 
 
 
Alcalinidade a bicarbonato = Atotal -0.71 .(ácidos voláteis) (mg L
-1, como CaCO3) 
 
 
Obs: O valor 50000 é o equivalente grama do CaCO3 em mg L
-1. 
 
 
 
 
Acidez 
 
7. Continuar titulando até pH < 3. 
8. Aquecer a amostra na chapa aquecedora até 90ºC por 3 minutos até que comece a 
borbulhar, antes de ferver. 
9. Esfriar a temperatura ambiente 
10. Titular com NaOH 0,05M até pH 4. 
11. Anotar o volume gasto de NAOH (V4) 
12. Continue titulando até pH 7 
32 
 
13. Anotar o volume gasto de NaOH (V5) 
 
V6 = V5-V4. 
 
 
Alcalinidade a ácidos voláteis = V6. MNaOH .60000 (mg L
-1, como HAc) 
 V amostra 
 
 
Obs: O valor 60000 é o equivalente grama do HAc (ácido acético) em mg L-1. 
 
 
Cálculos dos ácidos voláteis 
 
 
Caso 1 = Alcalinidade a ácidos voláteis (como HAc) > 216 mg L-1. 
Ácidos voláteis = alcalinidade a ácidos voláteis x 1,50 
 
 
 
Caso 2 = Alcalinidade a ácidos voláteis(como HAc) < 216 mg L-1. 
Ácidos voláteis = alcalinidade a ácidos voláteis x 1,00 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
33 
 
DEMANDA BIOQUÍMICA DE OXIGÊNIO – (DBO520ºC) 
 
 
Também conhecida pela sigla DBO, a Demanda Bioquímica de Oxigênio 
corresponde à quantidade de oxigênio necessária para ocorrer a oxidação da matéria 
orgânica biodegradável sob condições aeróbicas. Essa unidade de medida avalia a 
quantidade de oxigênio dissolvido (OD) em miligramas (mg), equivalente à quantidade 
que será consumida pelos organismos aeróbicos ao degradarem a matéria orgânica. 
O processo ocorre da seguinte forma: inicialmente os microorganismos utilizam o 
oxigênio dissolvido (OD) para transformar o carbono em CO2 e depois para transformar 
os compostos nitrogenados em nitratos (NO3-) e nitritos (NO2-). Essas transformações são 
essenciais na determinação da DBO, que se divide em demanda carbonácea (presença de 
CO2) e demanda nitrogenada (nitratos e nitritos). 
O valor da Demanda Bioquímica de Oxigênio é usado para estimar a carga 
orgânica dos efluentes e dos recursos hídricos, e com esses valores é possível calcular 
qual a necessidade de aeração (oxigenação) para degradar essa matéria orgânica nas 
Estações de Tratamento de Esgoto (ETE’s). 
 
Princípio do método 
 
A análise de DBO consiste em incubar as amostras em frascos especialmente 
utilizados para a DBO, à temperatura de 20 ±1 ºC no escuro por um período de cinco 
dias. No início e ao final do quinto dia mede-se a concentração de oxigênio dissolvido 
(OD) presente na amostra e obtém-se por diferença, a demanda requerida pelos 
microrganismos para a oxidação da matéria orgânica presente na amostra. 
A quantificação de OD pelo método de Winkler, ou método iodométrico é baseado 
na adição de uma solução de manganês reduzido (Mn2+) seguida de uma solução 
contendo uma base (OH-), íons iodeto (I-) e azida (N3
-), o que resulta na produção de um 
hidróxido gelatinoso de manganês II. 
 
Mn2+ + 2OH-  Mn(OH)2 (precipitado branco) 
 
A presença do precipitado branco no frasco evidencia a ausência de OD. No 
entanto, se presente, o oxigênio dissolvido oxida rapidamente uma quantidade 
equivalente do precipitado de hidróxido de manganês para uma valência mais elevada 
(Mn4+). 
Mn2+ + 2OH- + ½O2  MnO2 (precipitado marrom) + H2O 
 
Com a adição de ácido sulfúrico o manganês é agora reduzido e os íons iodeto 
oxidados, levando à liberação de iodo (I2) na mesma proporção da concentração inicial de 
OD. 
 
MnO2 + 2I
- + 4H+  Mn2+ + I2 + 2H2O 
 
O iodo é então titulado com uma solução padronizada de tiossulfato de sódio, 
formando tetrationato de sódio. 
2Na2S2O3 + I2  Na2S4O6 + 2NaI 
 
34 
 
Existem também eletrodos seletivos de membrana para a quantificação de OD. 
Esses são muito úteis para determinação in situ de OD. Eles são calibrados pela 
determinação de OD em amostras que já foram analisados pelo método Winkler. 
 
Coleta e preservação da amostra 
 
A preservação pode ser realizada através de refrigeração da amostra a 4 ºC, mas o 
prazo para a realização da análise de DBO é de 24 horas. Para medição de OD, a 
preservação pode ser realizada pela adição de 2 mL de solução de sulfato manganoso, 2 
mL de solução de iodeto e azida e 2 mL de ácido sulfúrico concentrado no frasco de 
análise (frasco de DBO). 
 
Materiais e Reagentes 
 
Bomba de ar comprimido 
Estufa incubadora para DBO 
Proveta 100 ml 
Béquer de 100, 500 ml 
Frascos de DBO 
Pipeta volumétrica de 100 ml 
Erlenmeyer de 250 ml 
Pipeta graduada de 2, 5, 10 ml 
Bureta de 10 ou 25 ml 
Solução alcalina de iodeto-azida 
Solução de sulfato manganoso 
Solução de amido 
Solução de tiossulfato de sódio (Na2S2O3) 0,0125M, padronizada 
Solução tampão fosfato 
Ácido sulfúrico concentrado 
Solução de cloreto de cálcio (CaCl2) 
Solução de cloreto férrico (FeCl3) 
Solução de sulfato de magnésio (MgSO4) 
 
Procedimentos 
 
Diluição 
 
 Diante do desconhecimento do teor de matéria orgânica presente em uma amostra, 
deve-se levar em consideração a sua natureza tendo em vista que uma diluição 
inadequada da amostra pode provocar um consumo total de oxigênio antes do quinto dia 
e no outro extremo, de uma diluição exagerada pode não ocorrer qualquer consumo de 
OD. Em ambos os casos o teste será inválido. Desta forma é recomendável que, na 
medida do possível, reunam-se informações prévias sobre o teor e a natureza da matéria 
orgânica presente na amostra. 
 Deve-se trabalhar com diluições que ao final do quinto dia garantam no frasco um 
residual de oxigênio dissolvido de no mínimo 2 mg L-1. Na ausência de qualquer outro 
indicativo, as diluições no Quadro 1 servem como referência. É recomendável preparar 
três diluições diferentes de amostras desconhecidas. 
 
35 
 
 
 
 
Quadro 1. Diluições de amostras sugeridas para análise de DBO de diferentes tipos de 
amostras 
Tipo de Efluente mL de amostra (em frasco de 300 ml) 
Esgoto bruto 0,3 – 3 
Esgoto sedimentado 3 – 15 
Esgoto tratado 15 – 75 
Rios ou lagoas poluídas 75 – 150 
 
Água de Diluição 
 
 As diluições devem ser feitas com água de diluição, preparada em volume 
determinado pelo número de amostras, diluições e réplicas a serem analisadas. 
 Utilizando um compressor de ar comprimido, sature com ar a água destilada de 
maneira a obter um elevado teor de oxigênio dissolvido, por cerca de trinta minutos. 
 Para cada litro de água, adicionar 1 mL das seguintes soluções: CaCl2, FeCl3, MgSO4 
e solução tampão fosfato. 
 Deve-se esperar 30 min após o término da aeração antes de se utilizar a água de 
diluição. 
 
Amostras 
 
 Para cada amostra devem-se realizar duas leituras de oxigênio dissolvido (OD), sendo 
uma no primeiro dia (OD0), e outra após o período de cinco dias em estufa incubadora a 
20 ±1 ºC (OD5). As análises devem ser realizadas em duplicata. Portanto, será necessário 
preparar quatro frascos para cada diluição de cada amostra (dois para OD0 e dois para 
OD5). 
 Deve-se ter cuidado de se evitar a formação de bolhas de ar durante o manuseio da 
amostra e água de diluição na hora de encher os frascos e durante a execução da análise. 
 Por ser um bioensaio, o resultado da determinação de DBO sofre fortemente a 
influência da presença de substâncias tóxicas ou de um inóculo bacteriano de baixa 
atividade. Portanto é aconselhável verificar a qualidade da água de diluição, do inoculo 
de microrganismos e da técnica analítica periodicamente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
36 
 
 
OXIGÊNIO DISSOLVIDO (método Winkler modificado pela azida) 
 
 
 Ao frasco de DBO contendo a amostra, adicionar 1 mL da solução de sulfato 
manganoso utilizando uma pipeta graduada, mergulhando-a até o fundo do frasco. Da 
mesma forma, adicionar 2 mL da solução de iodeto e azida. 
 Fechar o frasco com o cuidado de não deixar bolhas de ar em seu interior, e agitar por 
meio de inversões sucessivas. Deixar o precipitado sedimentar até aproximadamente 
metade do frasco. Caso o precipitado tenha uma coloração esbranquiçada a análise é 
finalizada, pois não existe oxigênio dissolvido na amostra. 
 Caso o precipitado apresente uma coloração marrom, após a precipitação adicionar 2 
mL de ácido sulfúrico concentrado (H2SO4) e agitar até a sua completa dissolução. 
 Pipetar exatamente 100 mL (com pipeta volumétrica) da solução em um erlenmeyer de 
250 mL e titular com solução Na2S2O3 0,0125M padronizada, de amarelo palha até 
incolor. 
 
Cálculos 
 
DBO, mg L-1 = (OD0 – OD5) 
 P 
 
OD (mg L-1 O2) = mL Na2S2O3 gastos na titulação, isto é, 1 mL Na2S2O3 0,0125M
 = 1 mg 
L-1 OD quando se titula uma alíquota de 100 mL da amostra. 
Onde: 
OD0 = OD da amostra diluída imediatamente após seu preparo, mg L
-1 
OD5 = OD da amostra diluída após incubação por cinco dias a 20 ºC, mg L
-1 
P = fração decimalda amostra utilizada 
 
Se por acaso houver algum imprevisto na avalição do OD dentro de 5 dias, por 
exemplo, antecipando-se ou atravessando-se a avaliação do OD, pode-se utilizar a 
seguinte tabela para correção do cálculo da DBO: 
 
- 3 dias valor da DBO encontrado × 1,360 
- 4 dias valor da DBO encontrado × 1,133 
- 5 dias valor da DBO encontrado × 1,000 
- 6 dias valor da DBO encontrado × 0,907 
- 7 dias valor da DBO encontrado × 0,850 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
37 
 
DEMANDA QUÍMICA DE OXIGÊNIO (DQO) – MÉTODO COLORIMÉTRICO 
 
 
A DQO se baseia no fato de alguns compostos orgânicos serem oxidados por 
agentes químicos oxidantes considerados fortes, como por exemplo, o K2Cr2O7 
(dicromato de potássio) em meio ácido, sendo o resultado final desta oxidação o dióxido 
de carbono e água. É a quantidade de O2 necessária para a oxidação da matéria orgânica 
através de um agente químico. 
Nesta técnica podem ser utilizadas várias substancias químicas como oxidantes, o 
importante é que para um mesmo estudo seja empregado o mesmo oxidante e os mesmos 
procedimentos, porque a proporção da matéria orgânica a ser oxidada depende do 
oxidante, da estrutura dos compostos orgânicos presentes na amostra e do processo de 
manipulação dos reagentes e dos equipamentos. 
Como já citado, o processo se baseia na oxidação de matéria orgânica por uma 
mistura em ebulição de ácido crômico e acido sulfúrico (bicromato de potássio em meio 
ácido). 
O excesso de bicromato é titulado com sulfato ferroso amoniacal usando o “ferroin” 
(complexo ferroso de orto-fenantrolina). 
Segundo alguns autores, para esgotos domésticos brutos, a relação DQO/DBO5 se 
enquadra na faixa de 1,7 a 2,4. Com relação aos esgotos industriais, a relação varia numa 
faixa mais ampla, e desta relação, tiram-se algumas conclusões sobre a 
biodegradabilidade dos despejos. 
A relação DQO/DBO5, permite ainda, definir qual o processo de tratamento a ser 
realizado: 
 
Relação DQO/DBO5 baixa: a fração biodegradável é elevada, o que indica a utilização 
de tratamento biológico. 
 
Relação DQO/DBO5 elevada: a fração inerte, ou seja, não biodegradável é alta; se a 
fração não biodegradável, não for importante em termos de poluição do corpo hídrico 
receptor, indica-se um tratamento biológico; caso a fração não biodegradável, seja 
importante em termos de poluição, indica-se o tratamento físico-químico. 
 
Materiais e Reagentes 
 
Tubos 
Pipetas volumétricas de 2 e 5 mL 
Pera 
Béqueres 
Bloco digestor 
Solução padrão de hidrogeno-ftalato de potássio (1500ppm) 
Solução digestora (ácido sulfúrico/dicromato de potássio/sulfato de mercúrio) 
Solução catalítica (ácido sulfúrico/sulfato de prata) 
Papel absorvente 
 
Procedimento 
 
 Homogeneizar a amostra e com auxílio de uma pipeta transferir 2,5 mL para o tubo de 
ensaio. 
 Fazer uma prova em branco usando o mesmo volume (2,5 mL) de água destilada. 
38 
 
 Adicionar 1,5 mL da solução digestora e cuidadosamente adicionar 3,5mL da solução 
catalítica (ácido sulfúrico/sulfato de prata). 
 Tampar o tubo. Gire cuidadosamente para homogeneizar e limpe-o externamente com 
papel macio e absorvente. 
 Inserir o tubo no bloco digestor mantendo a 150ºC por aproximadamente 2 horas. 
 Resfriar o tubo a temperatura ambiente e esperar a sedimentação de possíveis sólidos. 
Efetuar leitura em espectrofotômetro a 600 nm e calcular a concentração a partir da 
equação da curva de calibração. 
 
 
Preparação da curva de calibração 
 
Preparar no mínimo 5 padrões à partir da solução de hidrogeno-ftalato de potássio 
de acordo com a tabela a seguir, seguindo os mesmos passos requerido no procedimento 
com as mostras. Plotar o gráfico concentração versus absorbância. 
 
Concentração 
mL de solução 
padrão 
mL de H2O 
Solução 
digestora 
(mL) 
Solução 
catalítica 
(mL) 
0 0,0 2,5 1,2 2,8 
120 0,2 2,3 1,2 2,8 
240 0,4 2,1 1,2 2,8 
360 0,6 1,9 1,2 2,8 
480 0,8 1,7 1,2 2,8 
600 1,0 1,5 1,2 2,8 
720 1,2 1,3 1,2 2,8 
840 1,4 1,1 1,2 2,8 
960 1,6 0,9 1,2 2,8 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
39 
 
DEMANDA QUÍMICA DE OXIGÊNIO (DQO) – MÉTODO REFLUXO 
FECHADO TITULOMÉTRICO 
 
 
Materiais e Reagentes 
 
Tubos 
Pipetas volumétricas de 2 e 5 mL 
Pera 
Béqueres 
Bloco digestor 
Solução digestora (dicromato de potássio 0,0167M) 
Solução catalítica (ácido sulfúrico/sulfato de prata) 
Ferroína 
Sulfato ferroso amoniacal 0,025M 
 
Procedimento 
 
Digestão 
 
 Homogeneizar a amostra e com auxílio de uma pipeta transferir 2,5 mL para o tubo de 
ensaio. 
 Fazer uma prova em branco usando o mesmo volume (2,5 mL) de água destilada. 
 Adicionar 1,5 mL da solução digestora (dicromato de potássio 0,0167M) e 
cuidadosamente adicionar 3,5mL da solução catalítica (ácido sulfúrico/sulfato de 
prata). 
 Tampar o tubo. Gire cuidadosamente para homogeneizar e limpe-o externamente com 
papel macio e absorvente. 
 Inserir o tubo no bloco digestor mantendo a 150ºC por aproximadamente 2 horas. 
 Resfriar o tubo a temperatura ambiente. 
 
Titulação 
 
 Transferir o conteúdo do tubo para um erlenmeyer. 
 Adicionar 1 a 2 gotas de ferroína. 
 Titular com solução de sulfato ferroso amoniacal padronizado. O ponto final da 
titulação é a mudança de coloração de verde-azulado para marrom-avermelhado. Não 
considerar o reaparecimento da coloração verde-azulada se esta ocorrer dentro de alguns 
minutos. 
 
Padronização 
 
Observação: A padronização deverá ser feita toda vez que realizar a análise! 
 Adicionar a um erlenmeyer 2,5mL de água destilada. 
 Adicionar 1,5 mL da solução digestora (dicromato de potássio 0,0167M). 
 Adicionar 3,5 mL da solução catalítica (ácido sulfúrico/sulfato de prata). 
 Adicionar 1 a 2 gotas de ferroína. 
 Titular com solução de sulfato ferroso amoniacal 0,025M. 
 Calcular a molaridade exata atráves da fórmula: 
40 
 
M = V2 x 0,025 x 4 
 V1 
 
 
 Onde: 
 M = molaridade de solução de sulfato ferroso amoniacal. 
 V1 = volume da solução de dicromato de potássio. 
 V2 = volume de sulfato ferroso amoniacal usado na titulação e mL. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
41 
 
DUREZA 
 
 
A dureza é provocada pela presença de sais de cálcio e magnésio. Não apresenta 
importância sanitária, mas o uso de uma água com excesso destes íons leva a nível 
industrial a problemas de incrustações, corrosão e a perda de eficiência na transmissão de 
calor em caldeiras e em sistemas de refrigeração. 
Na indústria de alimentos a formação de filmes e depósitos minerais na superfície 
de equipamentos, prejudica o processo de higienização. De acordo com os teores de sais 
de cálcio e magnésio, expressos em mg / L de CaCO3, a água pode ser classificada em: 
 
Água mole Até 50 mg/L 
Água moderadamente dura De 50 a 150 mg/L 
Água dura De 150 a 300 mg/L 
Água muito dura Acima de 300 mg/L 
 
 
Material e reagentes 
 
Erlenmeyers de 250 mL 
Provetas de 100 mL 
Bureta de 25 mL ou 50 mL 
Suporte de bureta 
Funil 
Béqueres de 50 ou 100 mL 
Pipetas volumétricas de 50 mL 
Pisseta 
Solução do sal dissódico do EDTA 0,01M padronizada 
Solução Tampão (pH = 10 ± 0,1) ou Hidróxido de amônio R 
Indicador Negro de Eriocromo 
 
Procedimentos 
 
 Meça 100 mL da amostra de água e transfira para um erlenmeyer de 250 mL. 
 Adicione 1 mL de solução tampão ou 1 mL de Hidróxido de amônio R. 
 Adicione duas gotas de indicador negro de eriocromo ou uma ponta de espátula, agite 
até completa dissolução. 
 Titule lentamente com a solução do sal dissódico de EDTA 0,01M padronizado, até 
que a cor vermelha desapareça e surja a cor verde. 
 
Obs.: Tenha cuidado de adicionar as últimas gotas do titulante em intervalos de 3 a 5 
segundos. A titulação não deve demorar mais que5 minutos, a partir do momento que se 
adiciona a solução tampão. 
 
Cálculos 
 
Dureza (mg CaCO3/L) = M .V(mL)x100x1000 
 Vamostra 
Onde: 
M = Molaridade do EDTA 
42 
 
Vamostra = Volume da amostra 
V = volume gasto de EDTA na titulação de determinado volume de amostra, descontando-se o volume 
gasto na prova em branco (titulação com EDTA da água desionizada utilizada na determinação, segundo o 
mesmo procedimento utilizado com a amostra). 
100 = representa o peso molecular do CaCO3 . 
1000 = para expressar em miligramas. 
 
 Para o EDTA reagir com o íon metálico os íons de hidrogênio ligados aos grupos 
carboxilatos devem ser removidos. Em soluções fortemente básicas esses hidrogênios são 
removidos por reação com o íon hidróxido. Em soluções mais ácidas os íons metálicos 
devem ser capazes de deslocar os íons hidrogênio. Uma vez que os íons metálicos 
diferem significativamente na sua habilidade para deslocar esses íons, a acidez da solução 
pode ser usada para “regular” a reatividade do EDTA com os íons metálicos. Por 
exemplo, muitos íons metálicos reagem quantitativamente com uma quantidade 
estequiométrica de EDTA em pH 10, mas apenas poucos, como o Fe3+ e o Hg2
2+, também 
reagem quantitativamente em pH 2. 
 Normalmente, as soluções a serem tituladas com EDTA são tamponadas de modo 
que o pH permaneça constante mesmo com a liberação de íons hidrogênio à medida que o 
complexo vai sendo formado. O pH é normalmente ajustado no valor mais baixo que 
torna possível a complexação. Em valores altos de pH muitos íons metálicos tendem a 
hidrolisar e até mesmo a precipitar como hidróxidos. Em muitas titulações a concentração 
do cátion é mantida tão baixa quanto 0,01M a 0,001M para diminuir as chances de 
precipitação. 
Outras vezes, para minimizar esse problema, são adicionados agentes 
complexantes auxiliares que reagem com o íon metálico evitando a sua precipitação 
quando o meio se tornar básico. O complexo formado deve ter estabilidade intermediária 
entre o hidróxido metálico e o complexo metal EDTA. Dessa forma, ele se formará 
preferencialmente ao hidróxido, mas o íon metálico será liberado à medida que o EDTA 
for sendo adicionado. A amônia é especialmente usada para esse propósito porque forma 
complexos solúveis com a maioria dos metais de transição e quando misturada com o seu 
ácido conjugado o íon amônio forma um tampão básico. 
 Alguns cátions podem ser determinados por titulação direta com solução padrão 
de EDTA usando indicadores metalocrômicos. Aqueles que formam complexos “fracos” 
como o Ca2+ e o Mg2+ devem ser titulados em solução básica com Erio T, Calmagita ou 
Arsenazo I. O tampão amônia/cloreto de amônio, de pH 9 a 10, é usado para metais que 
formam complexos com a amônia. Alguns cátions podem ser determinados por titulação 
direta mesmo quando não há o indicador adequado. Por exemplo, os indicadores para 
cálcio não são tão satisfatórios como para o magnésio. 
O titulante, em pH 10, é uma mistura de MgY2- e Y4-. À medida que o titulante vai 
sendo adicionado à solução contendo Ca2+ ocorrerá a formação do complexo mais estável 
CaY2- e a liberação do íon Mg2+ que por sua vez reage com o indicador para formar o 
complexo vermelho MgIn-. No ponto final da titulação uma quantidade adicional do 
titulante converte o complexo MgI nem MgY2- e o indicador retoma a forma livre azul. 
(Skoog et al., 2008). 
 
Reação de complexação com EDTA para determinação de dureza: 
 
 
43 
 
C CH2
N
CH2C
C C N
H2C
H2C C
C
HO OH
OH
O
O O
HO
O
H H
H H
C CH2
N
CH2C
C C N
H2C
H2C C
C
HO O
-
O-
O
O O
HO
O
H H
H H
Solução
Tampão
pH-10
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
44 
 
NITRATO 
 
 
Material e reagentes 
 
Tubos de ensaio 
Pipetas de 1 e 5 mL 
Pera 
Béquer 
Funil 
Papel de filtro 
Solução TRI (deve ser prepara a cada ensaio) 
Hidróxido de sódio 40% (NaOH) 
Ácido sulfúrico concentrado (H2SO4) 
Espectofotômetro 
 
 
Procedimento 
 
 Filtrar a amostra com o auxílio de um funil e papel de filtro. 
 Adicionar em um tubo de ensaio 1mL de amostra. 
 Adicionar 0,5 ml da solução TRI. 
 Levar a estufa de um dia para o outro ou até secar totalmente o líquido. 
 Obs.: para o branco adicionar somente 0,5mL da solução TRI. 
 Após seco: 
 Adicionar 1mL de ácido sulfúrico concentrado. 
 Adicionar 5ml de água destilada. 
 Aguardar 30 minutos. 
 Adicionar 5mL de hidróxido de sódio 40 % e esperar esfriar. 
 Ler no espectrofotômetro a 410nm. 
 
Fazer a curva 
 
 Repetir todo procedimento, porém no lugar da amostra adicionar 1ml de cada 
padrão. 
 Ler no espectrofotômetro a 410nm. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
45 
 
NITRITO 
 
 
Material e reagentes 
 
Béqueres ou erlenmeyers. 
Pipeta de 10mL 
Funil 
Papel de filtro 
Reagente colorimétrico para nitrito 
Espectrofotômetro 
 
Procedimento 
 
 Filtrar a amostra com o auxílio de um funil e papel de filtro. 
 Adicionar a um béquer o volume de amostra* (até 0,9mL em caso de diluição) 
Obs: Caso seja 1 ml adicionar 49mL de água – volume total será sempre 50ml) 
 Adicionar 50ml de água destilada. 
 Branco: 50ml de água destilada. 
 Adicionar 2 mL do reagente colorimétrico. 
 Homogeneizar a solução. 
 Aguardar 10 minutos. 
 Ler no espectrofotômetro em 543nm. 
 
Curva 
 
 Fazer diferentes padrões usando o nitrito de sódio (NaNO2) de acordo com o resultado 
esperado para cada tipo de amostra. 
 Repetir o procedimento acima com os diferentes padrões no lugar da amostra. 
 
Solução de 50 mg L-1 NO2
- = 0,075g de NaNO2 para 1L de solução. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
46 
 
AGENTES TENSOATIVOS (DETERGENTES) 
 
 
Os surfactantes são compostos que, como o nome indica, possuem atividade na 
superfície da interface entre duas fases, tais como ar-água [...] também são conhecidos 
como agentes tenso-ativos (SWISHER,1987). Exemplos desse grupo são LAS, DSS. Os 
surfactantes apresentam dois grupos em sua molécula: um hidrofóbico, apolar, e um 
hidrofílico, polar. A parte hidrofóbica pode apresentar afinidade tanto com gases, como 
por sólidos ou óleos, o que acarreta a geração de espumas e emulsões. 
Conforme Swisher (1987, p.32) a parte hidrofílica possui preferência pela água e 
pode conter grupos que se ionizam nesse solvente, chamados iônicos; o qual é 
subdividido em duas categorias: a primeira é a dos aniônicos, ou seja, que geram íons 
negativos quando em água, por exemplo, os sulfatos (R–O–SO3)
-Na+ a segunda são a dos 
catiônicos, que originam grupos positivos em água. 
No experimento realizado foi utilizado o método MBAS (Substâncias Ativa são 
Azul de Metileno), pois nesse método o par azul de metileno/íon aniônico surfactante, 
devido a sua alta estabilidade em fase orgânica, permanece substancialmente no 
clorofórmio quando lavado com este, mesmo com presença de água (SWISHER, 1987, p. 
64). 
 
Materiais e reagentes 
 
Funis de separação de 500 mL 
Proveta de 250 
Proveta de 10 mL 
Balões volumétricos de 25 mL 
Funis 
Pipetas graduadas de 5 mL 
Pipetas volumétricas de 10, 25, 50 e 100 mL 
Suporte universal 
Suporte para funil de separação 
Espectrofotômetro λ = 652 nm 
Fenolftaleína 
Bureta de 25 mL 
Béquer de 100 mL 
Solução padrão de LAS(DSS) 1 M 
Clorofórmio 
Solução de azul de metileno 
Solução de hidróxido de sódio 1,0 M 
Solução de H2SO4 0,5 mol/L 
Solução de lavagem LAS (DSS) 
Solução de fenolftaleína (indicador) 
Sulfato de sódio 
Água destilada 
Kitassato 
Funil de Buchner 
 
Preparação da curva de calibração e do branco 
 
47 
 
Diluir 4, 10, 20 e 40 mL da solução padrão de LAS (DSS) 1 mg L-1 em balões 
volumétricos de 50 mL, resultando em soluções padrões de 0,04; 0,10; 0,20 e 0,40 mg/L, 
respectivamente. Preparar uma amostra em branco seguindo o mesmo método. Asamostras foram preparadas pelo mesmo tratamento. 
 
 
Procedimento 
 
 Medir 25 mL da amostra em uma proveta, transferir essa alíquota para um funil de 
separação de 500 mL e adicionar 2 gotas de indicador fenolftaleína. 
 Adicionar 2 gotas da solução de NaOH 1M. Em seguida, acrescentar 2 gotas da 
solução de ácido sulfúrico 0,5M, tornando a solução incolor. 
 Adicionar 25 mL da solução de azul de metileno ao funil de separação e agitar até que 
a coloração azul fique uniforme na solução. Logo após, adicionar 15 mL de clorofórmio 
ao funil de separação e agitar vigorosamente. 
 Colocar os funis de separação no suporte e retirar suas tampas, para a separação de 
fases. 
 Feita a separação das fases, transferir a fase orgânica, clorofórmio, para um 
erlenmeyer de 500 mL contendo duas pontas de espátula de Sulfato de sódio. 
 Repetir a extração por mais duas vezes, porém com 15 mL de clorofórmio; após 
separar a fase do clorofórmio, transferir sempre para o mesmo erlenmeyer. 
 Ao completar todas as etapas descritas, filtrar a fase do clorofórmio com auxílio de um 
kitassato e funil de Büchner. 
 Transferir o filtrado para um balão volumétrico de 50 mL, completar com clorofórmio 
e fazer a leitura espectrofotométrica em um espectrofotômetro utilizando comprimento de 
onda de 652 nm em cubetas de 1cm. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
48 
 
COLIFORMES TOTAIS E TERMOTOLERANTES 
 
 
Os conforme extraído da Portaria Nº. 518/GM, de 25 de março de 2004, os 
coliformes totais são bactérias do grupo coliforme, bacilos gram-negativos, aeróbios ou 
anaeróbios facultativos, não formadores de esporos, oxidase-negativos, capazes de 
desenvolver na presença de sais biliares ou agentes tensoativos que fermentam a lactose 
com produção de ácido, gás e aldeído a (35,0 ± 0,5) oC em 24-48 horas, e que podem 
apresentar atividade da enzima ß -galactosidase. 
A maioria das bactérias do grupo coliforme pertence aos gêneros Escherichia, 
Citrobacter, Klebsiella e Enterobacter, embora vários outros gêneros e espécies 
pertençam ao grupo. Os coliformes termotolerantes fazem parte do subgrupo das 
bactérias do grupo coliforme que fermentam a lactose a (44,5 ± 0,2) oC em 24 horas; 
tendo como principal representante a Escherichia coli, de origem exclusivamente fecal. A 
Escherichia Coli é uma bactéria do grupo coliforme que fermenta a lactose e manitol, 
com produção de ácido e gás a (44,5 ± 0,2) oC em 24 horas, produz indol a partir do 
triptofano, oxidase negativa, não hidrolisa a uréia e apresenta atividade das enzimas ß 
galactosidase e ß glucoronidase, sendo considerada o mais específico indicador de 
contaminação fecal recente e de eventual presença de organismos patogênicos. 
 
Materiais e equipamentos 
 
Balança 
Agitador 
Autoclave que permita a circulação do vapor ao redor do material a ser esterilizado. 
Incubadora bacteriológica equipada com termostato para operar a 35°C± 0,5°C 
Incubadora bacteriológica equipada com termostato para operar a 44,5°C± 0,2°C 
Frasco para coleta de amostras: de vidro neutro ou plástico autoclavável atóxico 
Pipeta de 5 mL 
Tubos de Durham: de borossilicato ou vidro neutro, de 9mm de diâmetro e 45mm de 
comprimento. 
Tubos de ensaio: de borossilicato ou vidro neutro, de 15 ou 16mm de diâmetro x 150mm 
de comprimento, e de 18 mm de diâmetro x 180mm de comprimento, com tampas 
frouxas. 
Bico de Bunsen ou similar 
Estantes para colocação dos tubos de ensaio empregados na análise. 
Meio de Cultura Caldo EC; 
Meio de cultura Lauril; 
Peptona; 
Pêra; 
Alça de Platina; 
Peptona. 
 
Procedimento para determinação dos coliformes totais 
 
 Desinfetar a bancada, acender o bico de Bünsen, coletar 6 mL da amostra com uma 
pipeta, destinar 1 mL para a peptona e os outros 5 mL (se for realizado em quintuplicata) 
para os 5 tubos de caldo Lauril triptose. Repita o procedimento mais três vezes a fim de 
obter três diluições (Figura 1) ou quantas diluições forem necessárias. 
 
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Figura 1. Procedimento experimental de diluição* da amostra e inoculação em caldo lauril 
triptose. 
 
*Nota: A escolha da diluição deverá ser realizada pelo pesquisador a partir de ensaios 
prévios realizados com a amostra a fim de estabelecer a melhor diluição e/ou diluições a 
serem trabalhadas. 
 
 Incubar os tubos múltiplos a 35°C± 0,5°C por 48 horas e realizar a leitura. Os tubos 
que apresentarem produção de gás no tubo de Durham são positivos, os demais, negativos 
na fase presuntiva. De acordo com APHA (1998), após a fase presuntiva, deve-se realizar 
a fase confirmativa para coliformes totais, utilizando-se o caldo bile verde brilhante. Ou 
seja, todos os tubos positivos no caldo lauril, deverão ser replicados para o caldo bile 
verde brilhante e incubados a 35°C± 0,5°C por 48 horas onde a estimativa por NMP será 
realizada. 
 Após a leitura de coliformes totais (da fase presuntiva), desinfetar a bancada, acender 
o bico de Bunsen e esterilizar a alça de platina na chama, que deverá ficar avermelhada. 
Resfrie a alça no caldo EC e logo após coloque-a no tubo com o caldo lauril positivo e 
retorne ao EC (Figura 2). Repetir a operação para os próximos tubos de resultado 
positivo. Incube a amostra a 44,5°C± 0,2°C por 24 horas e realize a leitura conforme 
realizado para coliformes totais. A interpretação dos resultados está detalhada no item 5. 
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Figura 2. Procedimento experimental de repique dos caldos lauril positivos para o meio EC* 
 
*Nota: Pode-se utilizar em alternativa ao caldo EC, o caldo EC-MUG, que detecta a 
bactéria Escherichia coli, membro do grupo coliforme termotolerante. A Portaria 
2914/2011 do Ministério da Saúde estabelece que sejam realizadas análises 
microbiológicas na água para consumo humano do parâmetro Escherichia coli, a fim de 
verificar sua potabilidade. Ademais, deve-se realizar análise de coliformes totais na saída 
do tratamento, como indicador da eficiência do tratamento e de coliformes totais e E.coli 
no sistema de distribuição (reservatório e rede) a fim de verificar a integridade do 
sistema. 
 
 A Figura 3 resume os procedimentos que serão detalhados a seguir de acordo com 
APHA (1998). 
 
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 Figura 3. Adaptado e modificado de APHA (1998). 
 
 
Análise dos resultados 
 
Estimativa da densidade bacteriana 
 
 Para calcular a densidade de coliformes, calcule em termos do número mais provável 
(NMP). Os valores de NMP, para uma variedade de resultados, são apresentados na 
Tabela 1. Nessa tabela, estão incluídos os limites de confiança de 95% para cada valor de 
NMP determinado. Se os volumes de amostra utilizados forem àqueles encontrados nas 
tabelas, informe o valor correspondente ao número de resultados positivos e negativos na 
série como NMP/100 mL. A tabela 1 ilustra valores de NMP para combinações de 
resultados positivos e negativos quando cinco ensaios de 10 ml, cinco de 1,0 mL e cinco 
volumes de 0,1 mL são testados. 
 
 
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Tabela 1. Índice de NMP e limites de confiança de 95%, quando são inoculadas porções 
de 10mL, 1mL e 0,1mL da amostra. 
 
 
Quando a série de diluições decimais é diferente daquela representada na tabela, 
selecione o valor de NMP da Tabela 1 para a combinação de tubos positivos e calcule de 
acordo com a seguinte fórmula: 
 
 
 
 
 
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 Valor do NMP (tabela) X 10 
 Maior volume inoculado para compor a amostra = NMP/100mL 
 
Quando mais de três diluições são usadas em uma série decimal de diluições, use 
os resultados de apenas três destes na composição do código. Para selecionar as três 
diluições a serem utilizadas na determinação do índice NMP, escolha a série de menor 
volume da amostra (maior diluição) em que todos os tubos apresentaram resultados 
positivos