Microscopias e técnicas histológicas

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MICROSCOPIAS E TÉCNICAS HISTOLÓGICAS 
 
MÉTODOS DE ESTUDOS HISTOLÓGICOS 
O método mais utilizado em histologia e na patologia para 
análise dos tecidos ou fins diagnósticos é o preparado 
histológico permanente (lâmina histológica). 
 
 
1° ETAPA: COLETA DO MATERIAL 
Retirada de amostras biológicas de um determinado organismo. 
 Biopsia: organismo ainda está vivo. 
 Necropsia: ou mesmo post mortem – animais ou seres 
humanos. 
• Procedimento utilizado para estudo anatômico de todos os 
órgãos ou tecidos no indivíduo morto; 
 
Fins diagnósticos: o material é analisado pelo patologista – 
fornecera laudo macroscópico da peça – anatômica, como cor, 
tamanho e aparência; 
 
TIPOS DE BIÓPSIA 
A coleta da amostra depende da localização. 
 Cirúrgica: obtenção da amostra de tecido ou órgão em 
camada mais profunda da pele; 
• Incisional: remove apenas uma porção do tecido/tumor. 
• Excisional: remove todo o conteúdo tecidual/tumor. 
 
 Endoscópica: usada para órgãos ocos (estômago, 
intestino) através de tudo flexível (endoscópio) que tem na 
ponta um chip responsável por capturar as imagens; 
 
 
 Por agulha: a amostra é obtida pela punção do órgão 
(fígado, pulmão, mama), sem precisar abrir a cavidade 
natural; 
 
 
 Cirurgia ampla: a amostra corresponde a peças grandes 
(tumores) ou órgãos (mama, útero); 
 
Especime: amostra removida. 
 
2° ETAPA: FIXAÇÃO 
 Consiste na utilização de procedimento (físico ou químico) 
para imobilizar os constituintes celulares e fornecer 
maior resistência para as etapas subsequentes; 
 Retardar os efeitos post mortem do tecido, mantendo sua 
arquitetura normal – impedem a destruição das células 
por suas próprias enzimas (autólise) ou por ação 
bacteriana – manter a morfologia o mais próximo da 
situação “in vivo”, permite endurecimento do material e 
uma coloração adequada; 
 
TIPOS DE FIXADOR: 
 Física (utilizando-se o calor ou o frio). 
 Química: soluções de agentes estabilizantes ou 
desnaturantes; 
Classe de fixadores: aldeídos, oxidantes, desnaturantes, 
combinação de reagentes. 
 
Espessura da amostra: 
• Influencia na penetração do fixador no interior do tecido; 
• Amostra muito espessa – fixação lenta – autólise; 
• Redução do tamanho – clivagem; 
 
Tempo de fixação: 
• Varia de acordo com o tamanho do fragmento do tecido, e o 
tipo de fixador (respeita o tempo de cada fixador); 
• Pode variar entre 4 e 24h até 48h; 
• Recomendado: 20 vezes o volume de fixador em relação ao 
volume de fragmentos a serem fixados; 
• Após o tempo proceder a lavagem indicada para cada tipo 
de fixador; 
 
 
 
3° ETAPA: DESIDRATAÇÃO 
 Transferência do fragmento para álcool (etanol); 
 Retirar a água do interior da célula a fim de permitir a 
impregnação da peça com parafina; 
 Banhos sucessivos em álcool de teor crescente (70-110%); 
 6 banhos (1 h/banho); 
 
CLARIFICAÇÃO 
• Preparação do tecido para a incorporação da parafina; 
• Remoção do álcool por xilol (solvente orgânico); 
• O tecido torna-se semi-translúcido, quase transparente; 
• Outros agentes clareadores: toluol, clorofórmio, benzol, 
entre outros; 
• Banhos com xilol (2 banhos – 1h/banho); 
 
4° ETAPA: IMPREGNAÇÃO, INCLUSÃO 
Emblocamento em parafina. 
 Tecido é colocado em um molde coberto por parafina 
fundida a 60°C (em pequenos blocos); 
 Possibilita o corte do material; 
 Tempo: 8h; 
 
5° ETAPA: MICROTOMIA 
 Micrótomo: Obter cortes sucessivos, delgados e 
uniformes, a partir dos blocos de parafina com as peças 
incluídas; 
 Antes do corte: bloco de parafina é resfriado em uma 
placa refrigerada a fim de facilitar o corte dos tecidos; 
 Micrótomo rotativo: navalha de aço - espessura dos 
cortes varia de 1 a 60 um (micrômetros) (1 um = 0,001 
mm); 
 De um modo geral são obtidos cortes entre 5 e 7 um; 
 
 Os cortes provenientes da microtomia ficam “enrugados”; 
 São transferidos com auxilio de uma pinça ao banho de 
Maria - dobras retiradas; 
 A água – 30°C - abaixo do ponto de fusão da parafina 
utilizada; 
 
 
 
COLAGEM DO CORTE DA LÂMINA 
• “Pescados” e transferidos para uma lâmina de vidro 
previamente limpas e secas; 
• Os cortes obtidos são transferidos para estufa a 60°C, para 
evaporação da parafina; 
• Laboratório Cesmac: 2 horas; 
 
COLORAÇÃO 
 Tem a finalidade de dar contraste aos componentes dos 
tecidos, tornando-os visíveis e destacados uns dos outros; 
 O mecanismo das colorações está relacionado a dois 
fatores: 
 Os corantes; 
 Os elementos a corar. 
 
Tipos de corantes: 
• Hematoxilina: corante básico que cora componentes 
ácidos; 
Ex: cora os ácidos nucleicos presentes no núcleo das células 
– cor azul púrpura (roxa). 
• Eosina: Corante ácido que cora estruturas básicas de rosa; 
Ex: atraída pelas proteínas do citoplasma da célula. 
 
 
Coloração: Hematoxilina Eosina 
 
• Para corar peças é necessária a retirada de resíduos de 
parafina e a hidratação da peça; 
• Sequência de banhos em xilol e álcool; 
• Após a hidratação, os cortes são corados de acordo com o 
procedimento mais apropriado para a análise; 
 
MONTAGEM FINAL DA LÂMINA 
 Consiste em depositar uma gota de resina líquida sobre o 
corte que está aderido na lâmina de vidro e cobri-lo com 
uma lamínula (Balsamo do Canadá); 
 Evitar as bolhas de ar que se formam durante a colocação 
da lamínula; 
 A resina depois de seca garantirá uma lâmina permanente 
que poderão durar anos; 
 
 
 
MICROSCOPIO ÓPTICO 
 
1 = ocular 
2 = objetivas e revólver 
3 = platina 
4 = charriot 
5 = macrométrico 
6 = micrométrico 
7 = diafragma no condensador 
8 = condensador 
9 = botão do condensador 
10 = dois parafusos centralizadores do condensador 
11 = fonte de luz 
12 = controle de iluminação 
13 = diafragma de campo 
14 = dois parafusos de ajuste da lâmpada 
15 = focalizadora da lâmpada 
 
 
LEITURA EM MICROSCOPIA DE LUZ 
 Feixe de luz: localizado abaixo e é focalizado no espécime; 
 Lentes Objetivas: localizam-se num revólver móvel. A luz 
passa pelo espécime e entra em uma das lentes objetivas; 
 Revólver móvel: 4 lentes objetivas (4, 10, 40 e 100 x); 
 Lente ocular: aumenta a imagem (fator de 10): 40, 100, 400 
e 1000 x. Focaliza a imagem resultante na retina do olho; 
 Botão de macrofocalização: ajusta o foco; 
 Botão de microfocalização: ajusta o foco; 
 Condensador: concentra os raios de luz; 
 Diafragma: Regula a quantidade de luz; 
 Filtro: seleciona os raios de luz; 
 Espelho: permite que a luz passe pelo espécime; 
 
 
 
 
 
CORTES HISTOLÓGICOS: 
 
 
PROBLEMAS NA INTERPRETAÇÃO DOS CORTES 
 Distorções e artefatos causados durante o 
processamento do tecido; 
 Visualização da totalidade do tecido; 
 Duas ou três dimensões;