ED - Técnicas histológicas e microscopia

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Universidade do Estado do Rio de Janeiro - Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes Disciplina de Métodos de Estudo da célula – Ciências Biológicas 
Professoras: Alessandra Thole e Penha Cristina Barradas
Monitora: Débora F. Alvarez
 Estudo Dirigido – Técnicas Histológicas e Microscopia
01 – Cite dois fixadores químicos e explique a importância deles na preservação dos tecidos biológicos. 
O procedimento de fixação é indispensável para a preservação da composição celular pois impede a digestão dos tecidos por enzimas presentes nas próprias células (autólise). Para a microscopia de luz, dois fixadores muito utilizados são uma solução de formaldeído 4% e o glutaraldeído. 
02 - Para uma boa observação no microscópio de luz, o material deve ser processado de forma que fique fino e translúcido. Complete as lacunas com as palavras chaves que explicam corretamente as três etapas do processamento do material. 
Palavras chaves: Clarificação – Desidratação – Xilol – Álcool – Impermeabilização – Parafina líquida. 
a) A DESIDRATAÇÃO é feita através de quantidades crescentes de ÁLCOOL. Dessa forma, o material não sofrerá com a perda de água bruscamente. 
b) A CLARIFICAÇÃO tem como objetivo deixar o material mais transparente. Ela é feita através de banhos de XILOL.
c) A IMPERMEABILIZAÇÃO é feita com banhos de PARAFINA que, aos poucos impregna na amostra, permitindo que ela se torne rígida. 
03 – Na imagem abaixo está esquematizada um tipo de coloração bicrômica. É possível observar que o corante rosa cora o citoplasma, enquanto o corante roxo é capaz de corar os núcleos. Cite os nomes dos corantes, rosa e roxo, respectivamente, e explique por que eles atuam corando estruturas diferentes nas células. 
 
Muitos corantes se comportam como substâncias de caráter ácido ou básico e tendem a fazer ligações eletrostáticas com os componentes ionizados do tecido. No caso da coloração representada, foi utilizada uma combinação dos corantes hematoxilina e eosina. A hematoxilina, um corante básico, possui afinidade pelos componentes celulares que contêm grupos ácidos em sua composição (estruturas basófilas), como o núcleo. Já a eosina, por ser um corante ácido, cora as chamadas estruturas acidófilas da célula, como o citoplasma. 
04 – Diferencie microscópio óptico de campo escuro, microscópio de contraste de fase e microscópio de fluorescência. 
No microscópio de campo escuro, a amostra aparece iluminada contra um fundo preto, o que aumenta a capacidade de resolução do instrumento. Esse microscópio é importante para a observação de material não vivo que é pouco corado com corantes ou para a análise de células vivas, ou seja, amostras que não passaram por tratamento de imobilização (fixação). O microscópio de contraste de fase utiliza um sistema de lentes que transforma as diferenças de fase dos raios luminosos, para as quais o olho humano não é sensível, em diferenças de intensidade, visivelmente perceptíveis. Possibilita o exame de tecidos e células não corados. Já no microscópio de fluorescência, a amostra é irradiada por luz de um determinado comprimento de onda e, ao serem iluminadas, as substâncias que foram marcadas com fluorocromos ou que são autofluorescentes emitem luz com um comprimento de onda mais longo, observada ao microscópio. 
05 – Sabendo que o preparado das lâminas histológicas difere de acordo com o tipo de microscópio que será utilizado para sua visualização, explique por que no processo de inclusão de uma amostra que será observada no microscópio eletrônico de transmissão, o material utilizado é o Epon ao invés da parafina.
 
Para haver boa interação entre o espécime e os elétrons, o microscópio eletrônico de transmissão utiliza cortes muito mais delgados que os do microscópio de luz (em torno de 50 a 70 nm). A amostra precisa estar suficientemente rígida ao ser seccionada, por isso é incluída em resinas plásticas (como o Epon) ao invés da parafina.