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Principais Técnicas de Biologia Celular e Molecular para o Diagnostico
Prof. Jonatas Fernandes
Diagnostico Celular
A avaliação de Células e Tecidos tem sido fundamental para o diagnostico de diversas enfermidades
Basicamente a utilização da biologia celular em analises clinicas se divide em dois principais campos:
# Histologia - A histologia (do grego: hydton = tecido + logos = estudos) é a ciência que estuda os tecidos biológicos, desde a sua formação (origem), estrutura (tipos diferenciados de células) e funcionamento.
# Patologia – Investigação e detecção de neoplasias 
Diagnostico Celular
Avaliação do grau de lesão em tecidos hepáticos – Hepatite, cirrose 
Avaliação do grau de lesão tecidual provocado por contato com algum patógeno 
Acompanhamento de tratamentos nocivos a células do organismo
Processos de restauração tecidual 
Avaliação do surgimento de neoplasias 
Biopsia
Diagnostico Celular
A enorme maioria das técnicas de diagnostico que utilizam a biologia celular partem da observação de tecidos e células.
E por conta disso existem duas técnicas primordiais utilizadas para esses tipos de analise 
Confecção de laminas teciduais 
Cultura de células
Confecção de laminas teciduais 
Um preparado permanente pode ser mais vantajoso para observação ao Microscópio do que a visualização de células vivas.
Confecção de laminas teciduais 
A técnica histológica visa a preparação dos tecidos destinados ao estudado à microscopia de luz. O exame ao microscópio é feito geralmente por luz transmitida, o que significa que a luz deve atravessar o objeto a ser examinado. Assim, é necessária a obtenção de fragmentos dos tecidos que serão coletados em lâminas muito finas e transparentes.
Confecção de laminas teciduais 
Os tecidos a serem processados para estudo ao microscópio devem ser preparados de modo a preservar sua estrutura original ao máximo possível. Entretanto, isso não é possível e todos os preparados apresentam artefatos, que são alterações produzidas nas células pelas técnicas utilizadas
Podemos resumir os passos das técnicas histológicas com a seguinte sequência: fixação dos tecidos, desidratação, inclusão, microtomia (corte em fatias finas), coloração e montagem de lâminas.
OBTENÇÃO DO MATERIAL E FIXAÇÃO
Uma boa preparação histológica se inicia com o uso correto das técnicas de obtenção do material. Todos os cuidados necessários devem ser tomados para coleta adequada da amostra e também para evitar a contaminação da mesma.
O transporte e armazenamento da mostra deve ser realizado em recipiente adequado. E a confecção de laminas dever ser feita o mais breve possível
FIXAÇÃO
A fixação paralisa o metabolismo celular e preserva as estruturas do tecido para os tratamentos posteriores.
A fixação evita a autólise celular, impede a proliferação de microrganismos, leva ao endurecimento do tecido para que resista ao tratamentos posteriores.
O fixador deve causar o mínimo de dano ao tecido e produzir o mínimo de artefatos. A escolha adequada da solução fixadora irá variar de acordo com o material que irá ser usado para a inclusão.
FIXAÇÃO
Glutaraldeído - Microtubulos
Formol 
Os fixadores preservam a estrutura dos tecidos ao interagirem com os grupos aminos das proteínas, através de pontes de hidrogênio.
FIXAÇÃO
O glutaraldeído possui dois grupos aldeídos um em cada extremidade de sua estrutura molecular que podem estabelecer pontes de hidrogênio entre as proteínas. 
As moléculas de formaldeído, no entanto, possuem apenas um grupamento aldeído, sendo um fixador menos eficiente para alguns tipos de proteínas.
FIXAÇÃO
1° Etapa: Fixação - Funções
Evita a Autólise;
Impede a proliferação bacteriana;
Confere resistências as células;
Aumenta a afinidade pelos corantes
DESIDRATAÇÃO , INCLUSÃO E MICROTOMIA
Para a observação ao microscópio de luz a espessura da secção do tecido presente em uma lâmina deve ser delgada o suficiente para que possa ser atravessado por um raio de luz. Para tal os tecidos devem ser criteriosamente preparados para receber um meio endurecedor, ou seja meio de inclusão. Desta forma será possível a obtenção de cortes delgados, obtidos no processo de microtomia.
Após a fixação com as soluções aquosas de glutaraldeído ou formalina, os tecidos devem ser desidratados, uma vez que a água presente nos tecidos não é miscível em substancias apolares como a parafina e as resinas de inclusão. 
DESIDRATAÇÃO , INCLUSÃO E MICROTOMIA
A desidratação será feita através de imersão numa bateria de soluções alcoólicas em concentrações graduais e crescentes. A graduação pode ser iniciada, se necessário, a partir de 50% e terminando finalmente em álcool absoluto. 
A graduação nas concentrações é imprescindível para que ocorra a desidratação homogênia dos tecidos, evitando que ocorram danos na estrutura tecidual.
A inclusão pode ser feita utilizando a parafina (mais comumente usada) e as resinas plásticas, como o glicol metacrilato. 
DESIDRATAÇÃO , INCLUSÃO E MICROTOMIA
O processo de inclusão se da basicamente pelo englobamento do tecido em um molde solido, envolto por parafina ou alguma resina plástica 
Microtomia
Após a inclusão do material em Parafina ou Resina Plástica é feita a microtomia;
Os tecidos são fatiados “Cortados” em espessuras entre 1 a 6 µm
* Micrótomo
Micrótomo
Tecnologias da Biologia Celular e Molecular
COLORAÇÃO
Os cortes de tecidos apresentam-se incolores após a microtomia. A coloração visa contrastar as estruturas teciduais. A ação da maioria dos corantes se baseia na interação entre os radicais ácidos ou básicos dos elementos químicos dos mesmos com os dos tecidos. No entanto existem outros tipos de corantes, como será descrito adiante.
COLORAÇÃO
Corantes Ácidos e Básicos
Eosina e Hematoxilina
 A hematoxilina é um corante básico que carrega uma carga positiva na porção da molécula que irá conferir cor ao tecido. Corantes básicos reagem com componente aniônicos das células e tecidos, os quais incluem grupos fosfatos, ácidos nucléicos e grupos carboxila das proteínas por exemplo.
A habilidade de grupos aniônicos reagirem com corantes básicos é chamada basofilia, estruturas celulares que se coram com corantes básicos são denominadas basófilas
COLORAÇÃO
Estruturas celulares que podem ser coradas com corantes básicos incluem heterocromatina, nucléolo, RNA ribossômico, matriz extracelular da cartilagem. A hematoxilina cora geralmente as estruturas em azul.
COLORAÇÃO
Corantes ácidos reagem com componentes catiônicos das células e tecidos. Quando usados juntamente com corantes básicos como a hematoxilina, coram o citoplasma, filamentos citoplasmáticos e fibras extracelulares. A eosina geralmente cora as estruturas em vermelho ou rosa.
COLORAÇÃO
Hematoxilina e eosina são corantes adequados para evidenciar características estruturais, mas eles não são capazes de revelar todos componentes celulares. Outras técnicas de coloração são disponíveis para evidenciar diferentes componentes.
Coloração pela prata – Algumas substâncias intra e extracelulares promovem a redução do nitrato de prata que formam precipitados negros em estruturas como fibras reticulares dos linfonodos, por exemplo.
Confecção de laminas teciduais 
Após a coloração as lâminas são montadas ou seja, os fragmentos são protegidos pela cobertura com lamínulas de vidro. Esta é colada na lâmina através de substâncias selantes como por exemplo o Entellan. Após a secagem, as lâminas podem ser observadas ao microscópio de luz.
Cultura de Células
Conjunto de técnicas que permitem cultivar ou manter células isoladas fora do organismo onde existem, mantendo as características próprias; 
 - Podem fazer-se culturas a partir tecidos humanos, animais e vegetais; 
 A cultura de tecidos implica a prévia desagregação (mecânica ou enzimática) do tecido original e em que as células são cultivadas numa camada aderente, num substrato sólido ou em suspensão em meio de cultura.
APLICAÇÕES
-Obtenção de informações preciosas a respeito das propriedadese do comportamento biológico das células;
-Análise do metabolismo celular,
-Influência de agentes externos na biologia das células (fatores de crescimento, hormônios, substâncias tóxicas);
-A influência do papel genético nas atividades celulares;
-Estudos em virologia;
Vantagens da Cultura Celular
Possibilidade de estudar fenómenos,inacessíveis em tecidos intactos; 
Controlo das condições ambientais (pH, temperatura, concentração de O2 e CO2, etc);
Obtenção de células com boa homogeneidade e bem caracterizadas;
Economia de reagentes, tempo, etc.
Conhecimento de comportamento e função de uma população isolada de células;
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Cultura de Células
Método cada vez mais utilizado que consiste em cultivar células isoladas fora do organismo onde existe.
 Há dois tipos de cultura celular:
Cultura primária: cultura preparada directamente de tecidos de um organismo, com ou sem passo inicial de fraccionamento das células.
Cultura secundária: as células cultivadas foram retiradas de uma cultura primária, elas podem ser repetidamente subcultivadas desta forma, por semanas ou meses.
Cultura de Células
-Estudos de fusão celular, na qual duas células com genótipo/fenótipo diferentes (p. ex., uma maligna e outra não-neoplásica) são fundidas em uma única;
-Produção de anticorpos monoclonais a partir da cultura in vitro de linfócitos com células de plasmocitoma (hibridoma);
-Análise citogenética a partir do cultivo de células fetais presentes no líquido amniótico para se fazerem estudos cromossômicos e diagnóstico pré-natal de doenças genéticas como, por exemplo, síndrome de Down, ou defeitos enzimáticos específicos 
HeLas: as células que dominaram o mundo
Henrietta Lacks nasceu em 1920 e morreu de câncer do colo uterino em 1951. Solteira, Henrietta foi a doadora involuntária de uma cultura de células cancerosas
Essas células passaram a ser cultivadas e utilizadas para esdudos diversos
Ate hoje as células Helas, são amplamente utilizadas para os mais diversos fins.
Estima-se que mais de 10 toneladas dessas
células já tenham sido produzidas
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Técnicas de Biologia molecular
Existem uma infinidade de técnicas que utilizam princípios de biologia molecular.
Porem quase todas elas partem do principio de 3 técnicas fundamentais
Extração de material genético
PCR
Eletroforese 
Extração de material genético
A extração de DNA é o primeiro passo para utilizá-lo em técnicas moleculares. Neste aspecto, a qualidade e qualidade do DNA são fundamentais para o sucesso nas etapas posteriores. 
Existem diferentes protocolos de extração de DNA que variam em função da espécie e do tecido a ser utilizado. 
A maneira de coletar e acondicionar o tecido, assim como o estado do mesmo são fundamentais para o sucesso da extração. Um dos aspectos importantes é que a quantidade de DNA necessária varia em função da técnica molecular a ser utilizada. 
No caso de uma reação de RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), por exemplo, são necessários somente alguns nanogramas de DNA, e para análise de RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) são necessárias quantidades de DNA na ordem de microgramas (Bered 1998). 
Extração de material genético
Normalmente os componentes da solução extratora variam de acordo com o protocolo utilizado, sendo que cada solução deve conter um tampão para estabilizar o pH, sal para dissocia as proteínas, um detergente para solubilizar as membranas e um agente inativante das DNAses cuja função é proteger o DONA genômico; 
Após a extração do material, torna-se necessário quantificar o DNA para verificara se quantidade e a ocorrência de degradação no mesmo. Entre as técnicas disponíveis para estimar a concentração de DNA, as mais utilizadas são a leitura em espectrofotômetro e a análise comparativa em gel de agarose corado com brometo de etídio. Este manual abordará somente a quantificação de DNA em gel de agarose. 
PCR
Multiplicação do material genético
Reação em cadeia da polimerase
Basicamente essa técnica é utilizada para aumentar consideravelmente as amostras de material genético facilitando seu estudo
Fundamental para dar suporte as mais diversas técnicas de biologia molecular
Principio Básico 
Principio Básico 
Eletroforese
A eletroforese é uma técnica analítica utilizada na análise de macromoléculas como proteínas e ácidos nucléicos.
Basicamente ela separa moléculas em decorrência de sua carga elétrica 
A molécula é exposta a um campo magnético negativo e outro positivo e de acordo com sua carga elétrica ela migra para o campo de afinidade
O processo é feito em uma cuba com polímero 
Utilização clinica
Detecção de proteínas
Separação de genes
Definição de Material genético 
Purificação de Substancias 
Separação de moléculas 
Atividade
1 – Como a biologia celular pode ser utilizada para diagnostico?
2 – Explique detalhadamente como ocorre o processo de fabricação de laminas histológicas.
3 – O que é cultura de células, como ela é feita e pra oque ela pode ser utilizada?
4 – Como a biologia celular pode ser utilizada para diagnostico?
5 – Comente um pouco sobre como é realizado o processo de extração do material genético
6 – O que é PCR? Explique detalhadamente como esse processo ocorre, e qual a importância do mesmo?
7 - O que é eletroforese? Explique detalhadamente como esse processo ocorre, e para que o mesmo pode ser utilizado.